PLoS ONE: Integration af Gene Dosering og genekspression i ikke-småcellet lungekræft, Identifikation af HSP90 som Potentielle Target

Abstrakt

Baggrund

Lungekræft forårsager cirka 1,2 millioner dødsfald om året verdensplan, og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) repræsenterer 85% af alle lungekræft. Forståelse af de molekylære begivenheder i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er afgørende for at forbedre tidlig diagnose og behandling for denne sygdom.

Metode og vigtigste resultater

I et forsøg på at identificere nye NSCLC relateret gener, vi udførte en genom-dækkende screening af kromosomal kopi nummer ændringer påvirker genekspression ved hjælp microarray baserede komparative genomiske hybridisering og genekspression arrays på 32 radikalt resektion tumor prøver fra fase i og II NSCLC patienter. En integrativ analyse værktøj blev anvendt til at bestemme, om kromosomal kopital påvirker genekspression. Vi identificerede en sletning på 14q32.2-33 som en fælles ændring i NSCLC (44%), som i væsentlig grad påvirket genekspression for HSP90, bosat på 14q32. Denne sletning var korreleret med bedre samlet overlevelse (P = 0,008), overlevelse var også længere i patienter, hvis tumorer havde lave ekspressionsniveauer af HSP90. Vi har udvidet analysen til tre uafhængige validering sæt NSCLC patienter, og bekræftede lav HSP90 udtryk at være relateret med længere samlet overlevelse (P = 0,003, P = 0,07 og P = 0,04). Desuden in vitro-behandling med en HSP90 inhibitor havde potent antiproliferativ aktivitet i NSCLC-cellelinjer.

Konklusioner

Vi foreslår, at målrette HSP90 vil have klinisk betydning for NSCLC patienter.

Henvisning: Gallegos Ruiz MI, Gulv K, Roepman P, Rodriguez JA, Meijer GA, Mooi WJ, et al. (2008) Integration af Gene Dosering og genekspression i ikke-småcellet lungekræft, Identifikation af HSP90 som potentielt mål. PLoS ONE 3 (3): e0001722. doi: 10,1371 /journal.pone.0001722

Academic Redaktør: Christoph Plass, Ohio State University, USA

Modtaget: December 28, 2007; Accepteret: 4 feb 2008; Udgivet: 5 Marts 2008

Copyright: © 2008 Gallegos Ruiz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Paul Roepman er ansat af Agendia BV

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden [1] og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) repræsenterer 85% af lungecancere. En bedre forståelse af de molekylære begivenheder, der ligger til grund for udviklingen og progressionen af ​​sygdommen kan bidrage til at forbedre den kliniske behandling af NSCLC-patienter. Et antal gener, f.eks P53, RAS, P16 og EGFR, har vist sig at ændres i NSCLC [2]. I betragtning af den heterogene og komplekse karakter af denne tumortype, er det sandsynligt, at mange gener køre NSCLC tumorigenese er endnu ikke identificeret.

kromosomfejl findes menes at være kritiske hændelser i human tumorgenese, og flere genomiske regioner ofte huser DNA gevinster (3q, 5p, 7q, 8Q, 11q og 16p) og tab (3p, 4q, 5q, 6Q, 8 p 9P og 13q, 17q) er blevet identificeret i NSCLC patienter [3]. Brug af matrix baseret komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og genekspression mikroarrays, DNA kopital ændringer og genekspression kan måles i hele genomet af tumorceller. Ved at kombinere data fra disse analyser, er det muligt at opnå en integreret genom bred visning af gen doseringsenheder aberrationer og deres virkning på genekspression, som kan hjælpe med at identificere gener vigtige i NSCLC [4].

I foreliggende undersøgelse har vi foretaget en integrativ analyse af kromosomal kopital og genekspression på radikalt resektion tumorprøver fra 32 NSCLC-patienter. To nye algoritmer, “CGH call” [5] og “ACE-det” [6], blev anvendt til at analysere data. Vi identificerede en sletning på kromosom region 14q32.2-33 i 44% af NSCLC-patienter. Denne deletion blev beslægtet med forbedret patientoverlevelse, og blev forbundet med nedsat ekspression af HSP90, en molekylær chaperone i flere oncoproteiner, der bliver udforsket som et hidtil ukendt mål i anticancerterapi. Lav HSP90-ekspression blev korreleret med forbedret overlevelse i de 32 NSCLC-patienter analyseret i første omgang. Yderligere analyse af tre uafhængige sæt af NSCLC patienter bekræftet en signifikant sammenhæng mellem patientens overlevelse og HSP90 udtryk. Desuden

in vitro Salg eksperimenter viser NSCLC cellelinjer at være yderst følsom over for HSP90 inhibitor 17-AAG. Vores data tyder og vigtig rolle for HSP90 i NSCLC.

Metoder

Patienter og prøver

Testen sæt bestod af radikalt resektion tumor prøver af 32 tidlige stadie NSCLC-patienter. Tre patienter havde en overlevelse på mindre end 30 dage, og blev anset for postoperative dødsfald. disse tre patienter er derfor ikke medtaget i overlevelse analyser. Patienterne havde en median opfølgning på 86 måneder (spændvidde 0,4-135,5). Verbal informeret samtykke var blevet indhentet fra alle patienter og håndtering af prøver var i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af den etiske board “subcommissie voor de ethiek van het mensgebonden onderzoek” fra VU University Medical Center i Amsterdam.

Den første validering sæt bestod af 140 radikalt resektion NSCLC patienter fra Europa lungekræft konsortium. Patienterne havde en median opfølgning på 35 måneder. Alle patienter inkluderet havde haft nogen forudgående malignitet, patologisk tumor fase 1 eller 2 (T1-2), node fase 0 + 1 (N0-1), ingen fjernmetastaser (M0) på tidspunktet for operationen, og ingen rest sygdom efter resektion ( R0). Ingen af ​​disse patienter fik (neo) adjuverende kemo- eller strålebehandling. Den anden validering bestod af 111 tidligt stadium NSCLC patienter fra Bild et al. [7]. Den tredje validering sæt bestod af de offentligt tilgængelige “datasæt 1 og 2” fra Lu et al. [8] og indeholdt 54 tidlige stadie NSCLC-patienter. En fuldstændig beskrivelse af patientens karakteristika for alle fire patient sæt findes i tabel 1.

Isolering af genomisk DNA og array Comparative Genomic Hybridisering

Cryo-sektioner af frosne vævsprøver, flankerende afsnittene anvendes til RNA og DNA isolation, blev kontrolleret af undersøgelsen patolog (WM) til at indeholde mindst 50% af tumorcellerne. Genomisk DNA blev ekstraheret fra hver prøve ved anvendelse af Trizol efter producentens instruktioner (Life Technologies, Breda, Holland). DNA-mærkning og hybridisering på CGH 30K oligonukleotid mikroarrays blev udført som beskrevet af van den IJssel et al [9].

RNA isolation og genekspression mikro arrays

RNA isolering og cDNA mærkning efterfulgt standard protokoller . Hybridisering blev udført på Agilent platform i henhold til standardprocedurer, der er beskrevet af fabrikanten og andre steder [10].

Dataanalyse

For vifte CGH, spot analyse og kvalitetskontrol blev udført ved hjælp BlueFuse-version 3.2 ( BlueGenome, Cambridge, UK). Breakpoints, gevinster, tab og amplificeringer blev påvist ved hjælp af algoritmen CGH opkald. Denne algoritme konverterer rå log2ratios absolutte mål for “tab”, “normal”, “gevinst” eller “forstærkning” ved at anvende en segmentering algoritme kombineret med en sandsynlighed blanding model [11]. For at teste, om statistisk genekspression blev påvirket af gendosis påført vi et array CGH udtryk integration værktøj, ACE-det [6], hvori den kaldte arrayet CGH og normaliserede log10 forhold til ekspression arrays blev anvendt som input-data. ACE-det bruger de ensidige Wilcoxon rank sum statistik til at teste hvilke kromosomal kopi nummer afvigelser gentagne påvirke RNA udtryk. Beregnede p-værdier er korrigeret for flere test ved brug af Benjamini Hochberg metoden [12]. ACE-den kun tester gener, der opfylder kriterierne for forurening og balance, som styres via en tærskel på antallet af prøver. Her tærsklen blev fastsat til et fast standardindstillingen 9 prøver, hvilket betyder, at kun de kromosomale positioner blev taget hensyn til, at havde mindst 9 prøver i én CGH kalder status og ikke mere end 9 i anden status. Hele vifte CGH datasættet af testen serien (n = 32) er tilgængelig på GEO-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo, tiltrædelse nummer GSE7878). De genekspression data for både test sæt (n = 32) og validering sæt 1 (n = 140) for de 359 gener identificeret ved ACE-den er tilgængelig på Array Express database (www.ebi.ac.uk/aerep/login, tiltrædelse nummer Array design: A-MEXP-749, Experiment data:. E-TABM-270)

Gene udtryk data til validering sæt 2 blev opnået ved hjælp af Affymetrix Hu133plus2 chips (GEO tiltrædelse nummer GSE3141). Gennemsnittet af de MAS5 beregnede signal intensiteter af fire probesets afsløre HSP90AA1 blev brugt i vores beregninger.

De tredje validering sæt indeholdt genekspression data fra Affymetrix Hu95 og Hu133 chips (GEO tiltrædelse nummer GSE6253). Den Hu95 chip indeholdt en probeset afsløre HSP90AA1 og Hu133 chip indeholdt fire probesets, hvoraf middelværdien af ​​RMA beregnet signalintensiteter blev anvendt i vores beregninger.

Statistik

En univariat cox regression analyse blev udført for at undersøge forholdet genekspressionssystemer værdier med overlevelsestid. Overlevelseskurver blev konstrueret ved anvendelse af Kaplan Meier-metoden og forskelle i den samlede blev vurderet ved anvendelse af log-rank test. I testen sæt blev tre patienter med mindre end 30 dage overlevelsestiden udelukket fra overlevelse analyse, som deres død blev betragtet som kirurgisk dødelighed. For at bestemme de uafhængige virkninger af HSP90 udtryk, histologiske undertype, tumor stadie, alder og køn, blev udført en multivariat Cox regressionsanalyse. AP værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Multiplex Ligation afhængig Probe Amplification (MLPA)

For Multiplex Ligation afhængig Probe Amplification (MLPA), den subtelomere sonde sæt P070 (MRC Holland, Amsterdam, Holland) indeholdende en sonde placeret inden for båndet 14q32.33 (region 104.874.216-105.070.384) blev anvendt. MLPA blev udført ifølge producentens instruktioner ved anvendelse 100 ng DNA som input. DNA isoleret fra blod fra en pulje af sunde donorer blev anvendt som referenceprøve. Probe signaler blev normaliseret ved at dividere toparealet af kromosom 14q af toparealet af kromosom 14p. MLPA genereret 14q /14p nøgletal er plottet mod de gennemsnitlige normaliserede log2ratios af oligoerne i området 104.787.271-105.071.522 fra rækken (i alt 11 oligoer). Denne region dækker området af MLPA proben.

Kvantitativ RT-PCR

For at validere ekspressionssystemer værdier opnået via genekspression arrays, udførte vi kvantitativ real-time PCR under anvendelse TaqMan® teknologi og ABI PRISM 7500 Sequence Detection System instrument udstyret med SDS version 1.3.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Fremad og reverse primere og prober blev designet og produceret af Applied Biosystems for HSP90AA1 (Hs00743767_sH), og for det endogene kontrol genet GUSB (Hs00939626_mi). PCR blev udført i en 25-pi reaktionsvolumen, der indeholdt 50 ng cDNA, 1 x TaqMan Universal PCR Master Mix, og primeren og probesæt til HSP90AA1 og GUSB. Hver prøve blev analyseret i to eksemplarer, og de gennemsnitlige tærskel cyklus (Ct) værdier af hver prøve for GUSB, blev trukket fra de gennemsnitlige Ct-værdier for HSP90AA1. Taqman-genereret ACt værdier blev log transformeret til udtryk værdier og plottet mod Δlog2ratios mellem GUSB og HSP90AA1 fra udtrykket array.

celievækstinhiberingen undersøgelser

væksthæmmende efter

in vitro

eksponering for klinisk anvendte Hsp90 inhibitor 17-AAG (InvivoGen, San Diego, CA) blev undersøgt i 4 EGFR vildtype NSCLC cellelinier (H460, H157, H441 og A549, opnået fra Drs. P. Dennis og F. Kaye , NCI, Bethesda, MD). Kort fortalt 10

5-celler blev podet i 6-brønds vævskulturplader (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), fik lov til at klæbe, og derefter kontinuerligt udsættes for forskellige koncentrationer af 17-AAG (0, 10, 30 , 100, 300, 1000 nM) i 24, 48 eller 72 timer. På hvert tidspunkt blev celler løsnet fra brøndene, inkuberet med trypanblåt, og levedygtige (trypan blå-eksklusive) celleantallet blev bestemt tre gange under anvendelse af et hæmacytometer. Det gennemsnitlige celleantal med standardfejllinjer er vist ved hvert tidspunkt. Desuden IC50

(lægemiddel koncentration, hvor 50% væksthæmning opnås) af 17-AAG efter 72 timer blev bestemt for hver cellelinie.

Resultater Salg

Gene dosering -relaterede genekspression ændringer i NSCLC

Kromosomale afvigelser var rigelige i de 32 NSCLC patienter analyseret. For at identificere breakpoints af gevinster og tab påført vi algoritmen CGH opkald [11]. I tabel 2 de kromosomale regioner, hvor gevinster eller tab var til stede i mindst 20% af patienterne er angivet. Den statistiske værktøj ACE-det [6] blev anvendt til at bestemme, om genkopital påvirket genekspression. I alt 359 udskrifter viste sig at blive væsentligt påvirket af kopi nummer. I figur 1 områderne berørte gener er angivet for 32 NSCLC patienter, vist med grønt (vundet regioner) eller rød (mistede regioner).

Resume plot for kaldte gevinster og tab i 32 resektion NSCLC patienter med DNA-kopi nummerændringer angivet i gråt. Positive værdier viser procentdelen af ​​prøver fundet med en gevinst. Negative værdier angiver den procentdel af prøver huser et tab på den angivne kromosom placering. Gener i bestemte områder, der berøres af kopi nummer gevinst er angivet i grønt og gener, der berøres af kopi nummer tab er angivet med rødt. Et udvalg af de berørte gener er angivet. Den fulde liste over 359 berørte udskrifter kan findes i supplerende tabel S1.

En univariat cox regression overlevelse analyse blev udført for ekspression af alle 359 gener, der blev identificeret til at være påvirket af kopi nummer (se supplerende tabel S1). Efter flere korrektion test (ved hjælp af Benjamini Hochberg metode) ingen af ​​359 gener fortsat betydelig for overlevelse på denne lille patient sæt (n = 32). Den øverste liste af gener korreleret med overlevelse (rangeret på rå p-værdier) indeholdt hovedsageligt gener placeret på kromosomerne 3 og 5 vundet regioner. Vi også observeret ét gen i top-20 liste, HSP90AA1, placeret på kromosom 14. HSP90AA1 gen (generelt benævnt HSP90), som ligger på 14q32.2, var den eneste genet i denne region med signifikant reduceret ekspression i patienter ramt ved tab af denne region (P = 0,05). Disse observationer fik os til at undersøge dette locus i flere detaljer.

Genomisk afvigelser på 14q og HSP90AA1 genekspression korrelation med overlevelse

Vi undersøgte sammenhængen af ​​den tilbagevendende stramme sletning ved region 14q32.2- 33, med overlevelse. Interessant patienter hvor denne region blev deleteret havde en forbedret samlet overlevelse (OS) sammenlignet med patienter, der huser et normalt gen dosering i dette locus (5-årligt OS 69% vs. 41%, p = 0,004-figur 2A).

(A) Kaplan-Meier kurver for samlet overlevelse er vist for 29 patienter i forhold til gen-dosering i kromosom region 14q32.33. (B) Samlet overlevelse for 29 patienter i forhold til HSP90 udtryk. Lav ekspression blev defineret som udtryk lavere end medianen af ​​de samlede 32 prøver, “normal” ekspression blev defineret som højere end medianen af ​​32 prøver. Tre af 32 patienter indgår i analysen af ​​gen dosering og udtryk blev udelukket fra overlevelse analyse på grund af en overlevelse på mindre end 30 dage.

For at undersøge HSP90 udtryk i forhold til overlevelse, vi opdelt 32 patienter i to grupper baseret på deres overlevelse status to år efter tumorresektion. Omkring halvdelen af ​​patienterne blev kategoriseret som “høj-risiko” og halvdelen som “lav-risiko”. At identificere, om begge risikogrupper kunne blive diskrimineret ved hjælp genekspression af HSP90, konstrueret vi Kaplan Meier overlevelse estimater for to lige store grupper med “lav” og “normal”, baseret på medianen HSP90 udtryk. Lav ekspression af HSP90 var forbundet med bedre samlet overlevelse (5-årligt OS 70% vs. 40%, p = 0,13-figur 2B) selv om forskellene mellem de to grupper var oprindeligt ikke signifikant, sandsynligvis på grund af en kombination af en lav størrelsesorden af ​​forskellen og et lavt antal patienter analyseret.

Teknisk validering af 14q sletning og HSP90 udtryk

for at validere sletningen observeret i region 14q32.2-33 vi udførte multiplex ligation afhængig sonde forstærkning [13] (MLPA) analyse under anvendelse af en subtelomere probeset indeholdende en sonde i område 14q32.33. Korrelationskoefficienten (R

2) mellem tabet af dette område opdaget af vifte CGH og MLPA var 0,439.

For at validere HSP90 udtryk data opnået med mikroarrays vi udførte kvantitativ RT-PCR ved hjælp af TaqMan® teknologi. En god korrelation mellem ekspression af HSP90 målt med de to forskellige teknikker blev observeret (R

2 = 0,6431).

Validering af HSP90 udtryk og relation med overlevelse i uafhængige patient- serie

for yderligere at undersøge sammenhængen mellem lav HSP90 udtryk og NSCLC patient prognose, vi brugte tre uafhængige validering sæt NSCLC patienter. I alle tre patientgrupper sæt, den “lav-risiko” /”høj-risiko” patient fordeling på tværs patientkohorter var ca. to tredjedele vs. en tredjedel. Derfor brugte vi 33-percentil af HSP90 udtryk som afskåret til adskillelse af patienter med “normale” (dvs. høj-risiko) og “lav” (dvs. lav risiko) udtryk. For alle tre validering sæt, var lav ekspression af HSP90 korreleret med forbedret samlet overlevelse. Denne korrelation var signifikant for den første og tredje validering sæt (P = 0,003 og P = 0,04), og grænsesignifikant for det andet sæt (P = 0,07) (Figur 3). Multivariat analyse viste, at HSP90 prognostiske værdi var uafhængig fra scenen, histologiske undertype, alder og køn af patienter (tabel 3).

Samlet overlevelse for (A) 140 patienter med NSCLC, validering sæt 1 (B) 111 NSCLC patienter, validering sæt 2 og (C) 54 patienter med NSCLC, validering sæt 3. afskåret for skelnen mellem lav og “normale” udtryk var baseret på 33-percentil af udtryk værdier.

Validering af Hsp90 som et levedygtigt molekylært mål i et panel af NSCLC cellelinier

Hsp90 er en molekylær chaperone, som stabiliserer flere oncoproteiner, herunder EGFR, og udgør et nyt potentielt mål for anticancerterapi. Dataene ovenfor viste, at Hsp90 ekspressionsniveau er en prognostisk indikator for langtidsoverlevelse i en stor serie af NSCLC-patienter, og antyder, at Hsp90-inhibitorer kan have bredere anvendelighed i denne sygdom end tidligere anerkendt. For at undersøge denne mulighed, testede vi, om farmakologisk inhibering af Hsp90-funktion ville påvirke

in vitro

cellevækst af et panel af NSCLC-cellelinier. Væksten i disse cellelinjer, alle bærende vildtype EGFR, var dybt hæmmet, i en dosis- og tidsafhængig måde ved sub-mikromolær koncentrationer af 17-AAG, en Hsp90 hæmmer [14] i øjeblikket i fase II kliniske forsøg (figur 4). Efter 72 timer, IC50 var under 50 nM 17-AAG i alle tilfælde, og højere medikamentkoncentrationer resulterede konsistent i markant cytotoksicitet.

(A-D) tids- og dosisafhængig inhibering af in vitro-vækst af H460, H157, H441, og A549 NSCLC cellelinjer efter eksponering for 17-AAG. Celler blev podet ved 105 /brønd, og levedygtige celler blev bestemt på efterfølgende dage som beskrevet i Methods. 17-AAG-koncentrationer på (H441) eller over (A549, H460 H157) resulterede 30 nM ensartet i tidsafhængig tab af cellelevedygtighed. IC50-værdien af ​​17-AAG (kontinuert eksponering i 72 h) for hver cellelinje er som følger:. H460 = 30 nM, H157 = 15 nM, H441 = 8 nM, og A549 = 20 nM

diskussion

Baseret på matrix-CGH data i NSCLC, det har vist sig, at der findes flere molekylære carcinogenese veje, der er sandsynligvis relateret til køn og rygevaner [15]. Det blev endvidere vist, at der er en stor overlapning mellem aberrationer observeret i adenocarcinom og pladecellecarcinom subtype, bortset 3Q gevinster som synes at være mere specifik for pladecellecarcinom subtype [16]. Forskellige genekspression underskrifter er blevet korreleret til overlevelse NSCLC-patienter [17] – [19]. Desuden har molekylære undersøgelser muliggjorde udviklingen af ​​individualiserede behandlingsmetoder i flere tumortyper [20] – [22]. Det er dog sandsynligt, at mange cancer-beslægtede målgener endnu ikke blevet identificeret. I denne henseende har integreret genom bred screening af kopital ændringer og genekspression ved anvendelse microarrays for nylig blevet udført i forskellige tumortyper at identificere gener, hvis ekspression påvirkes af gendosis [4], [23] – [26]. Disse undersøgelser til formål at identificere hidtil ukendte cancerrelaterede gener og definere hidtil ukendte biomarkører for respons eller prognostiske signaturer. I både NSCLC og ductal kræft i bugspytkirtlen, har to fokale amplifikationer af 8p12 og 20q11 blevet undersøgt i detaljer, der fører til to kandidat gener (WHSC1L1 og TPX2) vigtige i disse sygdomme [16]

Vi her foretaget en integreret genom bredt screening af genkopital ændringer og genekspression i 32 radikalt resektion NSCLC-patienter, for at identificere hidtil ukendte NSCLC-relaterede gener. Ved at bruge ACE-det, en roman informatik værktøj til integration af gen dosering og genekspression data, vi identificeret 359 udskrifter til betydeligt berørt af kopi nummer. En cox overlevelse analyse på alle 359 gener viste ingen signifikant relation efter flere test. Den øverste liste over gener relateret til overlevelse primært inkluderet gener bosiddende på vundet regioner 3q og 5p. Disse regioner omfatter mange gener og for at lokalisere genet af størst betydning er en udfordrende opgave. Yderligere undersøgelser skal belyse betydningen af ​​disse gener i forhold til NSCLC, især dem i den øverste liste af korrelation med overlevelse som SLC45A2, WDR70 og NIPBL (se supplerende tabel S1). I dette papir vi fokuseret på tilbagevendende deletion på kromosom 14 og genet HSP90, som også var i den øverste liste over forhold med overlevelse og ikke tidligere undersøgt i detaljer. Deletion af regionen 14q32.2-33 var korreleret med forbedret overlevelse, hvilket yderligere antyder, at det kan indeholde et eller flere gener relateret til NSCLC progression. Sletning af denne region er tidligere blevet beskrevet af en gruppe rapporterer genomiske afvigelser i NSCLC, men blev ikke undersøgt nærmere [27]. Ud af de 109 gener kortlægning til 14q32.2-33 region, HSP90 var den eneste gen med signifikant lavere ekspression i patienter, der huser 14q32.2-33 sletningen. I den indledende serie på 29 patienter (3 patienter er udelukket fra overlevelse analyse), observerede vi forbedret overlevelse hos patienter med lavere niveauer af HSP90. Sammenhængen mellem HSP90 ekspressionsniveauerne og NSCLC patient prognose blev bekræftet at være betydelig i tre uafhængige validering sæt NSCLC patienter. Multivariat analyse herunder fase, histologi, alder og køn viste, at HSP90 forblev uafhængigt relateret til overlevelse.

Et kritisk punkt i definitionen “lav” og “normal” udtryk er valget af en passende afskåret værdi. I de indledende analyser brugte vi medianen af ​​udtryk nøgletal som afskåret mellem “lav” og “normal” udtryk, da lav risiko og høj risiko adskillelse af patienter var lig. Men i valideringen sætter, lav risiko og overlevelse grupper højrisiko var ikke lige afbalanceret (to tredjedele versus en tredjedel). Derfor er de afskårne værdier anvendt i disse datasæt var ikke medianværdien, men den 33-percentilen.

I denne undersøgelse under anvendelse af en genom bred integrativ analyse af genkopital og ekspression kunne vi identificere ekspression af HSP90 som et vigtigt gen i begyndelsen af ​​fase NSCLC patienter. HSP90 er en chaperone protein involveret i stabiliseringen af ​​flere oncoproteiner såsom EGFR, Her-2 og Akt [28]. Nyligt arbejde har vist, at HSP90 spiller en rolle i at bevare den aktive konformation af EGFR særlig EGFR mutanter [29], [30]. Vi viser her, at flere NSCLC cellelinjer der bærer vild type EGFR er følsomme over for HSP90 inhibition, hvilket indikerer, at den inhiberende virkning af 17-AAG ikke udelukkende kan tilskrives mutant EGFR. HSP90 er for nylig blevet anerkendt som et potentielt kræft terapeutisk mål og undersøgelser af HSP90 hæmmere er i gang [31], [32]. I denne henseende glioblastomceller overudtrykker EGFR, men resistent over for inhibering med EGFR-kinaseinhibitorer, var følsomme for HSP90 inhibition [33]. Derfor, mens Hsp90 kan være nødvendigt at stabilisere overudtrykt eller muteret EGFR, støtter vores data en mere omfattende og kompleks rolle for Hsp90 i mediere NSCLC vækst og overlevelse. Den lave nanomolær følsomhed observeret i de 4 celle testet i vores eksperimenter linjer, er i overensstemmelse med andre offentliggjorte rapporter om meget 17-AAG følsomme tumorcellelinjer [34] – [36]. Disse koncentrationer er let opnåelige hos patienter i længere perioder ved hjælp af aktuelle planlægning og doseringsregimer [37].

Sammenfattende den observation, at HSP90 udtryk niveau er en prognostisk faktor for NSCLC patient overlevelse (uafhængigt af EGFR mutationsstatus ), kombineret med den ekstreme følsomhed EGFR vildtype NSCLC celler til Hsp90 inhibitor 17-AAG, tyder på, at Hsp90 hæmmere kan have større klinisk anvendelighed i NSCLC end tidligere er blevet behandlet og berettiger yderligere undersøgelse af afhængighed af andre proto-onkogener på denne chaperone protein i NSCLC.

Støtte Information

tabel S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001722.s001

(0,03 MB PDF)

Tak

Vi takker det europæiske lungekræft konsortium for at give microarray genekspression data for 140 uafhængige NSCLC patienter; Holland Cancer Institute: Sjaak Burgers, Tony van de Velde; Medical University of Gdansk: Jacek Jassem, Amelia Szymanowska, Marcin Skrzypski, Barbara Szostakiewicz, Witold Rzyman; Medical University of Bialystok: Jerzy Laudanski, Miroslaw Kozlowski, Lech Chyczewski; Thoraxklinik Heidelberg: Michael Meister, Philipp A. Schnabel, Henrik Dienemann og Hans Hoffman. Vi giver også vores særlige tak til Sjoerd Vosse (Patologisk Institut, VU University Medical Center, Amsterdam, Holland) til nyttige bioinformatik diskussioner og til Hans Gille (Klinisk Genetisk Afdeling, VU ​​University Medical Center, Amsterdam, Holland) til at udføre MLPA analyse.