PLoS ONE: Cystatin C nedreguleres i prostatakræft og modulerer Invasion af prostata cancer celler via MAPK /Erk og Androgen receptor Pathways

Abstrakte

Cystatin C menes at forhindre tumor progression ved at hæmme aktiviteterne i en familie af lysosomale cysteinproteaser. Men lidt om den præcise mekanisme for cystatin C funktion i prostatakræft. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​cystatin C og dets associering med matrixmetalloproteinaser 2 (MMP2) og androgen receptor (AR) i et væv microarray sammenligne benigne og maligne prøver fra 448 patienter, som gennemgik radikal prostatektomi for lokaliseret prostatacancer. Cystatin C udtryk var signifikant lavere i kræft prøver end i godartede væv (p 0,001), og der var en statistisk signifikant omvendt korrelation mellem ekspressionen af ​​cystatin C og MMP2 (r

s

2 = -0,056, p = 0,05 ). Der var en klar tendens til, at patienter med nedsat niveau af cystatin C havde lavere samlet overlevelse. Målrettet hæmning af cystatin C ved hjælp af specifikke siRNA resulterede i en øget invasionsevne af PC3 celler, mens induktion af cystatin C overekspression stærkt reduceret invasion på PC3 in vitro. Virkningen af ​​cystatin C på modulering af PC3 celleinvasion blev provokeret af Erk2 inhibitor, som specifikt inhiberede MAPK /Erk2 aktivitet. Dette antyder, at cystatin C kan mediere tumorcelleinvasion ved modulering af aktiviteten af ​​MAPK /ERK kaskader. Overensstemmelse med vores immunhistokemiske fund, at patienter med lav ekspression af cystatin C og høj ekspression af androgen receptor (AR) tendens til at have dårligere samlet overlevelse end patienter med høj ekspression af cystatin C og høj AR ekspression, induceret overekspression af AR i PC3-celler, der udtrykker cystatin C siRNA langt mere invasiv af PC3 celler. Dette antyder, at der kan være en krydstale mellem cystatin C og AR-medierede pathways. Vores undersøgelse afdækker en hidtil ukendt rolle for cystatin C og dens tilknyttede cellulære veje i prostatacancer invasion og metastase

Henvisning:. WEGIEL B, Jiborn T, Abrahamson M, Helczynski L, Otterbein L, Persson JL, et al. (2009) Cystatin C nedreguleres i prostatakræft og modulerer Invasion af prostatacancerceller

via

MAPK /Erk og Androgen receptor Pathways. PLoS ONE 4 (11): e7953. doi: 10,1371 /journal.pone.0007953

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: May 17, 2009; Accepteret: 29 oktober 2009; Udgivet: 23 November, 2009

Copyright: © 2009 WEGIEL et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Forskningsrådet Svensk (Grant nr. 20760 og 09.915), den svenske Cancer Society (Projects ingen 07-0458 og 02-4573), forskningsfonden og Cancer Research Fund af Malmö, Universitetshospital, fakultetet of Medicine, Lunds Universitet, Gunnar Nilssons Cancer Foundation, og Crafoord STF, og regeringen Health Grant (ALF) og A. Oesterlund Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer (PCA) fortsat den mest almindelige og næstmest dødelige tumor hos mænd i den vestlige [1] World. Ca. en tredjedel af de behandlede patienter vil tilbagefald og eksisterer i øjeblikket ingen helbredende behandling for metastatisk sygdom [2]. Progressionen gennem hormon-afhængige til kastration resistente og metastatisk prostatacancer er dårligt forstået. Processerne invasion og metastase af tumorceller er afhængige af deres evne til at nedbryde omgivende proteiner og andre væv komponenter. De proteolytiske enzymer og proteaser såsom collagenase og cathepsiner er nødvendige til dette formål, og således spille afgørende roller i flere trin i vækst kræft og metastaser [3], [4]. Blandt proteaser har matricemetalloproteinaser MMP’er og lysosomale cathepsin B blevet tilskrevet store roller i prostatakræft progression [5] – [9] [10], [11]. For nylig, MMP2 blev også knyttet til en invasiv fænotype af prostata kræftceller [12] og udtryk for MMP2 i maligne prostata epitel blev demonstreret at være en uafhængig prædiktor for prostatakræft sygdomsfri overlevelse [13].

Cystatin C er en secerneret cysteinproteaseinhibitor som regulerer knogleresorption, neutrofil kemotaksi, og væv inflammation samt resistens over for bakterielle og virale infektioner. Det fungerer også som en potent inhibitor af cathepsin B og andre menneskelige lysosomale cysteinproteaser [14]. Cystatin C er også kendt for at være en bedre markør for nyreskade end kreatinin [15], [16]. Ved inaktivering cathepsin proteaseaktivitet, cystatin C inhiberer cancercelleinvasion og metastase [17], [18]. Unormale serumniveauer af cystatin C eller cathepsin B /cystatin C-komplekset er blevet foreslået som diagnostiske og prognostiske indikatorer for kræft i huden, colon og lunge [19]. Cystatin C er blevet foreslået at spille en vigtig rolle i neuroendrocrine differentiering af prostatacancer [20]. For nylig er serum cystatin C blevet foreslået som nyttig markør for øget osteoblastisk aktivitet forbundet til bisfosfonater behandlinger i prostatacancerpatienter med knoglemetastaser [21]. Imidlertid rolle cystatin C i prostatakræft progression og dens tilknyttede cellulære og molekylære netværk mangler at blive undersøgt,.

Nylige undersøgelser har vist, at under tumorgenese og metastase, forskellige proteolytiske kaskader bestående af enzymer, såsom cysteinproteaser og MMP handle på en synkroniseret måde og støtte i tumorvækst, invasion i omgivende væv [10]. Cathepsin B er blevet impliceret i nedbrydningen af ​​den ekstracellulære matrix (ECM) enten i secerneret form i det ekstracellulære rum eller bundet til celleoverfladen [10]. Specielt har MMP-2 og MMP-9 blevet foreslået at være forbundet med prostatacancer metastaser, blev så høje niveauer af disse proteiner målt i plasma og urin hos patienter med metastatisk sygdom [5], [22], [23]. MMP9 er også blevet undersøgt intensivt og er imidlertid at spille en vigtig rolle i to vigtige aspekter af tumorprogression, angiogenesis og vaskulogenese [8].

metastatiske proces involverer koordinering af flere cellulære og signal-transduktion pathways, der tillade kræftceller til at formere sig, omforme deres omgivende miljø, invadere til fjernt sted og danne nye tumorer. MAPK signalveje spiller en vigtig rolle i at inducere sekretion af proteolytiske enzymer som nedbryder basalmembranen, forøgelse cellevandring og opretholdelse tumorcellevækst [7]. Stigninger i MAPK-aktivitet er blevet observeret i avancerede PCa antyde, at et konstitutivt aktiv Ras-vejen kan være forbundet med prostatacancer progression og metastase [7], [24]. Vigtigere er MAPK aktivering knyttet til udvikling af androgen-uafhængig prostatacancer, nu almindeligt betegnes kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) [25], [26], [27].

Androgen receptor (AR), et medlem af superfamilien af ​​ligand-aktiverede nukleære receptorer, spiller en central rolle i patogenesen af ​​primær og metastatisk prostatacancer [28], [29]. AR genamplifikation er fundet i en tredjedel af avancerede prostatakræft og menes at bidrage til progression og metastase af prostatacancer [30], [31], [32], [33]. AR ikke handle uafhængigt i reguleringen af ​​tumorvækst, men kræver interaktion med co-regulatorer [34]. Mutationer i genet eller budskab AR er årsagerne til den øgede androgen følsomhed af disse tumorer. Lokal autokrin produktion af dihydrotestosteron og testosteron i prostata cancerceller formindsker kastration virkning [35]. Krydstale mellem AR og andre signalveje (fx MAPK) samt ændringer i AR co-regulatorer [34] fremskynde ligand uafhængig aktivering af AR. , AR spiller således en afgørende rolle i både klinisk lokaliserede og avancerede prostatakræft.

Den foreliggende undersøgelse havde til formål at evaluere udtryk for cystatin C og dens kliniske relevans i prostatakræft, og for at belyse en ny rolle for cystatin C i prostatakræft invasion. Cystatin C er forbundet med den proteolytiske kaskade og MAPK /Erk-vejen sammen med AR kan handle i en synkroniseret måde at fremme tumorvækst og invasion i omgivende væv. Her etablerede vi for første gang en funktionel forbindelse mellem cystatin C og MAPK-Erk signalering og AR-medierede veje i prostata kræftceller.

Resultater

Tissue Expression af Cystatin C i prostatakræft er forbundet med MMP2 som markør for invasivitet og det kliniske udfald

nedsat cystatin C mRNA-ekspression er blevet rapporteret i flere typer af faste tumorer, herunder brystcancer, coloncancer og renal carcinoma [36], [37]. Men er ikke blevet rapporteret, specifikke rolle cystatin C proteinekspression i prostatakræft progression og dens tilknytning til kliniske karakteristika. Vi udnyttede et væv-microarray (TMA) indeholdende prøver fra godartet prostata væv og maligne tumorer fra 448 patienter, som gennemgik radikal prostatektomi for lokaliseret prostatacancer. Angivelse af cystatin C blev undersøgt ved immunhistokemi. Stort set alle godartede prøver viste markant høj cytoplasmatisk protein ekspression af cystatin C, medens de matchede prostatakræft væv konsekvent viste svagere eller uopdaget immunfarvning (figur 1A, B). Forskellen var statistisk signifikant (p 0,001), hvilket antyder, at cystatin C-protein-ekspression er generelt nedreguleret i prostatacancer sammenlignet med godartet epitel. Vi derefter underopdeles tumorprøver i to grupper baseret på Gleason kvaliteter af individuelle core biopsier, Gleason grad 2 eller 3 (gruppe 1) vs. Gleason grad 4 eller 5 (gruppe 2) [38]. Vi fandt nedsat ekspression af cystatin C i 61% tumorprøver fra gruppe 1 mod 72% af prøverne i gruppe 2 (figur 1A). Både MMP2 og MMP-9, i særdeleshed har vist sig, at være forbundet med prostatacancer metastaser [13], [39]. For nylig blev cystatin C identificeret som en ny substrat for MMP2 i celle-baserede proteomisk analyse, hvilket tyder på, at der er en direkte funktionel forbindelse mellem MMP2 og cystatin C [40]. Vi udforskede derfor en mulig sammenhæng mellem cystatin C udtryk og udtryk for MMP2 i patientprøver ved immunhistokemisk analyse af vores væv microarray konstruktion (TMA). Interessant ekspression af cystatin C-protein blev omvendt forbundet med MMP2 i 448 patienter materiale, der var statistisk signifikant (r

s

2 = -0,056, p = 0,05). Vi yderligere undersøgt, om cystatin C udtryk korreleret med kliniske resultat i patienter med prostatacancer, og vi delte patienterne i to grupper baseret på niveauet af cystatin C udtryk: cystatin C høj (intensiteten af ​​farvning 2 eller 3) eller cystatin C lav (intensitet farvning under 2) gruppe. Vi fandt ingen signifikant forskel i kliniske parametre, herunder Gleason score, T fase /Patologi stadium, metastase fritid, forbehandling PSA-niveauer, Biokemiske gentagelse PSA-niveauer, Biochemical fritid og positive kirurgiske margener mellem cystatin C høj og cystatin C lavt gruppe (tabel 1 ). Vi undersøgte derefter, om kliniske resultater, herunder den samlede overlevelse (OS) afveg mellem cystatin C høj og cystatin C lave patienter. Patienterne i cystatin C høje gruppe på 100 måneder fra diagnose havde en OS på ca. 40% i forhold til 25% for patienter i cystatin C lav (p = 0,307) (figur 1C). Selvom vi ikke opnå statistisk signifikans, er der en klar tendens til, at patienter med lavt niveau af cystatin C-ekspression havde dårligere resultat sammenlignet med dem med højere niveauer. Når vi vurderet, om biokemisk recidiv overlevelse varierede mellem grupperne, var der heller ingen signifikant forskel (p = 0,401) (Figur 1D).

A). Immunhistokemisk analyse af cystatin C udtryk i benigne og PCA prøver. Sektioner repræsenterer godartet, væv og tumorer i Gleason grad 3 og grad 5 er vist. Repræsentative billeder blev opnået under anvendelse af et 40x objektiv. B). Grafen for kvantitativ analyse af immunhistokemisk farvning af Cystatin C (score 0-negativ, 1- moderat, 2- stærk, 3- meget stærk) viser sammenligningen mellem 448 benigne og cancer prøver (gennemsnit farvning af dubletter af hver prøve). Den parrede Wilcoxon rang sum test analyser blev anvendt til at vurdere sammenligningen mellem grupperne. Middelværdierne for intensiteter af farvning (vandrette linier) med fejlsøjler repræsenterer intervaller for de gennemsnitligt 95% sikkerhedsgrænser er vist. Boksene repræsenterer fordelingen af ​​ekspressionen af ​​cystatin C i grupperne. C) Samlet overlevelse hos patienter med høj eller lav ekspression af cystatin C i prøver prostatakræft. Kaplan-Meier overlevelse analyse blev udført. D) Overlevelseskurver af tid til tilbagefald som evalueres som en biokemisk tilbagefald målt som ved raise på PSA [57] til den lave (intensitet score 0-1,5) og høj (intensitet score 2-3) cystatin C udtryk.

Tissue Expression af Androgen receptor er omvendt proportional associeret med Cystatin C Expression

Forstærkning og mutationer af AR-gen er identificeret som kritiske faktorer i forbindelse med dårlig prognose for prostatakræft. Vi ønskede at undersøge, om cystatin C ekspression i kombination med AR kan forudsige resultatet af sygdommen. Vi evaluerede ekspression af cystatin C i en delmængde af vores TMA prøver omfattende 99 patienter med den mest fremskreden sygdom og havde højt AR ekspression. Vi delte disse 99 patienter i to grupper: den cystatin C-low /AR-high gruppe og cystatin C-høj /AR-høj gruppe (figur 2). Patienter med lav cystatin C niveauer og høj AR udtryk havde lavere samlet overlevelse (40%, 100 måneder) sammenlignet med patienter med høj cystatin C niveauer og høj AR udtrykket (60%, ved 100 måneder), selv om disse resultater ikke nåede statistisk signifikans (p = 0,094). Dette indikerer, at patienter, som havde lav cystatin C og høj AR ekspression tendens til at have dårligere resultat sammenlignet med patienter med forhøjet cystatin C og høj AR ekspression.

Samlet overlevelse i en gruppe af 99 patienter med den mest fremskreden prostatacancer (Gleason klasse 4-5), som var kendetegnet ved høj ekspression af AR og blev adskilt til forskellige grupper baseret på cystatin C-niveauer (lav intensitet score 0-1,5 og høj intensitet score 2-3).

cystatin C ekspression i prostatacancercellelinjer

Fordi cystatin C blev nedreguleret i prostatacancer væv og associeret med forøget ekspression af MMP2, der er kendt for at bidrage til tumorinvasion og metastase, ønskede vi at undersøge rolle cystatin C ekspression i prostatakræft cellevækst, overlevelse og invasion. Vi undersøgte cystatin C ekspression i tre prostatakræft-cellelinier, herunder androgen-sensitive LNCaP-celler og androgen-ufølsom PC3 og DU-145-celler (figur 3). Cystatin C-protein-koncentrationer i supernatanterne blev målt ved ELISA, efter dyrkning af cellerne i serumfrit medium i 24 og 48 timer. Interessant LNCaP-celler, som vides at være ikke-invasive producerede høje niveauer af cystatin C, mens de invasive cellelinier PC3 og DU-145 viste lavere niveauer af cystatin C sekretion (figur 3). PC3 celler, med en moderat udtryk niveau af cystatin C blev valgt til efterfølgende funktionelle studier til at vurdere virkningerne af tvungen overekspression og knockdown af cystatin C på PC3 celle invasion.

ELISA-assay af supernatanter fra tre forskellige prostatacancerceller linier, som blev udpladet 24 timer eller 48 timer før eksperimentet blev udført. Data er vist som gennemsnit af tre eksemplarer ± SD for 3 eksperimenter.

nedregulering af Cystatin C er knyttet til Invasion af PC3 Celler

Da PC3 celler er invasive, udtrykker moderat niveau af cystatin C og har manglende funktionel AR, således kan være et udmærket model for kombinerede undersøgelser af cystatin C og AR funktion. PC3-celler blev transficeret med cystatin C siRNA vektor eller kontrol siRNA vektor til 24 timer. Immunoblotanalyse bekræftede, at cystatin C siRNA specifikt blokeret proteinet ekspression af cystatin C i PC3-celler (figur 4A). For at undersøge effekten af ​​cystatin C banke ned på modulering af invasiv aktivitet af PC3-celler, in vitro invasiv aktivitetsassays blev udført for at vurdere andelen af ​​PC3-celler, der udtrykker cystatin C siRNA eller kontrol siRNA, der har invaderet gennem Matrigel coatede membraner. En signifikant højere andel af PC3-celler, transient transficeret med cystatin C siRNA, migrerede gennem Matrigel coatede kamre sammenlignet med den af ​​PC3-celler transficeret med kontrol siRNA (figur 4B-C). Dernæst vi vurderet, om cystatin C knockdown kan have effekt på spredning af prostata cancer celler. PC3-celler transficeret med cystatin C siRNA eller kontrol-siRNA blev underkastet BrdU-inkorporering assay. Cellulær proliferation blev vurderet efter 24 timer eller 48 timer efter transfektion. Ingen signifikante forskelle i proliferationshastigheder mellem PC3-celler transficeret med siRNA til cystatin C eller kontrol-siRNA blev observeret (data ikke vist), hvilket antyder, at inhibering af cystatin C havde ingen virkning på PC3 celleproliferation. Vi vurderer også virkningen af ​​cystatin C på cellecyklusfordeling. Flowcytometrisk analyse blev udført i celler transficeret med cystatin C siRNA eller kontrollere siRNA, vi ikke konstatere, at lyddæmpning af cystatin C havde nogen væsentlig indflydelse på fordelingen af ​​cellecyklus faser i PC3 celler (data ikke vist). Dernæst ønskede vi at teste, om inhibering af cystatin C, kan have nogen virkning på overlevelse af PC3-celler som reaktion på behandlingen med cytotoksisk middel. PC3-celler transficeret med siRNA til cystatin C eller kontrol-siRNA blev behandlet med det cytotoksiske middel camptothecin i 10 ng /ml for at inducere apoptose. Behandling af PC3-celler med camptothecin held induceret celledød i PC3-celler. PC3-celler transficeret med siRNA mod cystatin C, udviste imidlertid ingen signifikant forskel i camptothecin-induceret apoptose sammenlignet med PC3 celler transficeret med kontrol siRNA (data ikke vist).

A). Immunoblotting af cystatin C i PC3-celler efter behandling med kontrol (siCtr) og cystatin C (siCys) siRNA. B-C) Invasion assay matrigel- overtrukket Boyden kamre PC3 celler med knockdown af cystatin C. repræsentativt billede af invaderende celler er vist i (B) og kvantitativ analyse af invasion ved at måle absorbans efter farvning af invaderende celler med cellefarvende Opløsning indeholdende krystalviolet leveres i Transwell invasion assay (Chemicon, Millipore, CA) (C) data ± SD er repræsentative for mindst 3 eksperimenter, * p. 0,01 (Student T-test)

Fordi hæmning af cystatin C i PC3 celler havde signifikant effekt på PC3 celle invasion, vi derfor vurderet, om overekspression af cystatin C kan have hæmmende på invasive adfærd PC3 celler. For at inducere overekspression af cystatin C i PC3-celler, blev PC3-celler transficeret med en cystatin C ekspressionsvektor eller med en tom ekspressionsvektor. Den stabile overekspression af cystatin C i PC3-celler blev opnået efter antibiotisk selektion. Overekspression af cystatin C i PC3-celler blev bekræftet ved immunoblotanalyse (figur 5A). Når vi undersøgte effekten af ​​overekspression af cystatin C på PC3 celleinvasion, bemærkede vi, at en signifikant lavere andel af PC3-celler, der overudtrykker cystatin C migreret gennem Matrigelcoatede Boyden kamre sammenlignet med celler, der udtrykker kontrolvektor (figur 5B-C). Tilsammen vores aktuelle data tyder på en vigtig rolle for cystatin C for at inhibere prostatacancer celleinvasion.

A) Immunoblot of cystatin C i PC3-celler efter stabil transfektion med pcDNA3.1 og cystatin C-pcDNA3.1 plasmider . Stabile kloner blev etableret efter 2 ugers selektion på neomycin. B-C) Invasion assay af PC3-celler med overekspression af betjenings- eller cystatin C plasmider. Repræsentative billeder af celler er vist i B og kvantificering (absorbans) af data + SD fra 3 uafhængige eksperimenter er vist i C. * p 0,05 (Student T-test)

rolle Erk2. pathway i cystatin C-medierede virkninger på invasion

Næste, vi ønskede at undersøge de cellulære mekanismer og veje, som cystatin C udøver sin virkning på PC3 celle invasion. MAPK signalveje og TGFp tilgange er blevet vist at have funktionelle forbindelse med proteolytiske enzymer, herunder cathepsin familie af proteiner til fremme nedbrydningen af ​​basalmembranen, forbedrer celleinvasion og opretholder tumorcellevækst. Smad 2/3 proteiner er de nedstrøms effektorer af TGF-signalering og målet for MAPK /ERK veje så godt, vi ønskede derfor at undersøge, om cystatin C kan have en direkte funktionel sammenhæng til disse signalveje. Vi først undersøgt, om cystatin C, kan mægle aktiviteter MAPK og TGFp veje ved at regulere ekspression og fosforylering af Smad2 og Erk1 /2 i PC3 celler. Vi undersøgte phosphorylering af Smad2 og ERK1 /2-i PC3-celler transficeret med cystatin C siRNA eller kontrol siRNA (figur 6A). Immunoblot analyse afslørede, at en stigning i niveauet af phosphoryleret Smad2 og Erk1 /2 blev observeret i PC3-celler transficeret med cystatin C siRNA, hvilket antyder, at både Smad2 og Erk1 /2, være nedstrømseffektorer inhiberet af cystatin C (figur 6A).

A). Immunoblotanalyse af P-Smad2 i PC-3-celler efter silencing af Smad2. B-C). Invasion assay i PC-3 celler efter tavshed af Smad2 samtidig med knockdown af cystatin C. De repræsentative billeder er vist i B og kvantitative resultater af 3 uafhængige forsøg er præsenteret i C. * p 0,05 (Student T-test). D). Immunoblot med antistof mod phosphoryleret (Ser383) -Elk1 og cystatin C i lysaterne fra PC3-celler transficeret transient med siRNA cystatin C og styre siRNA og co-behandlet med Erk2 inhibitor (25 uM). Bemærk, at Erk2 inhibitor blokerer nedstrøms fosforylering af Elk1 et mål på Erk2 i celler med knockdown af cystatin C. Data er repræsentative for 2 eksperimenter. E-F). Invasion assay i PC-3-celler efter samtidig silencing af cystatin C og inhibering af Erk2 med selektiv inhibitor. De repræsentative billeder vises i D og kvantitative resultater af 2 uafhængige eksperimenter er præsenteret i E. * p 0,05, # p. 0,01 (Student T-test)

For at funktionelt undersøge, hvilken rolle Smad2 aktivering i PC3 celler, testede vi, om målrettet Smad2 knockdown havde nogen effekt på tumorceller invasion. Vi har designet siRNA til specifikt at målrette Smad2. Inhibering af Smad2 phosphorylering via Smad2 siRNA-medieret knockdown blev opnået i PC3-celler og blev bekræftet ved immunoblot (data ikke vist). In vitro afslørede invasive aktivitetsassays, at andelen af ​​migrerende og invaderende PC3-celler var ens i PC3-celler transficeret med Smad2 siRNA og i PC3-celler transficeret med kontrol siRNA (figur 6B-C). Vi derefter udføres samtidigt målrettet knockdown af Smad2 og cystatin C i PC3-celler. PC3-celler, som blev co-transficeret med cystatin C siRNA og Smad 2 siRNA eller kontrol-siRNA blev yderligere påført på invasionen kammer for invasionen assay. Der var ingen forskelle i invasionen på mellem PC3 celler co-udtrykker cystatin C siRNA og Smad 2 siRNA og PC3 celler co-udtrykkende cystatin C siRNA og kontrol siRNA (figur 6B-C), hvilket antyder, at hæmning af Smad2 havde ingen yderligere effekt på modulerende invasion af PC3-celler, der udtrykker cystatin C siRNA og at Smad2 kan ikke involveret i cystatin C-medieret invasion tumorcelle.

Fordi en stigning i niveauet af phosphoryleret ERK1 /2-blev også observeret i PC3-celler transficeret med cystatin C siRNA i ovenstående eksperimenter, vi derfor undersøgt yderligere, hvis aktivering af ERK1 /2-medierede inhibitoriske virkning af cystatin C på PC3 celleinvasion. Behandling med en MEK-inhibitor (PD98059), en generel inhibitor af MAPK pathways havde ingen virkning på den invasive opførsel af PC3-celler, der udtrykker cystatin C siRNA eller kontrol siRNA (data ikke vist). Vi besluttede at selektivt hæmmer aktiviteten af ​​Erk 1 eller Erk2.

det første, vi hæmmede Erk 1-ekspression via siRNA målrettet knockdown. Inhibering af Erk 1 havde ingen virkning på invasionen af ​​PC3-celler, der udtrykker cystatin C siRNA (data ikke vist), hvilket antyder, at Erk1 kan ikke involveret i cystatin C associeret tumorcelleinvasion. Dernæst anvendte vi selektiv inhibitor af Erk2 aktivitet, som blokerede phosphorylering af Elk-1, en nedstrøms mål på Erk2, i PC3-celler, der udtrykker cystatin C siRNA (figur 6D). Vi observerede, at Erk 2-inhibitor hæmmede satsen er invasiv i celler, der udtrykker cystatin C siRNA i forhold til celler, der udtrykker kontrol siRNA (figur 6E-F) betydeligt. Den Erk2 inhibitoren havde ingen virkning på celleproliferation i PC3-celler under de samme betingelser (data ikke vist). Disse resultater antyder, Erk2 kan være en nedstrøms mål for cystatin C. Dette antyder, at PC3-celler, der har lav cystatin C og højt Erk2 aktivitet kan blive mere invasiv sammenlignet med celler med normale niveau for cystatin C og Erk 2-aktivitet. Endvidere kan cystatin C mediere tumorceller invasion gennem MAPK /ERK2 signalveje.

AR Forbedrer Cell Invasion i fravær af Cystatin C

AR er en vigtig nedstrøms mål for MAPK /Erk veje, og inhibering af ERK1 /2-aktivitet vil føre til en nedsat ekspression af AR i prostatacancerceller [41]. Overekspression af AR i PC3-celler har vist sig at påvirke celleinvasion og vækst in vitro [42]. Da vi har etableret en direkte funktionel sammenhæng mellem cystatin C og Erk2 aktivitet, og vi har vist, at PCA patienter med lave cystatin C niveauer og samtidig høje niveauer af AR viste en tendens til en dårligere resultat i forhold til patienter med forhøjet cystatin C og høj AR niveauer, vi ønskede derfor at vurdere den cellulære og molekylære sammenhæng mellem cystatin C og AR. Vi anvendte PC3 celler, som mangler den funktionelle AR at undersøge en samarbejdsrolle mellem AR og cystatin C. PC3-celler blev co-transficeret med AR udtrykkende vektor sammen med cystatin C siRNA vektor betegnet som “siCysC, AR” eller med en kontrol vektor betegnet som “sictr, AR”. På en tilsvarende måde, PC3-celler blev også co-transficeret med en CMV-vektor og cystatin C siRNA (betegnet som “siCysC, CMV”) eller en CMV udtrykkende vektor og en kontrol siRNA ( “sictr, CMV”). De transficerede PC3 celler blev derefter udsat for invasion assay. Overekspression af AR med samtidig knockdown af cystatin C resulterede i en betydelig stigning i antallet af invasionen af ​​PC3 celler sammenlignet med kontrollerne (figur 7A-B). Således er disse resultater antyder, at PC3-celler, der mangler cystatin C, men har højt AR kan være mere invasiv end kontrolcellerne med normale niveau for cystatin C og AR.

A-B). Invasion assay af PC3-celler transficeret med kontrol siRNA eller mod cystatin C og co-udtrykke AR. Billederne fra repræsentativt forsøg er vist i A, og de kvantitative absorbanser af invaderende celler (* p 0,05, cystatin C siRNA versus siRNA kontrol, # p 0,05 AR versus CMV, Student T-test) efter at have anført med Cell Stain Solution leveres i Transwell invasion assay (Chemicon, Millipore, CA) er vist i B. data er repræsentative for 3 uafhængige forsøg.

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, har vi vist, at

in vitro

lyddæmpning af cystatin C ved specifikke siRNA øget kræft celle invasion i samarbejde med Erk2 og AR signalering. Vi bragt i orden nye molekylære mekanismer, som cystatin C påvirker tumorceller invasion viser, at cystatin C ekspression blev nedreguleret i primære prostatatumorer sammenlignet med benigne væv i 448 patienter. Ved hjælp af en TMA omfatter godartede og tumorprøver fra 448 patienter, viste vi en omvendt korrelation mellem cystatin C og MMP2 ekspression. Flere undersøgelser har overbevisende demonstreret, at cystatin C er en vigtig inhibitor af cathepsin B og tumorcelleinvasion [43], [44]. Cathepsin B påvirkninger tumormikromiljøet ved nedbrydning af ekstracellulær matrix og ved aktivering af andre proteolytiske enzymer, såsom pro-urokinase-plasminogenaktivator (pro-uPA) og matrixmetalloproteaser (MMP’er), således at tumorceller aktivt kan invadere og metastaserer [45]. Overekspression af cystatin C har vist sig at inhibere den invasive potentiale af human melanoma og glioblastomcellelinier [36], [43]. Vores nuværende fund fra undersøgelser af klinisk materiale indikerer, at der er en direkte sammenhæng mellem cystatin C og ekstracellulære matrix protein MMP2 i prostatakræft. Vi har ikke undersøgt den rolle, cystatin C i modulering af cathepsin B aktiviteter i prostatacancerceller, men det er en åben mulighed at der tilsvarende korrelationer i andre typer af tumorer. Proteom signaturer, som er kendetegnende for proteolyse afslørede spaltning af mange kendte MMP-2 substrater i den cellulære kontekst. blev fundet proteomisk beviser for MMP-2 behandling af hidtil ukendte substrater. Cystatin C-proteinet er et af substratet, der spaltes af MMP-2 [40]. Vi giver yderligere beviser understøtter en tidligere foreslået rolle cystatin C for at forhindre tumorigenese og kræft celle invasionsevne, muligvis på grund af dens evne til at inhibere aktiviteten af ​​ekstracellulære matrixproteiner [46], [47].

Vores funktionel analyse i PC-3 celler viste endvidere, at hæmning af cystatin C via siRNA-medieret knockdown resulterede i en betydelig stigning i antallet af invasionen af ​​PC3 celler. Denne observation er i overensstemmelse med tidligere demonstration i primære prostatatumorer hvor de mest invasive tumorer havde meget lav eller målbart cystatin C udtryk. Således kan cystatin C være funktionelt vigtigt for celler til at opretholde en normal adfærd, som er i konkordans med vores nuværende resultater, PC3 celler, der overudtrykker cystatin C via kortvarig transfektion viste mindre invasive fænotyper.

Erk-MAPK-vejen er en fælles signalering mekanisme for flere vækstfaktorer, som er involveret i metastatisk spredning og lægemiddel-resistens [48]. Ved at anvende siRNA mod cystatin C, viste vi, at cystatin C omvendt var forbundet med den invasive opførsel af PC3 celler, og at cystatin C var involveret i reguleringen af ​​Erk-aktivitet.