PLoS ONE: Serum Opløselig HLA-E i melanom: en ny potentiel immun-relaterede Marker i Cancer

Abstrakt

Baggrund

Tumor-afledte opløselige faktorer, herunder opløselige HLA-molekyler, kan bidrage til kræft immun flugt og derfor indvirkning på kliniske forløb af maligne sygdomme. Vi har tidligere rapporteret, at melanomceller producerer,

in vitro

, opløselige former af det ikke-klassisk MHC klasse I molekylet HLA-E (sHLA-E). For at undersøge sHLA-E produktion ved forskellige tumorer og behandle dens potentielle værdi som en tumor-associeret markør, vi udviklet en specifik ELISA til kvantificering af sHLA-E i biologiske væsker.

Metode /vigtigste resultater

vi udviklede en sHLA-E specifik og følsom ELISA og vi viste, at serum sHLA-E niveauer blev signifikant forhøjet (P 0,01) i melanom patienter (n = 127) sammenlignet med raske donorer (n = 94 ). sHLA-E blev også påvist i kultursupernatanter fra en lang række tumorcellelinjer (n = 98), herunder melanomer, nyre, tyktarms- og brystkræft. Cytokiner regulering af sHLA-E produktion af tumorceller blev også udført. IFN-γ, IFN-α og TNF-α viste sig at opregulere sHLA-E produktion ved tumorceller.

Konklusioner /Signifikans

I betragtning af den brede tumorvæv frigivelse af HLA-E og dens opregulering af inflammatoriske cytokiner, sHLA-E bør studeres for sin deltagelse i immunreaktioner mod tumorer. Interessant nok vores resultater viste en positiv sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​serum sHLA-E og melanom. Derfor bestemmelsen af ​​sHLA-E niveau ved hjælp af ELISA metode, kan undersøges som en klinisk markør hos kræftpatienter

Henvisning:. Allard M, Oger R, Vignard V, Percier JM, Fregni G, Périer A et al. (2011) Serum Opløselig HLA-E i melanom: en ny potentiel immun-relaterede Marker i Cancer. PLoS ONE 6 (6): e21118. doi: 10,1371 /journal.pone.0021118

Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxembourg

Modtaget: May 10, 2011; Accepteret: 19 maj 2011; Udgivet den 21. juni, 2011

Copyright: © 2011 Allard et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den “Ligue Nationale contre le Cancer” (labellisation 2007). Den bidragyder har ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Beviser akkumuleret demonstrere evnen af ​​immunsystemet til at identificere og ødelægge maligne celler, for at forhindre tumorudvikling. Denne proces kaldes kræft immunosurveillance, er baseret på den sammenføjede virkning af effektorer af medfødte (NK, NKT-celler, γδ T-celler og dendritiske celler) og adaptiv (antigen-specifikke T- og B-celler) immunitet at sanse og udrydde spirende-transformerede celler. Men på trods af veldefinerede immunogene tumorantigener, og selv i tilstedeværelse af tumor-antigen-specifikke cytotoksiske T-celler, immunsystemet synes ikke at være fuldt ud effektive udrydde tumorer [1].

Flere mekanismer er blevet impliceret i tumor immune flugt, herunder strukturelle og funktionelle ændringer af human leukocyt-antigener (HLA), som repræsenterer de mange arrangementer i kræft. Dette omfatter klassiske HLA klasse I-antigen (HLA-A, -B, -C) tab eller nedregulering og afvigende ekspression af ikke-klassiske HLA klasse I-antigener (HLA-E, -G), tilvejebringelse mekanismer, der fører til et fald i anerkendelse og ødelæggelse af tumorceller ved immune cytotoksiske effektorer (især CTL og NK-celler) [2]. Interessen for ikke-klassiske HLA-molekyler er blevet stimuleret af påvisningen af, at de kan bidrage til NK og T-celle tumor celle undslippe gennem deres interaktion med NK-inhibitoriske receptorer [3] – [6]. Endvidere produktion af ikke-cellebundet opløselige HLA (sHLA) molekyler er også blevet beskrevet og kan repræsentere en alternativ strategi for cancer immune escape [7], [8]. Til støtte for denne hypotese er sHLA molekyler vist sig at inducere

in vitro

hæmning og /eller apoptose af CTL og NK [9], [10]. Endvidere har forhøjede serumniveauer af klassisk og ikke-klassisk sHLA blevet beskrevet i adskillige ondartede sygdomme, og deres prognostiske relevans antydes af statistisk signifikant association med høj stadie sygdom eller med særlig kliniske forløb i forskellige maligniteter [11].

Vi har tidligere observeret i samarbejde med patologer, en hyppig udtryk for HLA-E ved melanomer og coloncarcinomer [12]. Undersøgelser fra vores gruppe og andre støttede en immunsuppressiv potentiale af denne ekspression, gennem indgreb af CD94 /NKG2A inhiberende NKR på cytotoksiske celler (NK og CD8 TIL) ved tumorcellemembranen HLA-E [13] – [16]. Vi rapporterede også, at melanomcellelinjer kan producere opløselige former af HLA-E (sHLA-E)

in vitro

, ved protease afhængig afgivelse af overflademolekyler, og at denne produktion blev øget med IFN-γ [12] .

Formålet med nærværende projekt var at udvikle et ELISA-assay til påvisning og kvantificering af sHLA-E i biologiske væsker, for at validere sin specificitet og, hvis passende, for at løse den kliniske betydning af sHLA- E i blodet af melanom patienter.

Resultater

Udvikling af en HLA-E specifik ELISA

for at detektere og kvantificere sHLA-E i biologiske prøver, vi udvikler et sandwich-ELISA ved hjælp noncompeting solid opsamling og biotinyleret påvisning anti-HLA-E monoklonale antistoffer MEM-E /08 og MEM-E /07 hhv. Først et koncentrationsområde på en renset rekombinant opløselig HLA-E (rsHLA-E) blev testet. En vist i figur 1A, blev rsHLA-E detekteres ved en koncentration på 5 pg /ml minimum. I betragtning af den rapporterede krydsreaktivitet af både anti-HLA-E Abs med fire HLA klasse Ia allele former: HLA-A23, -B7, -B8 og -B27, derefter kontrolleres vi deres opdagelse ved hjælp af vores designet ELISA-assay. Blandt rekombinant opløselig HLA-A23, -B7, -B8 og -B27 samt rsHLA-A2 anvendt som negativ kontrol, blev kun et svagt signal opnået med rsHLA-B7 ved den maksimale dosis 20 ng /ml (fig. 1B).

A /Påvisning af sHLA-E ved hjælp serielle fortyndinger af rekombinant HLA-E monomer. Det grå område angiver det område af målbare sHLA-E-niveauer. B /Bestemmelse af HLA-E bindingsspecificitet. Serielle fortyndinger af HLA-A2, -A23, -B7, -B8 og -B27 rekombinante opløselige monomerer er blevet testet i sammenligning med rekombinant HLA-E-monomer.

Disse resultater førte til den konklusion, at sandwich-ELISA beskrevet her er meget specifikke og følsomme for HLA-E og kan anvendes som en screeningsmetode til påvisning af sHLA-E i biologiske prøver.

Øget opløseligt HLA-E i sera fra melanomapatienter

Vi screenede sera fra 94 raske donorer og 127 melanompatienter uden aktuel behandling for tilstedeværelsen af ​​sHLA-E (tabel 1). Vi har detekteret sHLA-E i serumprøver fra både raske og patient donorer i en fortynding-afhængig måde (fig. 2A), der påviser, at denne ELISA kunne anvendes til at kvantificere sHLA-E i serumprøver. I betragtning af den mulige forekomst af alder og køn, blev der ikke observeret nogen signifikante forskelle i sHLA-E-niveauer (data ikke vist). De enkelte værdier af serum sHLA-E præsenteres på en dot-plot ved hjælp af en log skala (fig. 2B) og midler, er medianer og intervaller angivet på tabel 2.

A /Illustrative påvisning af sHLA-E anvendelse af seriefortyndinger af to serumprøver ved ELISA. B /Fordeling af opløselige HLA-E-koncentrationer i sera fra raske kontroller og melanompatienter. P-værdi angiver forskellen mellem de to grupper. C /Procenter af positive sHLA-E sera (sHLA-E≥5 pg /ml) hos raske donorer og melanom patienter. D /Fordeling af opløselige HLA-E koncentrationer i sera fra melanom patienter med hensyn til tumor etaper. Vejviser

I melanom patienter, serumniveauer af sHLA-E (median [interval] ) var signifikant forøget sammenlignet med dem hos raske kontroller (9 pg /ml [0-2544] vs 0 pg /ml [0-1224], henholdsvis p 0,001). For at kvantificere hyppigheden af ​​sHLA-E-positive sera, vi tager et afskæringsværdi på 5 pg /ml. Denne analyse afslørede, at i gruppen af ​​94 raske donorer kunne sHLA-E påvises i 30 sera (31,9% af total). I modsætning hertil i melanompatienter, 68 af 127 sera (53,5% af total) indeholdt sHLA-E (fig. 2C). Således procentdele af positive sera var signifikant højere i melanom patienter sammenlignet med raske donorer (p 0,001). Undergruppe analyse overvejer AJCC stadier (American fælles udvalg om kræft, https://www.cancerstaging.org/) blev derefter udført. Ingen forhold af serum sHLA-E-niveauer blev fundet i forbindelse med tumor grading (fig. 2D). Som vist i tabel 1, blev sHLA-E-niveauer signifikant forøget i stadium III melanom patienter sammenlignet med raske donorer (p 0,0001).

Tilsammen udgør disse resultater valideret en ELISA til bestemmelse af sHLA-E i humant serum og viste, at sHLA-E øges signifikant i sera fra melanompatienter.

produktion af opløseligt HLA-E ved en forskelligartet panel af humane tumorcellelinjer

Vi analyserede produktion af opløseligt HLA-E med 98 forskellige etablerede humane tumorcellelinier, som repræsenterer faste tumorer såsom melanomer (n = 30), carcinomer (kræft i lungerne (n = 5), colo-rectum (n = 12), nyre (n = 10 ), ovarie (n = 3), bryst (n = 11) og prostata (3)), thyroid cancer (n = 1), cervical cancer (n = 1), sarkomer (osteosarkomer, n = 3), gliomer (n = 2) og flydende tumorer (mesotheliomas (n = 7), myelomer (n = 7) og leukæmier (n = 3)). Som vist i figur 3A og 3B (med hvidt), blev sHLA-E påvist i supernatanterne af tumorcellelinjer afledt fra alle testede oprindelser, undtaget i supernatanten fra æggestok tumor, myelom, leukæmi og gliom cellelinjer (fig. 3 og data ikke vist). I vores dyrkningsbetingelser (500 000 celler, i 3 ml, under 48 timer), blev niveauerne af sHLA-E produceres naturligt af tumorcellelinjer området fra 5 til 400 pg /ml. blev påvist højeste produktioner blandt melanom, colorektale og nyre tumorceller linjer. Hyppigheden analyse af tumorcellelinier stand til at producere sHLA-E (under en afskæringsværdi på 5 pg /ml) viste, at omkring en tredjedel af de tumorcellelinier produceret sHLA-E (24,5%, 24 ud af 98) med højere procentandele opnået i melanom (40%, 12 ud af 30) og nyrecellecancer (40%, 4 af 10) (fig. 3C).

Analyse af opløselige HLA-E-koncentrationer i supernatanter af tumorcellelinjer behandlet eller ikke af IFN-γ med hensyn til tumor oprindelser:. fordelingen af ​​individuelle koncentrationer (A), gennemsnitlige niveauer (B) og procentdele af positive supernatanter (sHLA-E≥5 pg /ml) (C)

Selektiv regulering af sHLA-E produktion af cytokiner

Vi har tidligere vist, at IFN-γ forøgede overfladeekspression af HLA-E samt afgivelse af opløseligt HLA-E ved melanomceller. For at bekræfte dette resultat og udvide panelet af testede cytokiner, virkningen af ​​IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15 , IL-23, IFN-a2a, IFN-γ, TNF-α og GM-CSF ved tumorceller linjer sHLA-E-produktion blev testet. Som forventet blev sHLA-E frigivelse induceret eller forøget betydeligt i tumor cellesupernatanter efter IFN-γ-aktivering (p 0,0001). Hyppigheden analyse af tumorcellelinier stand til at producere sHLA-E efter IFN-γ behandling fordoblet (fra 24,5% til 49%, 48 ud af 98) (fig. 3C). I mindre grad, at eksponering IFN-α og TNF-α signifikant øget produktion af sHLA-E ved tumorcellelinier (p 0,001 og p 0,05 henholdsvis). Disse resultater er illustreret i figur 4A under anvendelse af to melanomcellelinier (M88 og M102) og en colon adenocarcinom cellelinie (HT29). Andre testede cytokiner har ingen virkning på denne produktion. Kinetisk analyse og dosis-respons eksperimenter blev udført med IFN-γ, IFN-α og TNF-α. Som vist i figur 4B blev sHLA-E, steget betydeligt på en dosis-afhængig måde med maksimal effekt observeret med 10 ng /ml for de tre cytokiner. Denne produktion kunne påvises så tidligt som 1 dag efter cytokiner behandling af tumorceller og var maksimal efter 48 timer (figur 4C.)

A /sHLA-E opdagelse i supernatanter af tre tumorcellelinier:. To melanom celle linier (M88 og M102) og en colocarcinoma cellelinie (HT29), behandlet eller ej med IFN-α, IFN-γ eller TNF-α (10 ng /ml, 48 h). Væsentlige forskelle mellem kontrol- og behandlingsgruppen værdier er angivet (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). B /sHLA-E påvisning i kultursupernatanter fra M102 behandlet med serielle koncentrationer af IFN-α, IFN-γ og TNF-α i 48 timer. C /Time løbet af sHLA-E produktion i kultur supernatanten af ​​M102 behandlet i op til 6 dage med 10 ng /ml IFN-γ.

Diskussion

Denne undersøgelse dokumenterer, at serum sHLA-E er steget betydeligt i patienter, der lider melanom sammenlignet med normale individer, uafhængigt af alder og køn. Vi gennemførte denne analyse igennem, ved hjælp af en specifik og følsom ELISA at vi udviklet og valideret til bestemmelse af sHLA-E-niveauer i biologiske væsker. I dette store studie med 221 personer, vi observerede forhøjede koncentrationer af serum sHLA-E samt højere frekvens af sHLA-E positive sera hos patienter med melanomer sammenlignet med raske donorer. I betragtning af tumor sortering, mens sHLA-E-niveauer syntes at stige med fremskreden sygdom stadier indtil fase III, har vi ikke finde signifikant sammenhæng mellem serum sHLA-E niveauer og melanom fase, der kan være forårsaget af den ulige fordeling af patienter ved undergruppe. Men hvis sammenlignet med raske donorer, patienter med stadium III melanom udstillet meget forhøjet sHLA-E serum niveau i form af både koncentration og hyppigheden af ​​positive sera. På den anden side, patienter med stadium IV sygdom udviste lavere niveauer af sHLA-E, som er i overensstemmelse med den svage spontane ekspression af HLA-E ved metastatiske tumorsnit, som vi tidligere rapporteret af immunhistokemi [12].

Disse data understregede interesse for opløselige ikke-klassisk HLA-i molekyler i maligne sygdomme. En anden ikke-klassisk HLA-I molekylet, HLA-G, er blevet identificeret i forskellige maligniteter, herunder kræft og har fået en masse opmærksomhed i de seneste udgivelser. Kliniske undersøgelser viste, at sHLA-G-niveauer blev signifikant forhøjet i sera fra patienter med maligne melanomer, gliomer, bryst- og ovariecancer, ikke-småcellet-lungekræft (NSCLC), kroniske lymfocytiske leukæmier, B-celle og T-celle non-Hodgkins lymfomer [17] – [21]. Desuden Zhu et al. viste, at serum sHLA-G-niveauer kunne være en nyttig indikator i skelne tarmkræft fra godartede kolorektale sygdomme [22]. Endelig sHLA-G niveauer var også signifikant højere i maligne ascites af ovarie- og brystcarcinomer end i benigne kontroller [23]. Tilsvarende forhøjede niveauer af stress-inducerbare MHC klasse I chain-relaterede overfladeglycoproteiner, glimmer og MICB, har vist sig at korrelere med kræft faser og metastase i flere carcinomer [24] – [26]. Tilsammen disse undersøgelser kongruent afsløret øgede mængder af ikke klassiske HLA-I molekyler i biologiske væsker (blod og ascites) af patienter, der lider af forskellige kræftformer.

Da vi og andre tidligere har opdaget sHLA-E i de supernantants af melanom og kolorektale cellelinjer ved Western blot-analyse, undersøgte vi, ved hjælp af vores udformet ELISA, produktion af sHLA-E ved tumorcellelinier afledt fra større tumor kategorier, herunder solide tumorer som melanom, bryst-, tyktarms- og nyre og flydende tumorer som mesotheliomas og myelomaer [12], [27]. Vi viste, at sHLA-E spontant fremstilles med 25% af de testede cellelinier (24 af 98), der er afledt af flere typer af humane tumorer, især fra melanom, colorektale og nyre kræft. Så vil det være interessant at behandle en mulig prædiktiv og prognostisk værdi sHLA-E-niveauer i blodet hos patienter, der lider af disse kræftformer.

Vi har også undersøgt indflydelsen af ​​forskellige cytokiner på HLA-E produktion ved tumorcellelinier. Ifølge vores tidligere resultater på melanomcellelinjer [12], viste vi, at IFN-γ induceret eller forøget sHLA-E produktion, hvilket fører til produktion af sHLA-E med 50% af de testede tumorcellelinier (48 ud af 98) . Endvidere frigivelse af sHLA-E blev også drevet af IFN-α og TNF-α i mindre grad. I betragtning af at IFN-γ og IFN-α er høje inducere af HLA-I molekyler udtryk, deres indvirkning på sHLA-E produktionen sandsynligvis afspejler stigningen i HLA-E-ekspression ved tumorceller. Da sHLA-E frigivelse ved melanomceller hovedsagelig matrixmetalloproteinase-afhængig, kunne TNF-α virkning på HLA-E produktion skyldes evnen af ​​TNF-α til at fremme matrixmetalloproteinase-ekspression [12], [28]. Disse resultater er i overensstemmelse med de coupel

et al.

Viser sHLA-E produktion af endotelceller efter behandling med IFN-γ og TNF-α [29]. Men i modsætning til deres undersøgelse, vi observerede ikke nogen virkning af IL-1β-behandling på sHLA-E produktion ved tumorceller, sandsynligvis på grund af en lav ekspression af IL-1-receptor (IL-1R1) ved de testede tumorcellelinier i vores undersøgelse. Men da det er blevet rapporteret, at tumorcellelinier, herunder melanom-cellelinjer, kan udtrykke IL-1R1, kan vi postulere, at IL-1β, som er kendt for at fremme matrixmetalloproteinase-ekspression kunne forøge produktionen af ​​sHLA-E ved IL -1R1 udtrykkende tumorceller [30], [31].

grund af sin virkning på proliferationen af ​​tumorceller, angiogenese og dens immunomodulerende kapacitet skal IFN-α anvendes som immunterapi til behandling af forskellige faste tumorer som melanom og renal carcinoma [32]. Derfor, som vi viser dens evne til at opregulere sHLA-E produktion ved tumorcellelinier, systemisk terapi med IFN-α kan øge sHLA-E produktion i melanom-patienter. I denne støtte, er IFN-α terapi forbundet med forhøjede sHLA-G serumniveauer hos patienter med melanom [33]. Endvidere er det blevet rapporteret, at γ-bestråling nedregulerer overfladeekspression af HLA-G1 på melanomceller, ved at øge den proteolytiske spaltning af dette molekyle [34]. Så vil det være interessant at bestemme, om denne mekanisme også observeres med HLA-E, som derefter frigives i tumormikromiljøet og herved påvirke den lokale immunologiske status.

Uafhængigt af mulig mekanisme af sHLA- E produktion, er det vigtigt at fremhæve, hvordan generation af sHLA-E ved tumorceller vil kunne bidrage til immunosurveillance flugt. Eftersom interaktion af membranbundet HLA-E med de inhiberende receptorer CD94 /NKG2-A induceret inhibering af NK og T celle responser, den immunsuppressiv aktivitet af sHLA-E bør undersøges. Til støtte for en potentiel immunregulerende fonction, coupel

et al.

Rapporterede, at sHLA-E beskytter endotelceller fra NK-medieret cellelyse [29]. Desuden har sHLA-G og sMICA vist sig at nedsætte immunsystemets genkendelse og destruktion af tumorceller. sHLA-G, via dens interaktion med inhibitor receptorerne ILT-2 og ITL-4, er blevet vist at inhibere lytiske aktivitet af NK-celler, til at inducere apoptose af CD8

+ CTL, at påvirke CD4

+ alloproliferation og forringe NK /DC krydstale [35] – [38]. Desuden tumor-afledte opløselige MICA induceret endocytose og nedbrydning af det beslægtede aktiverende receptor NKG2-D på tumor-infiltrerende lymfocytter, der krænker deres aktivering [29], [39]. Tilsammen disse data understregede betydningen af ​​tumor-afledte opløselige nkr ligander i at yde en tumor mikromiljø begunstige immun flugt. Endvidere er det blevet rapporteret, at sHLA-G fremstilles

in vitro

som monomere og multimere former, og at sHLA-G dimerisering forøger ILT-2-medieret inhibering af T-celle alloresponse [40]. Så bør eksistensen af ​​sHLA-E multimerer også undersøges.

Som konklusion, den aktuelle undersøgelse giver for første gang tegn på en forhøjet sHLA-E i sera fra melanom patienter, hvilket indikerer, at HLA-E kunne tjene som en klinisk markør for prognosticering eller forudsigelse af de kliniske resultater af disse kræftformer, især i forbindelse med immunterapi. Fordi en følsom sHLA-E-ELISA har praktiske fordele for storstilet screening, kunne det vedtages til rutinemæssig anvendelse i den immunologiske opfølgning af melanomer og andre menneskelige kræftformer. Selvom funktionen af ​​tumor-afledt opløselig HLA-E mangler at blive defineret, kan vi postulere, at disse molekyler kan styrke værtens immunsuppression gennem inhibering funktionerne af NK- og T-celler, og herved fremme overlevelsen af ​​tumorceller. Den klinisk relevant funktion af disse sHLA-E molekyler skal analyseres nøje med henblik på at udvikle passende immunterapeutiske strategier.

Materialer og metoder

Antistoffer

MEM-E /07 og MEM-E /08 mAbs (Exbio, Tjekkiet), der binder indfødte HLA-E proteiner blev anvendt til ELISA.

Peptider og rekombinante opløselige HLA

Peptider blev købt fra Eurogentec (Angers , Frankrig). Renhed ( 85%) blev kontrolleret ved omvendt fase højtydende væskekromatografi. Diverse HLA og β2-mikroglobulin rekombinante proteiner blev genfoldet med efterfulgt angivne syntetiske peptider. HLA-E * 0101 /VMAPRTLVL (HLA-A * 0201-signalpeptid) og HLA-A * 0201 /AAGIGILTV (Melan-A

27-35) monomerer blev dannet ved det rekombinante protein facilitet (IFR 26, Nantes). HLA-A * 2301 /PYLFWLAAI, HLA-B * 0702 /GILGFVFTL, HLA-B * 0801 /QAKWRLQTL og HLA-B * 2705 /HRCQAIRKK monomerer blev leveret af tetramer produktionsanlæg (Ludwig Institute For Cancer Research, Lausanne, Schweiz) .

patienter og prøver

Sera prøver blev indsamlet fra patienter med melanom (n = 127), alle med en formel tilladelse. Sera fra raske donorer (n = 94) blev leveret af Etablissement Français du Sang (EFS) (Nantes, Frankrig) og anvendt som kontroller.

Etik Statement

skriftlige samtykke blev opnået fra alle patienter og raske donorer. Alle disse undersøgelser var godkendt af de lokale etiske commmitees “Comité de Protection des Personnes Ouest IV-Nantes” og “Agence Française de sécurité sanitaire des Produits de Santé”.

Cellelinjer kultur

melanom cellelinjer blev etableret i GMP Unit for Cellulær Terapi og i vores laboratorium (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Frankrig) og hører til Biocollection PC-U892-NL (CHU Nantes). Kolorektale karcinom cellelinjer blev købt fra ATCC eller etableret i vores laboratorium UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-FJ, CHU Nantes). Nyrer karcinom cellelinjer blev etableret i INSERM U1016 /CNRS UMR 8104, Paris, Frankrig) [41]. Brystkræft cellelinjer blev købt fra ATCC eller etableret i vores laboratorium UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-NG, CHU Nantes). Lungekræft cellelinjer og lungehindekræft cellelinier blev købt fra ATCC eller gaver fra M. Grégoire (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Frankrig, Biocollection PC-U892-MG, CHU Nantes). Myelomceller linjer var gaver fra C. Pellat (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Frankrig, Biocollection PC-U892-MA, CHU Nantes). Ovarie carcinom, gliom, leukæmi, thyreoidea, cervix og prostatakræft-cellelinier blev indkøbt fra ATCC og venligst tilvejebragt af C. Sai, F. Vallette og F. Paris (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Frankrig). Osteosarcomaceller linjer blev købt fra ATCC og gaver fra M. Padrines (EA3822, INSERM U957, Nantes, Frankrig). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI eller DMEM med 10% føtalt kalveserum (FCS, PAA, Østrig). Salg

Tumor supernatanter produktion

I sHLA-E produktion screening, 500 000 tumorceller blev dyrket i 6-brønds plader i 3 ml 10% FCS-RPMI suppleret eller ikke med IFN-γ (20 ng /ml). Efter 48 timer, tumor supernatanter blev opsamlet, centrifugeres 5 min ved 2500 g og opbevares nedfrosset før testning i ELISA.

Virkningen af ​​andre cytokiner under sHLA-E produktion, har i første omgang blevet testet på 20 ng /ml i løbet af 48 timer med to melanomer cellelinier (M88 og M102) og en colorektal adenocarcinom-cellelinje (HT29). Dosis-respons og kinetik vurderinger af IFN-γ, IFN-a2A og TNF-α blev sekundært udført som beskrevet (koncentration i området fra 40 til 0,02 ng /ml i løbet af 1 til 6 dage) med disse tre tumorer cellelinier.

Påvisning af sHLA-E ved ELISA

Nunc-Immuno MaxiSorp Mikrotiterplader blev coatet (50 pl /brønd) med MEM-E /08 mAb ved 1 ug /ml i carbonat /bicarbonatbuffer (CO

3HNa 35 mM, CO

3Na

2 15 mM, pH 9,5) natten over ved 4 ° C. Efter fire vaske med PBS-0,05% Tween 20 (200 uL /​​brønd), blev pladerne mættet med PBS indeholdende 10% FCS i 2 timer ved stuetemperatur (200 pi /brønd). Efter fire vaske, de biologiske prøver (50 pl /brønd eventuelt fortyndet i mætningsbuffer) blev tilsat (i tre kopier) og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Kultursupernatanter blev analyseret ufortyndet, mens seks dobbelte fortyndinger af sera blev anvendt. Den detektere biotinyleret MEM-E /07 mAb fortyndet ved 1 pg /ml i mætningsbuffer blev tilsat efter fire vaske (50 pl /brønd) og inkuberet igen i 2 timer ved stuetemperatur. Plader blev vasket fire gange og inkuberet med strepta-HRP-reagens (BD Pharmingen) fortyndet til 1/1000 i mætningsbuffer i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev pladerne vasket fire gange og inkuberet med substrat (3,3 ‘, 5,5’-tetramethylbenzidin væske, Sigma, ST Qentin Fallavier, Frankrig) i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke (100 pi /brønd). Reaktionen blev standset ved tilsætning af 100 pl /brønd af 1 M H

3PO

4. Absorbans blev målt ved 450 nm med en Thermo Scientific Multiskan EX. Analyse af standardkurven og interpolation af prøver koncentrationer blev udført ved anvendelse Prism 5 Software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Statistisk analyse

Sera af kræftpatienter blev sammenlignet med sera fra raske donorer. Ifølge ikke-parametrisk fordeling af sHLA-E serum niveauer blev data præsenteret som midler, medianer, komfurer og procenter af positiv sHLA-E sera. For generel sammenligning af to grupper blev statistisk analyse udført af Mann-Whitney U test. Fordeling af koncentrationer tværs scenen blev vurderet ved brug Kruskal-Wallis test. At sammenligne frekvensen af ​​positive sHLA-E sera blev Fisher test anvendt. Statistisk analyse af den modulerende virkning af cytokiner på sHLA-E produktion ved tumorcellelinier blev udført ved envejs ANOVA efterfulgt af post hoc Bonferroni test. En P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism 5 Software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Tak

Vi oprigtigt takke Pr Marie-Françoise Avril (APHP, Hôpital Cochin, service de Dermatologie, Paris, Frankrig) for at give melanom blodprøver. Forfatterne også takke Philippe Guillaume fra tetramer produktionsanlæg af Ludwig Institute For Cancer Research (Lausanne, Schweiz) til produktion af HLA-monomerer.