PLoS ONE: Tumor Stress-induceret Phosphoprotein1 (STIP1) som prognostisk Biomarkør i kræft i æggestokkene

Abstrakte

Stress-induceret phosphoprotein en (STIP1) er for nylig blevet identificeret som en frigivet biomarkør i human kræft i æggestokkene. Desuden har STIP1 secerneres af humane ovariecancerceller vist sig at fremme tumorcelleproliferation ved at binde til Alk2 (activin A receptor, type II-lignende kinase 2) og aktivering af SMAD-ID3 signalveje. I denne undersøgelse blev i alt 330 ovariecancer tumorprøver evalueret for STIP1 ekspression ved immunhistokemi og analyseret for en mulig sammenhæng med patientens karakteristika og overlevelse. Kvantificeringen af ​​immunreaktivitet blev udført ved at påføre en immunhistokemisk scoresystem (histoscore). Patienter med højt niveau STIP1 udtryk (histoscore ≥169) havde en signifikant dårligere overlevelse (høj STIP1, gennemsnitlige overlevelsestid = 76 måneder lav STIP1, gennemsnitlige overlevelsestid = 112 måneder

P

0,0001). Desuden STIP1 histoscores var signifikant højere i high-grade tumorer (grad 3) end i lav kvalitet (grad 1-2) maligniteter (

P

0,0001), hvilket tyder på, at STIP1 kan være en proxy for tumor aggressivitet. Resultaterne af multivariabel analyse afslørede, at høj STIP1 histoscores, fremskredne stadier, histologiske typer samt tilstedeværelsen af ​​resterende sygdom (≥2 cm) var uafhængige prædiktorer for dårlig prognose. Tilføjelsen af ​​STIP1 histoscores forbedret forudsigelse af de overordnede og progressionsfri overlevelse i multivariable Cox proportional hazard model. Behandlingen af ​​kræft i æggestokkene celler med rekombinant STIP1 stimuleret celleproliferation og migration, men samtidig behandling med anti-STIP1 antistoffer ophævede denne virkning. Vores resultater antyder, at STIP1 ekspression kan være relateret til prognose og at STIP1 pathway kan repræsentere en hidtil ukendt terapeutisk mål for human ovariecancer

Henvisning:. Chao A, Lai CH, Tsai CL, Hsueh S, Hsueh C, lin CY, et al. (2013) Tumor Stress-induceret Phosphoprotein1 (STIP1) som prognostisk Biomarkør i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 8 (2): e57084. doi: 10,1371 /journal.pone.0057084

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: 6. oktober, 2012; Accepteret: 16 Januar 2013; Publiceret: 27 feb 2013

Copyright: © 2013 Chao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Science Council (NSC100-2314-B-182-016MY3 til THW), Chang Gung Medical Research Foundation (CMRPG391451 /2 til AC, CMRPG 391461/2 til THW), og Department of Health ( DOH101-TD-i-111-TM013 til THW, DOH101-TD-C-111-006 til AC og THW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelovariecancer er en af ​​de mest dødelige maligniteter påvirker kvinder [1]. Næsten 225.500 ovariecancer nye tilfælde forekommer over hele verden hvert år, der er ansvarlige for 140,200 dødsfald [2]. Ovariecarcinomer omfatter en heterogen gruppe af neoplasmer, de fire mest almindelige histologiske undertyper bliver serøs, endometrioide, klar celle, og mucinøs [3]. Målingen af ​​serum cancer antigen 125 (CA125) niveauer er blevet almindelig praksis for den præoperative vurdering af masserne æggestokkene [4]. Desuden har CA125 vist sig at være nyttig til overvågning terapeutisk respons og i overvågningen af ​​patienter med epitelial ovariecancer [5]. Dog er CA125 ikke forhøjet i alle ovarietumorer og ikke har tilstrækkelig positiv prædiktiv værdi for vurdering populationsbaseret risiko eller tidlig påvisning [6]. På grund af de begrænsninger af CA125 som en sygdom markør, der er et presserende behov for nye biomarkører, der kan bruges som prognostiske indikatorer i kræft i æggestokkene til effektivt at skelne mellem aggressiv og mindre aggressiv sygdom.

Den seneste teknologiske fremskridt, især inden for genomforskning og proteomics, der fremskynde opdagelsen af ​​nye kræft biomarkører [7], [8]. Ved at sammenligne proteomer af tumoren interstitiel væske (TIF) og den normale interstitiel væske (NIF), har vi for nylig identificeret stressinduceret phosphoprotein 1 (STIP1) som kandidat biomarkør for humant ovariecancer [9]. Serum STIP1 niveauer er signifikant højere hos patienter med kræft i æggestokkene end i alders-matchede raske kontrolpersoner [9], og falde markant efter kirurgisk fjernelse af tumoren [10]. Desuden har den kombinerede måling af CA125 og STIP1 vist sig at forbedre tidlig påvisning af ovariecancer [9], støtter den kliniske anvendelighed af STIP1 som biomarkør i denne malignitet [11].

STIP1, også kendt som Hsp70 /Hsp90-organisering protein (HOP), transformation-følsomme protein IEF SSP 3521 (IEF-SSP-3521), P60, STI1, STI1L, (GeneID 10963; HPRD 05.454), en 62,6 kDa protein, indeholder tre tetratricopeptide gentagelse (TPR) domæner [12], der er i stand til at interagere med varmechokproteiner at danne komplekser, der deltager i forskellige biologiske processer lige fra RNA splejsning, transskription, protein foldning, signaltransduktion, og cellecyklus regulering [13], [14]. I neuronale væv, ekstracellulær STIP1 binder til prionproteiner og udløser forskellige signalveje – herunder det endogene mitogenaktiveret proteinkinase 1/2 (ERK1 /ERK2), proteinkinase A, og phosphatidylinositol 3-kinase signaleringskaskader – i sidste ende fører til en stigning i celledeling [15], [16], [17]. I ovariecancer, har vi vist, at STIP1 binder til et knoglemorfogenetisk protein (BMP) receptor – betegnet activin receptoren, type II-lignende kinase 2 (Alk2) – for at aktivere SMAD signalvejen og den transkriptionelle aktivering af ID3 (inhibitor af DNA-binding 3) [10]. Tilsammen tyder disse resultater på, at STIP1 udskilles af humane ovariecancerceller fremmer kræft celledeling ved at handle i en autokrin og /eller parakrin måde.

Selv om frigivelsen af ​​STIP1 fra human ovariecancer er blevet bekræftet af en uafhængig forskergruppe [18], findes få data om nytten af ​​STIP1 immunhistokemisk analyse til vurdering af prognosen i ovariecancer [19]. I denne undersøgelse blev der i alt 330 æggestokkene kræft tumorprøver evalueret for STIP1 udtryk ved immunhistokemi og analyseret for en mulig sammenhæng med patientens karakteristika og overlevelse.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og blev godkendt af Institutional Review Board i Chang Gung Memorial Hospital (CGMH-IRB # 99-0112B og # 97-1444C).

Patienter

Mellem 2000 og 2005, i alt 403 konsekutive patienter diagnosticeret med kræft i æggestokkene på Linkou Medical Centre of Chang Gung Memorial Hospital blev inkluderet i undersøgelsen. De histologiske typer var som følger: serøs (n = 160), mucinøs (n = 68), endometrioide (n = 73), clear cell carcinoma (n = 64), og blandet celletype (n = 38). Udelukkelseskriterierne var som følger: (i) patienter, som gennemgik neoadjuverende terapi før konkret kirurgi eller der blev henvist fra uden for hospitalerne efter den første operation; (Ii) patienter, som gennemgik laparoskopisk kirurgi som primær behandling; (Iii) patienter, som ikke blev fulgt op i de første tre måneder efter primær behandling; (Iv) patienter med udifferentierede karcinomer opstår i teratomer; og (v) patienter med utilgængelige patologiske paraffinblokke. Progressionsfri overlevelse (PFS) blev beregnet som tidsintervallet (i måneder) fra datoen for kirurgi til datoen for dokumenteret sygdomsprogression (retrospektivt defineret på grundlag af forhøjelse af serum CA125 og /eller radiografiske tegn på progression). Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tidsintervallet mellem datoen for operationen og datoen for døden.

Immunhistokemi

arkiver formalinfikserede, paraffinindstøbte ovariecancer vævssnit var hentes som tidligere beskrevet [9], [20], [21]. Snittene blev farvet med et primært muse-anti-humant STIP1 monoklonalt antistof (Abnova Corp., Taipei, Taiwan; 1:1,800 fortynding) anvendelse af en automatiseret immunhistokemi farvningsværktøjet med Ventana Basic DAB (3,3-diaminobenzidin) Detection kit (Tucson, AZ, USA). Glassene blev evalueret uafhængigt af to patologer (S.H. og C. H.), som blev blindet til de klinisk-patologiske data og patients’identities. Den samlede immunhistokemisk score (histoscore) blev udtrykt som procentdelen af ​​positive tumorceller (0-100%) multipliceret med deres farvningsintensitet (0 = negativ, 1 = svag, 2 = moderat, 3 = stærk). Derfor bør det samlede histoscore mellem 0 og 300 [22]. Valideringen af ​​anti-STIP1 antistofspecificitet blev udført ved at blokere antistofferne med 400 nM af rekombinant human STIP1 protein (rhSTIP1) under inkubationen trin med anti-STIP1.

Cell Culture

æggestokkene cancercellelinier (BG1, MDAH2774) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler blev dyrket i 10% FBS, penicillin (100 enheder /ml), streptomycin (100 enheder /ml) og DMEM /F12-medium ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære.

cellemigrationsassay

BG1 og MDAH2774 celler (10

6 /brønd) – behandlet med enten rhSTIP1 (400 nM) eller bæreren alene – blev dyrket i serum-frit medium i 24 timer. Celler blev derefter udpladet i det øverste kammer i et Transwell (24 brønde, 8 um porestørrelse, Corning Inc., Corning, NY, USA). Det nedre kammer blev fyldt med 800 pi DMEM /F12 og 0,5 ug /ml fibronectin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Efter 26 timers inkubation blev celler, der var migreret gennem porerne og klæbet til den nedre membran farvet med fluorescein og calcein-AM (4 ug /mL; BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Antallet af levedygtige celler, der var gennemskåret filteret blev bestemt ved fluorescens måling af hver prøve under anvendelse af et Tecan Infinite M200 Multiwell reader (Tecan, Männedorf, Schweiz). Neutralisering af STIP1 blev udført under anvendelse af et anti-STIP1 antistof (800 nM). Alle assays blev gentaget mindst tre gange.

sårlukning Assay

For at undersøge effekten af ​​STIP1 på cellemigrering, MDAH2774 celler (10

6 /brønd), der blev enten behandlet med 400 nM rhSTIP1 eller køretøjet blev podet i 3,5 cm skåle efter 24 timers dyrkning i serum-frit medium. Mediet blev derefter erstattet med en, der indeholdt 0,4% FBS. Cellemigrering observeret gennem en åbning. Fasekontrast billeder af hullerne blev indfanget ved baseline og efter 24 timers behandling med et omvendt mikroskop (forstørrelse, 10 ×). Den WimScratch software (Wimasis, München, Tyskland) blev anvendt til analyse af sårlukning [23].

Cell Levedygtighed Assay under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl (MTT)

omdannelsen af ​​de gule tetrazoliumsalte til lilla formazon krystaller ved mitokondrier blev anvendt som proxy for cellelevedygtighed. I 48-brønds plader, 5 × 10

4-celler blev dyrket i 200 pi medium per brønd natten over. Tyve pi af MTT-reagens blev tilsat til hver brønd, og efter 4 h blev 200 pi solubilisering opløsning (10% SDS i 0,01 M HCI) per brønd tilsat natten over. Absorbansen blev bestemt ved 570 nm i en mikroplade spektrofotometer (PerkinElmer Life Science). For at teste effekten af ​​knockdown af STIP1 på cellelevedygtighed blev ovariecancerceller transficeret med 50 nM dobbeltstrenget siRNA målrettet STIP1 eller kontrollere siRNA i Lipofectamin RNAimas (Invitrogen, Calsbad, CA), som vi tidligere rapporteret [10]. Efter 48 timers transfektion blev cellerne subdyrket i pladen for MTT-analyser.

bromdeoxyuridin (BrdU) Inkorporering Assay

For at undersøge effekten af ​​STIP1 på celleproliferation, BG1 og MDAH2774 celler (10

4 celler /brønd) blev dyrket i komplet medium i 24 timer, efterfulgt af 72 timer af serum sult. Cellerne blev derefter behandlet med enten 400 nM rhSTIP1 eller køretøjet i 24 timer. DNA-syntese blev analyseret med celleproliferation ELISA, BrdU Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) under anvendelse kolorimetrisk detektion ifølge fabrikantens protokol [21], [23]. Neutralisering af exogent STIP1 blev udført ved anvendelse af anti-STIP1 antistof (800 nM).

Ki67 Immuncytokemisk Assay

BG1 og MDAH2774 celler blev serum sultet i 72 timer og derefter behandlet med enten 400 nM af rhSTIP1 eller køretøjet i 24 timer. Den proliferative aktivitet blev testet ved immuncytokemisk farvning af Ki67 anvendelse af et monoklonalt antistof mod Ki67 (NeoMarker, Fremont, CA, USA).

Statistical Analysis

Forskellene i histoscore mellem to grupper blev sammenlignet ved anvendelse af Mann-Whitney

U

test. Kruskal-Wallis test blev anvendt til sammenligning af mere end to grupper. Evne STIP1 histoscores at skelne mellem det overlevede og afdøde patienter blev vurderet ved at plotte receiver drift egenskaber (ROC) kurve, der forbinder den sande positive rate (følsomhed) til falsk positiv rate (1-specificitet) og ved at beregne areal under kurven (AUC). Tidsafhængige ROC kurver blev anvendt til at vurdere AUC på forskellige tidspunkter [24]. Cox proportionel risiko regressions analyse blev anvendt til at identificere de uafhængige prædiktorer for OS og PFS. Alle variable med univariate foreninger på

P

0,05 blev indgået den multivariable model. For at undersøge virkningen af ​​at tilføje STIP1 til prognostisk Cox model for patienter med invasiv ovariecancer, vi trækkes den afvigelse af modellen med tilføjelse af STIP1 fra afvigelse af modellen uden STIP1. Forskellen blev testet mod en chi-square fordeling med frihedsgrader svarende til forskellen mellem de frihedsgrader for de to modeller (enten med eller uden STIP1) [25]. Resultaterne er præsenteret som justerede hazard ratio (HR) og intervaller 95% sikkerhedsgrænser (CI). Alle analyser blev udført under anvendelse af SPSS 17.0 statistisk pakke (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Vi brugte R pakken

survivalROC

(R-version 2.15.1; R fundament for Statistisk Computing, Wien, Østrig) til beregning af tidsafhængige ROC kurver. To-tailed

P

værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

En High STIP1 Immunhistokemisk Expression er forbundet med høj-scene, High-grade, og invasive Kræft i æggestokkene

resultatet af immunhistokemi (IHC) viste, at behandling med en overskydende mængde af rekombinant STIP1 helt ophævede den immun-anerkendelse af væv STIP1 af anti-STIP1, hvilket bekræfter specificiteten af ​​anti-STIP1 antistof, der anvendes i denne undersøgelse (figur 1A-D). For identiske anti-STIP1 antistof, der anvendes i IHC i hele denne undersøgelse, western blot-analyse af flere ovarian cancer cellelinjer også bekræftet dets specificitet i anerkendelsen STIP1 (fig S1). Forskellene i STIP1 immunhistokemisk farvning er vist i figur 1E-G.

STIP1 udtrykt i cytoplasmaet i ovariecancerceller farves brun. Immunreaktiviteten af ​​STIP1 til anti-STIP1 antistof i cancervæv (A, C) blev ophævet ved tilsætning af 15 ug af rekombinant human STIP1 under inkubation (B, D); disse resultater understøtter specificiteten af ​​den anti-STIP1 antistof. Intensiteten af ​​STIP1 farvning blev gradueret som 1 (E), 2 (F), og 3 (G). Alle de dias, der præsenteres her var fra æggestokkene serøse carcinomer. Skalaen søjler repræsenterer 100 um (A, B) eller 20 um (C-G)

I alt 330 patienter med kræft i æggestokkene (median alder, 50,7 år. Rækkevidde, 17-90 år ) blev inkluderet i undersøgelsen. De generelle egenskaber undersøgelsens patienter er vist i tabel 1. Af de 50 patienter med borderline tumorer i æggestokkene (BOT), 49 (98%) var i fase I eller II. Derimod 146 (52,1%) af de 280 patienter med invasiv cancer var i stadium III eller IV. Serøs carcinoma var den mest almindelige histologiske subtype. Højere STIP1 histoscores var signifikant forbundet med højere alder (≥ 50 år), fremskredent stadium, tilstedeværelsen af ​​ikke-mucinøse kræftformer (serøs, klar celle eller endometrioide carcinomer), klasse 3, invasiv cancer højere CA125 niveauer (≥35 U /ml), og suboptimal primær kirurgisk cytoreduktion (residual sygdom ≥2 cm) (tabel 1).

En High STIP1 Immunhistokemisk Expression er forbundet med nedsat samlet overlevelse (OS)

median varighed af opfølgning var 69,3 måneder (interval, 4-130 måneder). For at undersøge den potentielle nytte af STIP1 immunhistokemisk udtryk som biomarkør i kræft i æggestokkene, brugte vi ROC-kurven at kvantificere, hvor godt forskellige histoscores kunne anvendes til forudsigelse af overlevelse. Fordi et minimum opfølgning på 3 år var påkrævet for overlevelse analyse fastsættes af ROC-kurven, blev i alt 245 patienter inkluderet i denne analyse. Den optimale cutoff for STIP1 histoscore til at skelne mellem patienter, der overlevede (n = 191) og dem, der døde (n = 54) var 169 (følsomhed = 0,889, specificitet = 0,492). I analysen af ​​alle undersøgte patienter, herunder både invasive (n = 280) og grænsetilfælde (n = 50), den kumulative OS af patienterne med STIP1≤169 (n = 119) var signifikant højere (

P

0,0001) end dem med en score 169 (n = 211) i Kaplan-Meier analyse. Den gennemsnitlige overlevelsestid perioder var 112 og 76 måneder, (figur 2A)

Kaplan-Meier-kurve analyser for samlet overlevelse viste, at kvinder med et STIP1 histoscore . 169 (rød linje) havde en signifikant lavere samlet overlevelse end dem med en STIP1 histoscore ≤169 (blå linje). Statistiske betydninger (

P

0,0001) blev påvist i analyserne af (A) alle tilfælde (n = 330), herunder invasiv kræft og borderline tumor (BOT), (B) invasive æggestokkene kræftformer i alle celletyper (n = 280), og (C) kun invasive serøs type ovariecancere (n = 107).

Fordi borderline ovarietumorer generelt er kendetegnet ved en god prognose og er ikke almindeligt medtaget i æggestokkene kræft kliniske forsøg blev den uafhængige prognostiske betydning af STIP1 niveauer analyseres kun i undergruppen af ​​patienter med invasiv ovariecancer (n = 280). Resultaterne af multivariat analyse viste, at STIP1 histoscores 169 var uafhængige, signifikant prognostisk faktor for OS (

P

0,005) og for PFS (

P

0,05) (Tabel 2 ). Kaplan-Meier-analyser også afsløret, at STIP1 histoscores 169 var signifikant forbundet med dårlig OS både i alle invasive tilfælde af denne undersøgelse (n = 280) (Figur 2B) og i invasive serøs ovariecancer (n = 170) (Figur 2C) .

en High STIP1 Immunhistokemisk Expression er forbundet med høj kvalitet tumorer

Histologisk sortering er en vigtig parameter for vurderingen af ​​patienter risiko med kræft i æggestokkene. Som det fremgår af tabel 1, at STIP1 histoscores var signifikant højere i høj kvalitet (grad 3) tumorer end i lav kvalitet (grad 1-2) maligniteter (

P

0,0001). Vi yderligere undersøgt den kliniske betydning af STIP1 immunoexpression i æggestokkene efter deres histologiske type og kvalitet. De fleste af grad 3 tumorer viste en STIP1 histoscore 169; navnlig 92,8% (77/83) af det serøs type, 92,3% (12/13) af endometrioide, og 76,5% (13/17) af de blandede typen karcinomer viste en høj STIP1 ekspression. Af de 57 klare celle i æggestokkene kræftformer som normalt ikke sorterede [3], 40 (70,2%) udviste en STIP1 histoscore 169. De kumulative OS satser for patienter med lav kvalitet (klasse 1-2) maligniteter var væsentligt højere end for patienter med grad 3 maligniteter (

P

0,0001). De gennemsnitlige overlevelse perioder var 102 og 66 måneder, (figur S2). Tilsammen indikerer disse resultater, at høje STIP1 histoscores er forbundet med en særlig aggressiv adfærd i kræft i æggestokkene.

Tilføjelsen af ​​STIP1 Histoscores Forbedrer den prognostiske Stratificering af patienter med invasiv ovariecancer

For at teste hvorvidt STIP1 histoscores forudsat oplysninger ud over aktuelt anvendte tumor sortering og iscenesættelse, vi analyserede virkningen af ​​STIP1 niveauer på klinisk overlevelse hos patienter med de samme kvaliteter eller samme kliniske faser. Hos patienter med grad 3 ovariecancer, patienter med STIP1 169 (n = 102) havde en signifikant (P = 0,022) værre 5-års overlevelse på 44,5% end 63,6% hos dem med STIP1≤169 (n = 11). Hos patienter med grad 1-2 kræft i æggestokkene, sagerne med STIP1 169 (n = 62) havde en dårligere 5-års overlevelse på 73,8% end 85,3% hos dem med STIP1≤169 (n = 48), selv om forskellen nåede ikke statistisk signifikans endnu (P = 0,197). Endvidere i patienter med fremskredne stadier (III og IV) af serøs karcinom og ubestemt klasse 2-3 (n = 8), alle af dem havde STIP1 169 og 7 af dem (87,5%) bukket under for sygdommen i follow op med denne undersøgelse.

Vi udførte også en analyse af afvigelser og bygget tidsafhængighedsaspekterne ROC kurver (enten med eller uden STIP1) at undersøge, om tilføjelsen af ​​STIP1 histoscores kunne forbedre den prognostiske lagdeling af patienter med invasiv ovariecancere. I disse analyser, andre potentielle prædiktorer medtaget i modellen var stadium, type, serum CA125, og tilstedeværelsen af ​​tilbageværende sygdom. Modellen for at tilføje STIP1 histoscore til andre prognostiske faktorer betydeligt bedre end modellen uden STIP1, viser både højere AUC og lavere afvigelser i både OS (figur 3A,

P

= 0,0008) og PFS (figur 3B,

P

= 0,014). Kollektivt, disse resultater viste, at tumor STIP1 histoscoring havde en prognostisk værdi ud over klassificeringen og stadieinddeling.

Den tidsafhængige AUC (arealet under ROC-kurven) af modellen herunder STIP1 rapporteres som et rødt fast stof linje, hvorimod AUC for modellen uden STIP1 er vist som en blå stiplet linje. Andre parametre omfattede fase, type, serum CA125, og resterende sygdom. (A) Samlet overlevelse, (B) Progressionsfri overlevelse.

STIP1 Stimuleret spredning og migration af ovariecancerceller

For at undersøge de biologiske funktioner af STIP1, vi behandlede BG1 og MDAH2774 ovariecancerceller med rhSTIP1 (400 nM). Behandlingen med rhSTIP1 inducerede en 1,9-fold stimulation i BrdU-inkorporering i begge ovarieceller cancerpatienter (figur 4A). Desuden er behandling med rhSTIP1 resulterede i en øget Ki-67 immunfarvning, hvilket antyder, at STIP1 inducerer human ovariecancer celleproliferation (figur 4B).

To æggestokkene cancercellelinier (BG1 og MDAH2774) blev behandlet med 400 nM af rhSTIP1 og analyseret ved BrdU-inkorporering (A) og Ki67-immunfarvning (B). Ki67-positive celler er vist i brun farve; skala søjler repræsenterer 20 μ.

Behandlingen med rhSTIP1 signifikant stimuleret æggestokkræft celle migration (2,4 gange stigning i BG1 celler og 1,6 gange stigning i MDAH2774 celler, henholdsvis) (figur 5A). I overensstemmelse med data opnået i Transwell migration assay resultaterne af sårlukning assayet (figur 5B) analyseret under anvendelse af WimScratch software indikerede en 1,8-gange stigning i vandringshastigheden af ​​MDAH2774 celler behandlet med rhSTIP1 (data ikke vist).

behandlingen med rhSTIP1 fremmes cellemigration i henhold til resultaterne af både Transwell migration (A) og sårlukning (B) assays. Kvantitativ analyse af den procentdel af migrerende MDAH2774 celler under anvendelse af WimScratch software vist at eksponeringen overfor rhSTIP1 inducerede en 1,8-gange stigning i indvandringen (B). Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Vigtigt blev de observerede stigninger i celleproliferation og migrering induceret af rhSTIP1 ophævet ved samtidig behandling med anti-STIP1 antistoffer (figur 6A og 6B). Disse resultater ikke kun bekræfte, at de observerede virkninger var fremkaldt af STIP1, men også give foreløbige beviser til støtte for det terapeutiske potentiale af anti-STIP1 antistoffer i kræft i æggestokkene.

Når anti-STIP1 antistoffer (800 nm) blev tilføjet for cancerceller tidligere har været udsat for 400 nM af rhSTIP1 blev celleproliferation (A) og migrering (B) inhiberes. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelser om måden for tre uafhængige forsøg.

I ovariecancerceller behandlet med rhSTIP1, siRNA knockdown af STIP1, eller anti-STIP1 antistoffer, vi også anvendt MTT-assays til evaluere levedygtighed celle som en proxy for celle nummer, med den forståelse, at celletallet er formet af de kræfter i både celledeling og apoptose. I overensstemmelse med resultaterne i figur 4 og figur 6A, behandling med rhSTIP1 signifikant (P 0,01) øget kræft i æggestokkene celletal baseret på MTT-analysen (figur S3A), hvorimod knockdown af STIP1 signifikant (P 0,005) undertrykte ovariecancerceller (Figur S3B). I modsætning til den neutraliserende virkning af anti-STIP1 på rhSTIP1-stimuleret celleproliferation (figur 6A), direkte behandling af ovariecancerceller med forskellige kloner af anti-STIP1 ændrede ikke MTT aflæsninger (Figur S3C).

diskussion

Denne undersøgelse viser for første gang, at STIP1 er en prognostisk biomarkør i human kræft i æggestokkene. Ifølge deres individuelle molekylære egenskaber, er biomarkører for nylig blevet inddelt i følgende kategorier: carcinogenese biomarkører, udgivet biomarkører, respons biomarkører, og risikofaktorer biomarkører [11]. Baseret på deres anvendelse i sygdomskarakterisering, kan biomarkører også klassificeres som prognostiske, forudsigende og risikomarkører [19]. I vores tidligere undersøgelser [9], [10], vi har vist, at STIP1 udskilles af ovariecancer i blodbanen, hvilket antyder, at dette molekyle kan tjene som en frigjort biomarkør for ovariecancer. Især vores nuværende resultater viser, at en høj STIP1 ekspression er relateret til dårlig OS (figur 2; tabel 2). Og fattige PFS-rater (tabel 2) og kan således repræsentere en hidtil ukendt prognostisk markør

En vigtig prognostisk faktor i kræft i æggestokkene er den histologiske bedømmelse (figur 2B); desværre kan grading være subjektive selv blandt erfarne patologer og nogle tumorer ikke passer pænt ind i en given lønklasse [26]. For eksempel har en betydelig inter-observatør variation blandt patologer i sortering af brystkræft rapporteret [27]. For at løse dette forbehold, har klassifikationen af ​​brystcancer i molekylære undertyper med karakteristisk genekspressionssystemer signaturer blevet foreslået som et middel til at forstå den molekylære basis for den histologiske grad [28]. I denne undersøgelse har vi vist, at STIP1 histoscores kan være nyttige i at supplere den patolog er histopatologiske sortering af ovariecancer ved at levere objektive, kvantitative vurderinger. Især kan STIP1 histoscores vise sig nyttige til at forudsige prognosen hos patienter med clear cell cancer (som normalt ikke gradueret) [3]. Vores analyser viste endvidere, at selv hos patienter i samme tumor klasse, blev en højere STIP1 niveau er forbundet med en dårligere klinisk resultat.

Serum STIP1 niveauer blev ikke vist signifikant forskellig blandt patienter med 4 kliniske stadier af æggestokkene cancer [9], men i denne undersøgelse tumor STIP1 histoscores var signifikant højere i trin III-IV (n = 147) end trin i-II (n = 183) (tabel 1). Denne uoverensstemmelse kan blot skyldes det lille sagsnummer (n = 43) i vores tidligere undersøgelse [9]. Resultaterne at høj STIP1 histoscores markant var forbundet med høje kliniske faser (III-IV) og høj kvalitet (3) (tabel 1), også rejst muligheden for, at høje histoscores kan være en funktion af høj tumor kvaliteter og /eller høje kliniske faser, der mangler at blive bevist i fremtidige studier af større sagsnummer. Alligevel tumor STIP1 histoscoring klart udøver en prognostisk værdi ud over de almindeligt anvendte, kliniske parametre (figur 3). Disse resultater kollektivt støtter nytten af ​​STIP1 histoscore som prognostisk biomarkør.

Som phosphoprotein, STIP1 gennemgår en cdc2 kinase fosforylering, som er ledsaget af den cytoplasmatiske translokation af STIP1 [14]. Udtrykket af STIP1 i forskellige typer af kræft [15], [29], [30], [31] antyder, at dette molekyle har en anti-apoptotisk rolle og /eller fremmer kræftcelle overlevelse. Knockdown af STIP1 er blevet vist at undertrykke invasivitet af bugspytkirtelkræftceller [31]. Vi har tidligere rapporteret, at STIP1 udskilles af ovariecancerceller i tumormikromiljøet og det systemiske kredsløb [9]. Vi har også beskrevet de molekylære mekanismer, som udskilte STIP1 stimulerer proliferation af ovariecancerceller [10]. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse (figur 4 og 5) ikke kun bekræfte rolle STIP1 at fremme tumorigenese men også antyder, at dette molekyle kan tjene som en prognostisk biomarkør (figur 2 og 3, tabel 2).

effektiv blokade af rhSTIP1-stimuleret celleproliferation og migrering af ovarieceller fremkaldt af anti-STIP1 antistoffer (figur 6) viser, at secerneret STIP1 fra cancervæv kan være et mål for udviklingen af ​​terapeutiske antistoffer i ovariecancer. STIP1 repræsenterer en attraktiv kandidat til kræftbehandling. For eksempel har en forbindelse, der forhindrer Hsp90 fra at interagere med STIP1 nylig blevet konstrueret og har vist at forringe Hsp90-afhængige foldning pathway, i sidste ende at udøve cytotoksiske virkninger på brystcancerceller [32]. Desuden har en novobiocin-afledt Hsp90 C-terminal-inhibitor, KU135, blevet vist at inhibere proliferation og inducere apoptose i melanomceller [33]. Endelig en

in vitro

undersøgelse fra Horibe et al. [34] har rapporteret, at et anti-TPR-peptid, der blokerer interaktionen af ​​Hsp90 med TPR2A domæne af STIP1 er stand til at inducere celledød i pancreas, nyre, lunge, prostata, og gastriske cancercellelinjer.

på trods af de gradvise forbedringer i kirurgi og kemoterapi, de fleste patienter med ovariecancer dør af sygdommen inden for fem år efter diagnosen [3]. For egnede patienter, tilføjer målrettet terapi til kemoterapi kan øge både chancen for, at svulsten vil reagerer godt på behandling samt øge varigheden at tumoren kan undertrykkes; sammen, kan dette føre til en vis forlængelse af livet. Hvis bekræftes af andre undersøgelser, vores data tyder på, at STIP1 kan tjene som et lovende mål for antistof-baserede æggestokkræft terapi.

Støtte Information

Figur S1.