PLoS ONE: TM4SF1 Fremmer Gemcitabin Resistance af kræft i bugspytkirtlen In vitro og in vivo

Abstrakt

Baggrund

TM4SF1 er overudtrykt i pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) og påvirker udviklingen af ​​denne kræftform. Desuden er multilægemiddelresistens (MDR) generelt forbundet med tumor kemoresistens i bugspytkirtelkræft. Men sammenhængen mellem TM4SF1 og MDR fortsat ukendt. Denne forskning har til formål at undersøge effekten af ​​TM4SF1 på gemcitabin modstand i PDAC og udforske mulige molekylære mekanisme mellem TM4SF1 og MDR.

Metoder

udtryk for TM4SF1 blev evalueret i bugspytkirtelkræft cellelinjer og humane pancreas kanalen epitel (HPDE) cellelinjer ved kvantitativ RT-PCR. TM4SF1 siRNA transfektion blev udført ved hjælp af Hiperfect transfektion reagens til at vælte TM4SF1. Transkripterne analyseredes ved kvantitativ RT-PCR, RT-PCR og western blotting til yderligere undersøgelse. Den celledeling og apoptose blev opnået at undersøge følsomheden over for gemcitabin af bugspytkirtelkræftceller efter lyddæmpende TM4SF1

in vitro

. Vi viste, at cellesignalering af TM4SF1 medieret kemoresistens i cancerceller ved at vurdere ekspressionen af ​​multiresistens (MDR) gener ved anvendelse kvantitativ RT-PCR.

In vivo

, vi brugte ortotopisk pancreas tumor modeller til at undersøge effekten af ​​spredning efter silencing TM4SF1 af en lentivirus-medieret shRNA i MIA PaCa-2-cellelinjer.

Resultater

mRNA ekspressionen af ​​TM4SF1 var højere i syv bugspytkirtelkræft cellelinjer end i Æske med HDPE-cellelinjer. I tre gemcitabin sensitive cellelinjer (L3.6pl, BxPC-3, SU86.86), ekspressionen af ​​TM4SF1 var lavere end i fire gemcitabin resistente cellelinier (MIA Paca-2, Panc-1, Hs766T, AsPC- 1). Vi evaluerede at TM4SF1 var en formodet mål for gemcitabin modstand i bugspytkirtelkræftceller. Brug AsPC-1, MIA PaCa-2 og PANC-1, undersøgte vi, at TM4SF1 tavshed påvirkede celledeling og øget de procentdele af celle apoptose medieret af behandling med gemcitabin sammenlignet med celler, som blev behandlet med negativ kontrol. Denne modstand var associeret med ekspressionen af ​​multilægemiddelresistens gener herunder ABCB1 og ABCC1.

In vivo

, nedregulering af TM4SF1 i MIA PaCa-2 cellelinjer øget effektiviteten af ​​gemcitabin-baserede behandling i ortotopisk pancreas tumor-modeller evalueret ved brug noninvasive bioluminiscerende billeddannelse.

Konklusion

Disse resultater tyder på, at TM4SF1 er en overflade membran-antigen, der er stærkt udtrykt i bugspytkirtelkræftceller og øger kemoresistens til gemcitabin. Således kan TM4SF1 være en lovende mål at overvinde kemoresistens af pancreascancer

Henvisning:. Cao J., Yang J, Ramachandran V, Arumugam T, Deng D, Li Z, et al. (2015) TM4SF1 Fremmer Gemcitabin Resistance af kræft i bugspytkirtlen

In Vitro

In Vivo

. PLoS ONE 10 (12): e0144969. doi: 10,1371 /journal.pone.0144969

Redaktør: James Freeman, University of Texas Health Science Ctr, UNITED STATES

Modtaget: 26 august, 2015; Accepteret: November 25, 2015; Udgivet: December 28, 2015

Copyright: © 2015 Cao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af NIH-DK05207 (til CD Logsdon), Cancer center Support Core tilskud CA016672 (til UT MD Anderson Cancer center), den Lockton Endowment (til CD Logsdon), og National Natural Science Foundation of China, 81.301.826 (til Jia Cao)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den mest aggressive menneske malignitet med en høj dødelighed [1]. Den gennemsnitlige 5-års overlevelsesraten for patienter diagnosticeret med PDAC er 7,1%, og den mediane overlevelse varighed er kortere end 6 måneder [2, 3]. Siden mangler af tidlige specifikke symptomer, er de fleste patienter diagnosticeret i sene stadier. Kemoterapi bruger gemcitabin betragtes som et første-line behandling for lokalt fremskreden og metastatisk bugspytkirtelkræft at forlænge overlevelsestiden og forbedre kvaliteten af ​​patienternes liv [4]. den høje resistens over for gemcitabin aftager imidlertid antitumoreffektiviteten [5]. Således er der stadig et presserende behov for effektive kemoterapeutiske metoder til at forbedre resultatet for denne kræftform.

multiresistens (MDR) er kendetegnet ved krydsresistens over for kemoterapeutiske medikamenter med target sites [6]. De store mekanismer gemcitabin kemoresistens er relateret med narkotika optagelse, metabolisme og handling [4]. En af de mest almindelige årsager til at resultere i MDR i cancerceller er via overekspression af adenin trifosfat (ATP) -bindende kassette (ABC) transportører. Disse transportere bidrager til MDR ved at inducere antiapoptotisk maskiner, forøgelse af den intracellulære drug efflux og mindske medikamentkoncentrationer [7]. For nylig har undersøgelser vist, at gemcitabin resistens i bugspytkirtelkræftceller er associeret med ekspressionen af ​​MDR [8,9]. Derfor er det vigtigt at inhibere disse transportere at genoprette følsomhed over for kemoterapeutiske modstand i bugspytkirtelkræft.

TM4SF1 er medlem af de fire-transmembrane-domæne familie med en tetraspanin topologi og sekvenshomologi med IL-TMP, TM4SF5, L6D, OCTM4, og TCCE518. Ekspressionsniveauerne af TM4SF1 øges i forskellige humane epiteliale carcinomer, herunder lunge-, bryst-, tyktarms-, ovarie-, prostata- og nyrecarcinomer [10-12]. Det spiller en kritisk rolle i reguleringen af ​​tumor angiogenese, motilitet, migration og invasion [13, 14]. Vigtigere, nylig undersøgelse har vist, at TM4SF1-targeting Antibody Drug Konjugater repræsenterer en lovende terapeutisk middel mod tumorceller og tumorvaskulaturen [15]. Således er målet med denne undersøgelse var at undersøge, om TM4SF1-overekspression bugspytkirtelkræft cellelinjer inddrager i gemcitabin modstand og at afgrænse mekanismen.

I den foreliggende undersøgelse, vi søgte at afgøre, om TM4SF1 kunne give kræft i bugspytkirtlen med evnen til at gemcitabin resistance.We fandt, at TM4SF1 var stærkt udtrykt i gemcitabin-modstand bugspytkirtelkræft cellelinjer. Silencing af TM4SF1 øgede gemcitabin følsomhed kemoterapi celler og faldt udtryk for ABCB1 og ABCC1

in vitro

.

In vivo

, celler mangler TM4SF1 havde reduceret bugspytkirtlen tumor vækst og øget lydhørhed over for behandlinger med gemcitabin. Disse resultater tyder på, at TM4SF1 bør undersøges yderligere som et potentielt mål for kræft i bugspytkirtlen terapi.

Materialer og metoder

Narkotika og reagenser

Gemcitabin blev købt fra Eli Lilly and Co (Indianapolis, IN). Alle reagenser blev leveret af Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), medmindre andet er angivet nedenfor.

bugspytkirtelkræft cellelinjer og dyrkningsbetingelser

menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinjer HS766T, MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1, BxPC-3, L3.6PL og SU.86.86 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). BxPC-3 og AsPC-1-celler blev rutinemæssigt dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum i en 37 ° C inkubator i en fugtig atmosfære af 5% CO2, hvorimod alle andre pancreatiske cancercellelinier voksede i Dulbeccos modificerede Eagles medium, Menneskelig pancreas kanalen epitel (Æske med HDPE) celler [16], som Dr. Tsao (University of Toronto) blev dyrket i keratinocyt serum-frit medium. De cellelinier blev opnået fra ATCC og blev bekræftet af kort tandem repeat profilering og passeret i vores laboratorium for færre end 6 måneder efter modtagelsen eller genoplivning.

Kvantitativ realtid revers transkription PCR-analyse

totalt RNA blev isoleret fra pancreas cancer cellelinjer og HDPE, og kvaliteten af ​​RNA blev bestemt som tidligere [17] beskrevne. RNA blev anvendt til kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion analyse. Real-time kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion blev udført med SYBR green som tagget ved anvendelse af en iCycler. (Bio-Rad) .Sequence af primerne er til rådighed efter anmodning

Reverse transskription PCR-analyse

PCR blev udført ved hjælp af en PCR Kit (Promega) med følgende forstærkning program:. Præ- denaturering i 3 min ved 94 ° C, denaturering i 30 sekunder ved 94 ° C, annealing i 30 sek ved 60 ° C, forlængelse i 30 sekunder ved 72 ° C, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. PCR blev udført i 30 cykler. Efter PCR blev 5 pi PCR-produkter kørt på en 1% agarosegel og visualiseret ved relativ pixel densitometri.

Transient transfektion af små interfererende RNA

AsPC-1, MIA PaCa-2, og PANC-1-celler blev udpladet på 100 mm skåle og transient transficeret med kontrol lille interfererende RNA (siRNA [siControl]) og TM4SF1 siRNA (siTM4SF1) ved slutkoncentrationer på 10 nmol /l med Hiperfect transfektionsreagens (QIAGEN). SiRNA-sekvensen målretning TM4SF1 var AAGGACCACTATGTCTTGATT. mRNA’er blev isoleret fra AsPC-1, MIA Paca-2, og Panc-1-celler til kvantitativ RT-PCR efter 48 timer.

Western blotting-analyse

Protein blev ekstraheret med RIPA-buffer suppleret med 1% PMSF i 30 minutter. Hver ekstrakt indeholdende 50ug protein blev separeret med 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranerne blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk i 3 timer og derefter inkuberet med kanin anti-TM4SF1 (ABCAM, 1: 1000 fortynding) ved 4 ° C natten over. Membraner blev inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG-antistof i 2 timer ved stuetemperatur. Blots blev detekteret ved anvendelse af ECL (Millipore) og eksponeret for røntgenfilm at visualisere billederne.

udvikling af stabile korte hårnål RNA-udtrykkende cellelinjer

Silencing af TM4SF1 i bugspytkirtelkræft celle linjer blev opnået under anvendelse lentiviral infektion. Lentivirale plasmidvektorer indeholdende-kontrol og TM4SF1 korte hårnål RNA (shRNA; Open Biosystems) blev co-transficeret med pakkevektorer og lentivirus blev produceret i 293T celler via calciumphosphat-transfektion som beskrevet tidligere [17] .TM4SF1 shRNA-holdige vektorer blev titreret, og MIA PaCa-2 blev inficeret med 25 pi af viral supernatant /per milliliter medium blandet med polybren (4 ug /ml medium). Celler blev derefter udvalgt efter deres modstand mod puromycin (1-3 ug /ml). Stabil bugspytkirtelkræft cellelinje blev udviklet derefter.

spredning assay

Vi brugte MTS analysen at undersøge virkningerne af gemcitabin efter tavshed TM4SF1 om spredning af AsPC-1, Mia PaCa-2 og PANC -1 cellelinier. Celler, der vokser på en 6-brønds plade blev behandlet med kontrol siRNA eller siTM4SF1. 24 timer efter transfektion blev celler opsamlet og 1500 celler blev udpladet i plader med 96 brønde. Efter celler blev behandlet med gemcitabin i 48 timer, blev 15 pi MTS-opløsning tilsat til hver brønd, inkuberet ved 37 ° C i 2 timer. Celletal blev estimeret ved hjælp af den fotometriske læsning, som beskrevet tidligere [18,19].

Apoptose undersøgelse med fluorescens-aktiveret celle sortering analyse

in vitro

I tidligere undersøgelse fandt vi bugspytkirtlen kræftceller aSPC-1, MIA PACA-2 og Panc-1 var resistente over for gemcitabin

in vitro

[19]. Standard propidiumiodidfarvning af pancreascancer celler under anvendelse af hypotonisk lyse metode blev anvendt til apoptose studier med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). AsPC-1, MIA PaCa-2 og PANC-1-celler transient transficeret med siControl eller siTM4SF1 i 24 timer blev podet i seks-brønds plader. Apoptose blev induceret i cellerne ved at behandle dem med gemcitabin (1, 5 eller 10 pmol /l) i 48 eller 72 timer. Cellerne blev derefter opsamlet via trypsinisering, fikseret med 70% kold ethanol, blandet med 500 pi af en hypotonisk opløsning (0,1% natriumcitrat, 0,1% Triton X-100, 20 pg /ml RNase og 50 pg /ml propidiumiodid) , inkuberet i 30 minutter og analyseret via flowcytometri under anvendelse af et EPICS-XO-systemet (Beckman Coulter). Celler undergår apoptose grund DNA fragmentering blev påvist som populationen af ​​celler med sub-G1 DNA-indholdet.

Dyr og Tumorvækst undersøgelse

in vivo

Denne undersøgelse blev gennemført i nøje overensstemmelse med retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra National Institutes of Health. Brugen af ​​mus blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for MD Anderson Cancer Center.

MIA PaCa-2-celler blev ændret til stabilt udtrykke en ildflue luciferase gen via lentiviral transfektion [20]. Den tumorigen evne TM4SF1 shRNA-lyddæmpede celler blev sammenlignet med virkningen af ​​kontrol shRNA-transficerede celler i ortotopisk pankreatiske tumorer, der er dannet i 5 uger gamle mandlige athymiske nøgne nu /nu mus. 28 nude nu /nu mus blev inddelt i fire grupper (gruppe 1, shCtrl, gruppe 2, shCtrl + GEM, gruppe 3, shTM4SF1, gruppe 4, shTM4SF1 + GEM). Alle dyr fik sterilt mad og autoklaveret vand på en daglig 12-timers lys /12-timers mørke-cyklus. MIA PaCa-2-celler blev stabilt transficeret med shTM4SF1 eller kontrol shRNA. Disse celler derefter voksede til 80% konfluens, og blev høstet via trypsinisering, vasket en gang i PBS og resuspenderet til en slutkoncentration på 5 x 10

6 celler /ml. Cellesuspensioner (50 pi hver) blev injiceret i bugspytkirtler fra syv mus pr testgruppe. Efter en uge blev disse mus behandlet med eller uden gemcitabin (100 mg /kg legemsvægt). Tumorvækst blev vurderet ved anvendelse bioluminescerende billeddannelse og overlevelsen af ​​dyr blev registreret. Musene blev overvåget hver uge for eventuelle symptomer og tegn. Efter 7 uger, to mus havde tegn på dyspnø og unormal bevægelse og en af ​​tumorerne blev overskredet 15% kropsmasse. Alle mus blev aflivet i isofluran anæstesi efterfulgt af cervikal dislokation, og hver mus bugspytkirtel blev fjernet. Også blev tumorer vejet.

Den selvlysende billeddannelse blev udført ved hjælp af et kryogent kølet imaging-system kombineret med en dataopsamling computer, der kører den levende billede software program (Xenogen). Før billeddannelse blev dyrene bedøvet i en akryl kammer med en /luftblanding 1,5% isofluran og injiceret intraperitonealt med 15 mg /ml Luciferin kaliumsalt i PBS ved en koncentration på 150 mg /kg legemsvægt. Digital graysclae dyr billeder blev erhvervet, som blev efterfulgt af køb og overlejring af et pseudo-billede, som repræsenterer den rumlige fordeling af detekterede fotoner nye fra aktiv luciferase i hvert dyr. Signal intensitet blev kvantificeret som summen af ​​alle registrerede fotoner inden for området af interesse per sekund.

Cell spredning undersøgelse ved hjælp af en prolifererende cellekerneantigen assay

in vivo

Analyse af pancreascancer celleproliferation i tumorvæv blev udført under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt prolifererende cellekerneantigen (PCNA) kit (Jackson ImmunoResearch) som beskrevet detaljeret tidligere [21]. Paraffinindlejrede sektioner af tumorvæv behandlet med og uden gemcitabin blev analyseret for proliferation. Immunhistokemiske pletter af sektionerne blev analyseret under anvendelse af et Olympus mikroskop. Billeder af sektionerne blev taget med et kølet charge-coupled device-kamera (Photometrics) og Smart Capture software program (Digital Scientific). For at kvantificere spredning begivenheder blev farvningsresultater evalueret af en patologisk videnskabsmand (Dr. Henry Wang).

Statistisk analyse

Alle

i blev udført vitro

eksperimenter i tre eksemplarer og gennemført tre eller flere gange. Data er præsenteret som midlet fra uafhængige eksperimenter (± standardfejl [SE]). Statistisk signifikante forskelle blev bestemt ved anvendelse af Kruskal-Wallis eller to-halet uparret Student t-test, Dunnett multiple sammenligningstest og Mann-Whitney U test. P-niveauer mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

TM4SF1 er stærkt udtrykt i bugspytkirtelkræft cellelinjer

I tidligere profilering undersøgelser blev TM4SF1 mRNA-ekspression forhøjet i bugspytkirtlen tumorer og cancer cellelinjer [22]. Og undersøgelsen viste, at fire cellelinier (BxPC-3, SU86.86, CFPAC-1, L3.6pl) var følsomme og fem cellelinier (Panc-1, Hs766T, MIA Paca-2, ASPC-1, Mpanc96) var modstandsdygtig over for gemcitabin baseret på 50% vækstinhibering [19]. Vi yderligere undersøgt TM4SF1 mRNA-ekspression i syv bugspytkirtelkræft cellelinjer og Æske med HDPE celler. Kvantitativ RT-PCR-analyse viste, at alle bugspytkirtelkræft cellelinier udtrykt af TM4SF1 i et større omfang end gjorde de ikke-transformerede Æske med HDPE-celler. MRNA ekspressionen af ​​TM4SF1 i fire gemcitabin følsomme cellelinjer (MIA Paca-2, Panc-1, Hs766T, AsPC-1) var højere end i tre gemcitabin-resistente cellelinier (L3.6pl, BxPC-3, SU86. 86) (figur 1).

Kvantitativ RT-PCR-analyse resulterede vedrørende ekspression af TM4SF1 mRNA i human pancreascancer celle lines.TM4SF1 mRNA blev mere stærkt udtrykt i cancercellelinier end i Æske med HDPE-celler. MRNA ekspressionen af ​​TM4SF1 var lavere i tre gemcitabin følsomme cellelinjer (L3.6pl, BxPC-3, SU86.86) end at der i fire gemcitabin-resistente cellelinier (MIA Paca-2, Panc-1, Hs766T, AsPC- 1).

TM4SF1 lyddæmpning øger følsomheden af ​​gemcitabin

for at undersøge den funktionelle rolle TM4SF1 i bugspytkirtelkræftceller, vi forbigående transficeret AsPC-1, MIA PaCa-2, og PANC-1-celler med siControl og siTM4SF1 og bekræftet nedregulering af TM4SF1 i cellerne under anvendelse af kvantitativ RT-PCR, RT-PCR og western blotting (fig 2A og S1 fig) .For at vurdere virkningerne af TM4SF1 på celleoverlevelse og modstandsdygtighed over for kemoterapi, vi behandlet MIA PaCa-2, PANC-1 og AsPC-1-celler, som alle udtrykker høje niveauer af TM4SF1 indbygget, med forskellige koncentrationer af gemcitabin i nærvær af enten siControl eller siTM4SF1. MTS assay Resultaterne viste, at proliferation kapacitet var lavere i siTM4SF1 celler end i siControl celler efter behandling med gemcitabin (figur 2B). Også inaktivering af TM4SF1 steg den apoptotiske respons på behandling med gemcitabin med tidligere koncentration (1, 5 eller 10μmol /L) i alle tre cellelinier [19] (fig 2C).

(A) Kvantitativ RT- PCR og western blotting viste undertrykkelse af TM4SF1 i AsPC-1, MIA PaCa-2 og PANC-1 cellelinjer. Cellelinierne blev transient transficeret med siControl eller siTM4SF1, og mRNA blev isoleret fra dem efter 48 timer og protein blev isoleret efter 72 timer. (B) AsPC-1, PANC-1 og MIA PaCa-2-celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af gemcitabin, hhv. Resultaterne af MTS-assay viste, at proliferation evne siTM4SF1 celler var lavere end den for siControl celler efter behandling med gemcitabin. (C) Efter 72 timer blev procentdelen af ​​celler med sub-G0 /G1 DNA-indhold identificeret via FACS. TM4SF1 lyddæmpning resulterede i øget følsomhed af cellerne for behandling med gemcitabin, hvilket resulterer i øget apoptose satser. (Kolonner, midler til tre eksperimenter,. Barer, standardafvigelse * P. 0,05 versus kontrol).

TM4SF1 regulerer ekspressionen af ​​multiresistens gener i bugspytkirtelkræftceller

in vitro

multiresistens (MDR) gener bidrager til gemcitabin følsomhed i bugspytkirtelkræftceller. Den ABCB1, ABCC1, ABCC3 og ABCC5 er velkarakteriserede MDR gener. I AsPC-1, MIA PaCa-2 og PANC-1 cellelinjer, mRNA udtryk for ABCB1 og ABCC1 blev faldt betydeligt efter lyddæmpende TM4SF1 hjælp kvantitativ RT-PCR (figur 3).

Kvantitativ RT-PCR-data viser fold ændringer i mRNA niveau af ABCB1 og ABCC1 gener efter lyddæmpende TM4SF1 i AsPC-1, MIA PaCa-2 og PANC-1 cellelinjer.

TM4SF1 lyddæmpning øger følsomheden af ​​bugspytkirtelkræftceller til gemcitabin-induceret vækst

in vivo

for yderligere at analysere indflydelsen af ​​TM4SF1

in vivo

, vi transficeret MIA PaCa-2, som har relativt høje niveauer af endogen TM4SF1 udtryk med shRNA konstruktioner til stabilt reducere TM4SF1 ekspression. Vi verificerede shRNA lyddæmpning ved brug af kvantitativ RT-PCR og western blotting og bemærkede, at TM4SF1 mRNA-ekspression faldt med mere end 80% med shTM4SF1 # 1 (Fig 4A). Dernæst analyserede vi virkningerne af stabilt tavshed TM4SF1 på pancreas tumorer udviklet i svækket immunforsvar mus. Orthotopisk tumorer blev fremkaldt med MIA PaCa-2-celler, der stabilt udtrykker shControl eller shTM4SF1 og blev overvåget ved anvendelse af noninvasive bioluminescerende billeddannelse. Celler, der mangler TM4SF1 udviklet tumorer i samme grad som kontroller. Imidlertid gemcitabin havde næsten ingen virkning på shControl-transficerede grupper af disse meget gemcitabin-resistente celler, men efter silencing TM4SF1 i disse celler, gemcitabin-baseret behandling resulterede i markant lavere tumorvolumener (Fig 4B). Støtte til sensibilisering af MIA PaCa-2 celler til behandling med gemcitabin ved tavshed af TM4SF1, PCNA analyse (Fig 4C) indikerede markant lavere spredning af væv med tavshed TM4SF1 og behandles med gemcitabin end alle andre væv (tabel 1).

Kvantitativ RT-PCR og western blotting viste undertrykkelse af TM4SF1 i MIA PaCa-2 stabilt transficeret med shControl eller shTM4SF1. (B) Tumorer induceret af MIA PaCa-2-celler, der stabilt udtrykker shControl eller shTM4SF1 og udtrykker luciferasegenet udviklet i nøgne mus. Ved slutningen af ​​eksperimentet blev dyrene analyseret under anvendelse bioluminescerende billeddannelse. Lodder af tumorer induceret af MIA PaCa-2 celler stabilt udtrykker shRNA med eller uden gemcitabin (100 mg /kg) behandling i nude mice.The tumorvægte (g), i shCtrl, shCtrl + GEM, shTM4SF1 og shTM4SF1 + GEM var 0,934 ± 0,132, 0,792 ± 0,101, 0,750 ± 0,149 og 0,398 ± 0,080. TM4SF1 silencing ved gemcitabin resulterede i vægte markant lavere tumor end i kontrolmusene (* P 0,05). (C)

In vivo

proliferation blev målt ved PCNA assay på paraffinsnit fra shControl og shTM4SF1 dyr behandlet med gemcitabin. Et repræsentativt billede ved en forstørrelse på × 200 indikerer celledeling vises.

Diskussion

Både metastaser og kemoresistens var forbundet med reduceret overlevelse af kræftpatienter. Undersøgelser undersøgt at TM4SF1 som tetraspanin gennemkører membranen kan være forbundet med den tetraspanin beriget microdomanin (TERM) på plasmamembranen, spille roller i organiseringen af ​​integritet membranreceptorer herunder integriner at påvirke celleadhæsion, migrering og metastase. TM4SF1 blev også placeret på intracellulære vesikler og blev målrettet til sent endocytiske organeller gennem en biosyntesevejen at påvirke cellemotilitet [13, 23]. L6 antistof-baserede immunterapi opnåede partiel remission hos patienter med metastatisk brystkræft. Adskillige undersøgelser viste, at TM4SF1 blev overudtrykt i humane tumorceller vaskulære endotelceller og TM4SF1-antistof blev selektivt målrettet mod tumor blodkarrenes endothelceller og tumorceller med ringe toksicitet. TM4SF1 påvirkede vaskulær modning og interageret med integriner at fremkalde endotel migration celler og celle-celle-interaktioner [24-27]. Jaminet gruppe undersøgte, kan forventes nye fremgangsmåder til fælles antistoffer, såsom 8G4 med cytotoksiske lægemidler til behandling med tumor og tumor angiogenese [28]. Den tidligere forskning afslørede, at TM4SF1 var involveret i udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen og hæmmede celler migration og invasion [29, 30]. Men det var uvist, om TM4SF1 bidraget til kemoresistens af gemcitabin i PDAC.

Derfor fokuserede vi på den rolle, TM4SF1 i pancreas adenocarcinom ved at observere effekten af ​​tavshed dette gen på det kemoterapeutiske middel

in vitro

in vivo

. I vores undersøgelse, vi gav bevis for, at TM4SF1 var mere højt udtrykt i pancreas cellelinjer end i normalt bugspytkirtlen epitelial (Æske med HDPE) celler og gemcitabin resistens i bugspytkirtelkræftceller kan skyldes udtryk for TM4SF1. Silencing TM4SF1 faldt celleproliferationen kapacitet, forstærkede apoptose celler og delvist vendt kemoresistens af gemcitabin i AsPC-1, MIA Paca-2, og PANC-1 cellelinier. Tidligere arbejde undersøgt at kemoresistens i bugspytkirtelkræftceller var via regulere udtryk for MDR-gener, herunder ABCB1, ABCC1, ABCC3 og ABCC5 [9]. Så evaluerede vi, om TM4SF1 inducerede udtrykkene for MDR gener for at påvirke gemcitabin følsomhed i bugspytkirtelkræftceller. Efter tavshed TM4SF1, udtrykkene for to ABC transportører (ABCB1, ABCC1) gener faldt betydeligt i AsPC-1, MIA PaCa-2, og PANC-1 celler, som bevis for, at TM4SF1 kan være korreleret med MDR-gener til at regulere gemcitabin modstand.

In vivo

blev ortotopisk tumorer udvikles med MIA PaCa-2 celler, der udtrykker shControl eller shTM4SF1 i svækket immunforsvar mus, som blev overvåget ved hjælp af noninvasive bioluminiscerende billeddannelse. Vi fandt, at silencing TM4SF1 kunne forbedre følsomheden af ​​MIA PaCa-2-celler til gemcitabin-induceret vækst. Viste også PCNA analyse, spredning af væv med både tavshed TM4SF1 og behandles med gemcitabin var lavere end for alle andre væv. Disse resultater antydede, at TM4SF1 kunne være en potentiel kemoresistens mål for kræft i bugspytkirtlen.

Her har vi først fremlagt beviser, at TM4SF1 medieret gemcitabin modstand via regulering af MDR-gener udtryk. Undersøgelser vist, at MDR-gener induceret cancerceller til at erhverve kemoresistens via påvirke udstrømningen af ​​anticancerlægemidler af celler og faldende intracellulære medikamentkoncentrationer [31]. Derfor bør der gøres en større indsats for at overvinde MDR og at undersøge nye molekylære behandlingsformer såsom genterapi. I kræft i bugspytkirtlen, viste undersøgelser, at MDR proteiner ofte blev udtrykt og påvirkede kemoterapi følsomhed og gavn hos patienter med fremskreden kræft i bugspytkirtlen [32-34]. En anden forskning foreslog, at gefitinib vendt ekspressionen af ​​MDR og restaureret kemosensitivitet af resistens hos BxPC-3 cellelinier via RAF1 /ERK signalvej [35]. MUC1 var en membranbundet glycoprotein, som overudtrykkes i PDAC at øge kemoresistens af gemcitabin og etoposid. I mekanisme, MUC1 inducerede ekspressionen af ​​ABCC1 via en AKT-uafhængig signalering og især det var direkte relateret til promotorregionen af ​​ABCC1 genet, hvilket indikerer, at MUC1 kan virke som en transkriptionel regulator [9] Længere reguleringsmekanisme af TM4SF1 og MDR kunne studeres på resistens over for kemoterapeutiske lægemidler i PDAC.

Desuden TM4SF5, et andet medlem af fire-transmembrane domæner familie, blev observeret at være stærkt udtrykt i humane leverkræft væv og celler. Studier i at kræft foreslog, at TM4SF5 kan øge p27

Kip1 udtryk og phosphorylering og føre til epitel-mesenkymale overgang (EMT) at mægle tumorgenese, metastase og gefitinib modstand [36-39]. Yderligere undersøgelser vil være forpligtet til at forstå forholdet mellem de forskellige medlemmer af de fire-transmembrane domæner familie.

Som konklusion, vores undersøgelse beskrevet, at lyddæmpning af TM4SF1 sensibiliserede bugspytkirtelkræftceller via nedregulering ABCB1 og ABCC1 at dræbe ved behandling med gemcitabin kan være af særlig translationel betydning. Disse data antydede, at nedregulering af TM4SF1 ekspression kan være af klinisk fordel i bugspytkirtelkræft behandling. Fremtidige bestræbelser bør afsættes til at forstå de mekanismer og involverede veje i virkningerne af TM4SF1 udtryk på kemoresistens af kræft i bugspytkirtlen.

Støtte Information

S1 Fig. RT-PCR-analyse resultater, som viser inaktivering af TM4SF1 i AsPC-1, MIA PaCa-2 og PANC-1 cellelinier.

Cellelinier blev transient transficeret med siControl eller siTM4SF1, og mRNA blev isoleret fra dem efter 48 timer.

doi: 10,1371 /journal.pone.0144969.s001

(PDF)