PLoS ONE: Identifikation af myeloide afledte suppressorceller i hunde med naturligt forekommende kræft

Abstrakt

Hunde med naturligt forekommende kræft udgør en vigtig stor dyremodel for lægemiddeludvikling og test nye immunterapier. Imidlertid har dårligt definerede immunfænotyper af hunde leukocytter begrænset undersøgelse af tumor immunologi hos hunde. Ophobningen af ​​myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) vides at være en vigtig mekanisme af immunsuppression i tumorbærende mus og i humane patienter. Vi søgte at identificere MDSCs i blodet hos hunde med kræft. Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) fra hunde med fremskreden eller tidlig fase kræft og fra aldersmatchede raske kontroller blev analyseret ved flowcytometri og mikroskopi. Undertrykkende funktion blev testet i T-celleproliferation og cytokin uddybningsmodulerne assays. Semikvantitative RT-PCR blev anvendt til at identificere potentielle mekanismer er ansvarlige for immunosuppression. PBMC’er fra hunde med fremskreden eller metastatisk cancer udviste en signifikant højere procentdel af CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler i forhold til hunde diagnosticeret med tidlig fase non-metastatiske tumorer og sunde hunde. Disse CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler udgør en subpopulation af aktiverede granulocytter, som co-rense med PBMC’er, display polymorfonuklear granulocyt morfologi, og demonstrere en potent evne til at undertrykke proliferation og IFN-γ-produktion i T celler fra normale og tumorbærende donorer. Desuden er disse celler udtrykte kendetegnende suppressive faktorer af human MDSC herunder ARG1, iNOS2, TGF-β og IL-10. Sammenfattende vores data viser, at MDSCs ophobes i blodet hos hunde med fremskreden kræft og kan måles ved hjælp af denne tre-markør immunofænotype hvorved prospektive undersøgelser, der kan overvåge MDSC byrde

Henvisning:. Goulart MR, Pluhar GE , Ohlfest JR (2012) Identifikation af myeloide afledte suppressorceller i Hunde med naturligt forekommende kræft. PLoS ONE 7 (3): e33274. doi: 10,1371 /journal.pone.0033274

Redaktør: Sophia N. Karagiannis, Kings College London, England

Modtaget: 28 oktober, 2011; Accepteret: 10. februar, 2012; Udgivet: 13 Mar 2012

Copyright: © 2012 Goulart et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til Dr. Ohlfest fra National Institutes of Health (NIH R21-NS055738), og American Cancer Society (RSG-09-189-01-LIB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er den hyppigste dødsårsag hos voksne hunde i USA, Australien, Japan og Europa og betragtes som den vigtigste sundhedspleje bekymring kæledyrsejere. Omkring fire millioner hunde er diagnosticeret med kræft hvert år i USA [1]. Naturligt forekommende malignances hos hunde deler mange funktioner med menneskelige kræftformer herunder lignende tumor biologi, genetik, incidensrater, histologisk udseende, og respons på konventionelle behandlinger (revideret i [2]). Tumorer i hunde fremskridt relativt hurtigere end den samme sygdom hos mennesker, så spørgsmål vedrørende behandling effektivitet (progression og overlevelse) skal behandles hurtigere i hunde. En vigtig fordel ved hundemodel er evnen til at teste Experimental Therapeutics ved skala doser menneske i fastsættelsen af ​​minimal residual sygdom, som er vanskeligt at gøre på en meningsfuld måde i små gnavere, der har relativt hurtige tumor vækstkinetik. Hertil kommer, fordi standarden for pleje for de fleste hunde tumorer er dårligt etableret, er der meget mere fleksibilitet i studie design i forhold til humane kliniske forsøg. Kollektivt disse funktioner gør hunden en fremragende platform for translationel medicin.

Pet hunde med kræft er hurtigt ved at blive et vigtigt værktøj, der anvendes i lægemiddeludvikling. Et af de bedste eksempler på dette er den nylige parallel udvikling af SU11654, en multi-målrettet tyrosinkinasehæmmer, og sunitinibmaleat (SU11248). Begge lægemidler er potente inhibitorer af PDGFR, VEGFR, KIT, og FLT3. Undersøgelser i hunde med forskellige solide tumorer afslørede, at plasmakoncentrationen af ​​SU11654, den mutationsstatus af KIT, og inhiberingen af ​​KIT phosphorylering var stærkt indikerer klinisk effektivitet. Optimale dosering parametre og toksicitet blev etableret i hunde så godt. Disse banebrydende undersøgelser i høj grad lettet videreudviklingen af ​​hele denne klasse af lægemidler, især godkendelse af sunitinibmalat af den amerikanske Food and Drug Administration til behandling af renalcellecarcinom (RCC) og gastrointestinale stromale celle tumorer, som ofte indeholder lignende KIT mutationer [3]. Det blev senere erkendt, at sunitinib markant udtømmer MDSCs og gendanner T-celle funktion i humane RCC patienter [4], en observation, som ikke kunne have været gjort i hunde på det tidspunkt på grund af begrænsede hunde reagenser og dårligt definerede markører for hunde leukocytter. Vi, og andre, tester nye immun-baserede terapier i hunde med forskellige maligniteter, men immun overvågning i disse undersøgelser er blevet forvirret af det samme problem. For at sætte feltet i perspektiv, har en overflade immunofænotype for hunde naturlige dræberceller ikke defineret, MHC alleler er dårligt forstået, og mange af de markører, der anvendes stole på tværs af reaktive antistoffer hvorved specificitet skal testes empirisk. Det er afgørende, at nye reagenser udvikles og at immunfænotyper af alle større hunde leukocytter delmængder bestemmes. Lægge denne grundlæggende fundament vil give unik indsigt, der skal foretages som nye lille molekyle narkotika og immunoterapi testes i hunde som optakt til humane forsøg.

ophobning af MDSCs i tumor-bærende mus og mennesker med kræft er kendt at være en central mekanisme for tumor flugt fra immun overvågning [5], [6], [7]. MDSCs omfatter et fænotypisk heterogen population af myeloide celler i tidlige stadier af differentiering, der udvides i cancer og mange andre patologiske tilstande, og som har en potent evne til at undertrykke T-cellefunktion, især T-celleproliferation og effektor cytokinproduktion [6], [8] . MDSCs kan opdeles i monocytiske og granulocytiske undertyper. En kilde til kontroverser på dette område er, at MDSC heterogenitet har gjort sammenligninger mellem kræftpatienter og murine tumormodeller udfordrende (se reference [9] for fremragende perspektiv). De molekylære mekanismer, hvorved MDSCs inhiberer T-cellefunktion er under efterforskning. Undersøgelser har impliceret opregulering af arginase en (ARG1), inducerbar nitrogenoxid syntase (iNOS2) og reaktive ilt arter (ROS) som vigtige faktorer for MDSC-medieret immunsuppression [8], [10], [11]. ARG1 kan dybt forringe T-cellefunktion ved tumorstedet ved L-arginin udtømning, udløser aminosyren sult respons og apoptose i lymfocytter [7]. En anden mekanisme af immunsuppression er kemokin nitrering, som sløver effektor T-celle infiltration i tumorstedet [12]. Endvidere MDSC ekspansion forbundet med nedregulering af L-selectin på CD4

+ og CD8

+ T-celler [13]. Dette reducerer T-celle trafficking til sekundære lymfoide organer, hvor tumor-reaktive T-celler kan primes [13]. På grund af den evne MDSCs at nedregulere immunresponset mod tumorer i mus og i mennesker, vi den hypotese, at disse celler også vil spille en vigtig rolle i tumorinduceret immunundertrykkelse hos hunde med cancer. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at identificere overflademarkører der karakteriserer eksistensen af ​​MDSCs hos hunde.

Materialer og Metoder

Undersøgelse Befolkning og prøvetagning

Beskrivelsen af alle hunde i denne undersøgelse er sammenfattet i tabel 1 og 2, med yderligere detaljer leveres i tabel S1 og S2.

tabel S3 er et sammendrag af prøver analyseret i hver figur. Kliniske data blev indhentet fra medicinske journaler. Kontrol hunde blev bestemt til at være sund er baseret på fysisk undersøgelse, ejer observationer og komplet blodtælling eksamener. Til hunde med kræft, blev diagnosen og tumor iscenesættelse baseret på komplette fysiske undersøgelser, histopatologi af tumorbiopisier, blod arbejde og specialiserede billeddannende undersøgelser, såsom CT scanninger, ultralyd eller røntgenbilleder, at vurdere tumor placering og størrelse, samt tilstedeværelse af metastatisk sygdom. Hunde med store, nekrotiske eller flere masser, lytisk eller svær knogle ødelæggelse (med osteosarkom) eller tilstedeværelsen af ​​metastaser, blev placeret i et fremskredent stadium /metastatisk gruppe. Dyr, som viser med små masser eller ingen metastatiske knuder var anbragt i det tidlige stadium ikke-metastatisk gruppe. Borde S1 og S2 også listen specifikke oplysninger om enhver behandling, at hunde med kræft havde modtaget forud for eller på tidspunktet for blodprøvetagning til denne undersøgelse.

Blodprøver fra både kræft og raske kontrolpersoner hunde blev opnået specielt til denne undersøgelse . Prøverne blev opsamlet i hepariniserede rør fra de Onkologi og Fællesskabets praksis tjenester i Veterinary Medical Center ved University of Minnesota ifølge Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer. Prøverne blev udtaget efter ejerne underskrev klient samtykkeerklæring. Den institutionelle Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og godkendt undersøgelse med titlen som “flowcytometrisk Immunfænotypebestemmelse af Perifere blodlegemer i hunde” via udpeget medlem revision under kodenummer 0912A75493. Medmindre andet udtrykkeligt er angivet, idet cellerne analyseret for dette håndskrift co-oprenset med mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) af hunde med cancer eller aldersmatchede raske kontroller, der blev isoleret under anvendelse af Ficoll (Sigma) gradientcentrifugering som følger. Hepariniseret perifert blod blev fortyndet 1:03 med sterilt PBS (Invitrogen) og lagdelt over Ficoll-Histopaque (Sigma). Prøver blev centrifugeret ved 400 x g i 30 min. De indsamlede ved grænsefladen PBMC’er blev overført til et frisk rør, vasket to gange med PBS og resuspenderet med frysning opløsning bestående af 90% føtalt bovint serum (Invitrogen) 10% dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma) og derefter frosset ved -80 ° C. Endelig blev PBMC’er optøet i 2 minutter i et 37 ° C vandbad før farvning og analyse. Til analyse af friske prøver, blev PBMC’er isoleret som ovenfor, resuspenderet i FACS buffer, farvet med antistoffer og straks analyseret ved flowcytometri eller FACS som angivet.

flowcytometrisk analyse Salg

PBMC prøver blev isoleret fra frisk blod eller optøet og resuspenderet i FACS-buffer. Ikke-specifik antistofbinding blev blokeret ved forbehandling af celler med 10 pg /mL hunde gamma-globulin (Jackson Immunoresearch) i 20 minutter ved stuetemperatur. Celler blev først mærket ved indirekte farvning med 0,1 ug af ukonjugeret muse-anti-hund CD11b-antistof (klon CA16.3E10, ABD Serotec) eller IgG1-isotypekontrol (ABD Serotec) og 0,5 ug PE-konjugeret gede F (ab ‘) 2 anti -mouse IgG (Abcam) sekundært antistof ved 4 ° C i 30 minutter i et mørkt rum. Efter indirekte farvning blev cellerne vasket to gange og farvet med 0,3 ug FITC-konjugeret rotte-anti-hund MHCII (klon YKIX334.2, ABD Serotec) og 0,15 ug af det krydsreaktive, Alexa Fluor 647-konjugeret muse-anti-humant CD14 antistof (klon TÜK4, ABD Serotec) eller isotyper kontrollen ved 4 ° C i 30 minutter i et mørkt rum ifølge producentens protokol. Antistof-mærkede celler blev vasket to gange og resuspenderet i FACS-buffer. Celler blev inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke med 7-amino-actinomycin D (7AAD, slutkoncentration på 1 ug /ml; Calbiochem) og derefter analyseret på en Becton Dickinson Canto tre-laser flowcytometer. Data blev yderligere analyseret med FlowJo software (Tree stjerne). Analyse porte blev sat på grundlag af 7AAD negative befolkning. Procentdelen af ​​MDSCs blev beregnet på grundlag af en procentdel af CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler inden den samlede levende PBMC befolkning. I et eksperiment (fig S1), anti-muse PE-konjugeret CD11 (klon M1 /​​70 eBioscience) og anti-muse APC-konjugeret Gr-1 (klon RB6-8C5 eBioscience) antistoffer blev også anvendt til at verificere krydsreaktivitet med hund celler.

Dyrkning af MDSCs, PMN’er og T-celler

i funktionelle assays, RT-PCR og cellemorfologi analyse, friske blodprøver fra en tumorbærende hund blev anvendt til isolering af CD11b

+ CD14

-MHCII

– eller CD11b

+ CD14

+ MHCII

– celler, som anført, ved hjælp af en BD FACSAria celle sorteringsanlæg. For T celleisolering blev PBMC’er isoleret som tidligere beskrevet fra friske blodprøver fra raske hunde og farvet med 0,3 ug FITC-konjugeret muse-anti-hund CD3 (klon CA17.2A12, ABD Serotec), 0,15 ug Pacific blå-konjugeret mus anti-hund CD4 (klon YKIX302.9, ABD Serotec) og 0,15 ug Alexa700-konjugeret muse-anti-hund CD8 (klon YCATE55.9, ABD Serotec) antistoffer. Polymorfonukleære leukocytter (PMN) blev oprenset fra cellepelleten af ​​en Ficoll gradient fra sund hund blodprøver, efter fjernelse af PBMC’er (ved toppen af ​​gradienten) og erythrocytter ved RBC lysebuffer (eBioscience).

Ex Vivo

proliferation

Analyse af MDSC inhibitorisk aktivitet på T-celleproliferation blev målt ved

3H-thymidin-inkorporering i DNA. Kort fortalt blev PBMC’er fra de angivne hunde podet i U-bundede plader med 96 brønde (5 x 10

4cells /brønd) i medium bestående af RPMI 1640 indeholdende L-arginin (150 pM) (Invitrogen) suppleret med penicillin /streptomycin (Invitrogen) og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Invitrogen) ved 37 ° C, i et CO 5%

2 incubator. CD11b

+ CD14

-MHCII

– eller CD11b

+ CD14

+ MHCII

– celler fra en hund med kræft blev sorteret og sat til kræft (autologe) eller sund responder PBMC’er som angivet. Concanavalin A (5 ug /ml) (Sigma) og rekombinant humant IL-2 (10 IU /ml) (R primersekvenser for housekeeping-gen blev designet fra hunde β-actin-genet under anvendelse Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Til påvisning af cytokiner IL-10 og TGF-β, primersekvenser af IL-10 og TGF-β blev opnået fra offentliggjorte kilder [14]. BLAST-algoritmen (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) blev anvendt til at sikre primerspecificitet til målgenet. Første streng cDNA-syntese blev udført under anvendelse af en QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN). To-trins PCR-reaktion blev udført i en 12,5-pi volumen indeholdende 2 × SYBR green Master Mix (Quanta Biosciences), 0.675U GoTaq Polymerase, 2 nM MgCl

2 (Promega), 0,2 mM dNTP’er (Stratagene), 0,2 uM af hvert primerpar og 50 ng cDNA skabelon. Reaktionsbetingelser bestod af indledende denaturering ved 94 ° C i 2 min, derefter cykler af denaturering ved 94 ° C i 30 s, annealing ved 60 ° C i 45 s, forlængelse ved 72 ° C i 45 s og endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 minutter i en DNA Engine Thermal Cycler (Bio-Rad). Den optimale annealingstemperatur for hvert primerpar blev etableret før undersøgelsen (se primersekvenser i tabel S4). PCR-produkter blev kørt på 2% agarosegeler indeholdende 0,5 pl /ml ethidiumbromid og afbildes under 590 nm ultraviolet lys på en Eagle Eye II billedprocessor station (Stratagene). Negative kontrolreaktioner blev udført under anvendelse af RNA, der ikke blev udsat for omvendt transkription PCR.

Statistical Analysis

Forskellene mellem to grupper blev analyseret under anvendelse uparrede, to-halet Students

t-test

. Alle test blev udført med Prism 4 software (Graph Pad Software, Inc). P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Hunde med fremskreden kræft har forhøjede niveauer af granulocytisk CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler. at samtidig rense med PBMC’er

Perifere blodprøver fra 45 hunde diagnosticeret med kræft og 18 raske kontrolpersoner hunde blev indsamlet (tabel 1 og 2). Alle hunde med kræft undergik klinisk iscenesættelse af deres sygdom ved at udføre komplette fysiske undersøgelser, blod arbejde, billedbehandling til at vurdere tumor placering og størrelse og metastaser, og histopatologisk diagnose lavet af diagnostisk aspirat eller biopsi af tumoren. Blandt de 45 hunde diagnosticeret med kræft, blev 30 hunde klassificeret som at have avanceret eller metastatisk sygdom og 15 hunde blev klassificeret som tidlig fase /ikke-metastatisk eller lav kvalitet sygdom baseret på klinisk iscenesættelse. Hver gruppe blev yderligere opdelt i henhold til histologisk diagnose i sarcomer, carcinomer eller mastcelletumorer (beskrevet i tabel S1 og S2). Procentdelene af formodede MDSCs hos hunde med cancer og raske hunde blev bedømt ved flowcytometri. PBMC’er fra hunde med fremskreden eller metastatisk cancer viste en markant stigning i CD11b

+ CD14

-MHCII

– brøkdel af celler, som tegnede sig for størstedelen af ​​cellerne i levende celler porten, i forhold til hunde diagnosticeret med tidlig fase non-metastatiske tumorer eller raske hund kontroller (fig. 1A). Denne undergruppe af celler udviste en polymorfnuclear granulocytisk morfologi ved heterogene udviklingstrin (fig. 1B), der ligner en granulocytisk delmængde af MDSCs identificeret i mus [15] og mennesker [16].

PBMC’er fra raske hunde og hunde med kræft blev farvet for myeloid markør CD11, monocytær markør CD14 og MHC II. (A) Repræsentant flowcytometrisk analyse af frem og side scatter og gated CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler fra hunde med fremskredne eller metastatiske tumorer i forhold til hunde med tidlige stadie ikke-metastatiske tumorer og sund kontrol hunde. Plots er repræsentative for hund med fremskreden metastatisk hemangiosarcoma (øverst), tidligt stadium blære overgangsordning celle karcinom (midten) og en sund hund. (B) FACS sorteres CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler blev farvet med diff-hurtig til cellemorfologi evaluering. Et repræsentativt eksempel på polymorphonuklear granulocyt morfologi CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler er vist ved 63 × forstørrelse

Hunde med fremskreden eller metastatisk cancer havde en signifikant større. fraktion af formodede MDSCs (36,04 ± 2.542, middelværdi ± SEM) sammenlignet med hunde med tidlig stadie ikke metastatiske tumorer (9,40 ± 0,953, gennemsnit ± SEM) og raske kontrolpersoner hunde (10,24 ± 1.412, middel ± SEM) (fig. 2A). Desuden er denne elevation i CD11b

+ CD14

-MHCII

– fraktionen syntes ikke at være begrænset til en bestemt tumortype. Forskellene var statistisk signifikante i hunde med sarkomer, carcinomer, og mastcelletumorer sammenlignet med raske kontroller (fig. 2B). Omvendt er andelen af ​​CD11b

+ MHCII

– celler, der gjorde udtrykkeligt CD14 var ikke signifikant forskellig blandt nogen gruppe. Derfor hyppigheden af ​​CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler, der co-oprenses PBMC’er korrelerer med tumor byrde. Dette fund er i overensstemmelse med tidligere publicerede data om MDSC niveauer og tumor byrde i mus og mennesker [17], [18].

(A) Analyse af gennemsnitlig CD11

+ CD14

-MHCII

– Populationsfrekvensen hos hunde med fremskreden eller metastaserende tumorer (n = 30) sammenlignet med tidlig stadie ikke-metastatiske tumorer (n = 15) og kontrol hunde (n = 18). Der var en signifikant højere procentdel af CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler i hunde med fremskreden kræft versus tidligt stadie ikke-metastatiske tumorer og raske hunde (36,04% vs. 9,40% and10.24%, . henholdsvis B) Gennemsnitlig CD11b

+ CD14

-MHCII

– Populationsfrekvensen i de store kræft undertyper: fremskredent stadium eller metastatisk sarkomer (n = 18), tidlig stadie ikke-metastatiske sarkomer (n = 6) , avancerede stadie eller metastatisk karcinom (n = 7) tidlige stadie ikke-metastatiske karcinomer (n = 7), fremskredent stadium eller metastaserende mastcelletumorer (n = 5) og tidlig stadie ikke-metastatiske mastcelletumorer (n = 2) i forhold med kontrolhunde (n = 18). Markant forhøjede procenter blev påvist i alle fremskredne tumorer undertyper i forhold til fase tumorer tidlige og sunde hunde. Procenter af CD11b

+ CD14

+ MHCII

– celler var ikke signifikant mellem grupperne (* angiver P 0,001). Middelværdi ± SEM vises

CD11

+ CD14

-MHCII

-. Celler er funktionelt defineret som MDSCs

For at teste, om CD11b

+ CD14

-MHCII

– delmængde var i stand til at hæmme T-celle funktion, vi gennemført en række co-kultur eksperimenter. Renset CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler fra tre forskellige undertyper af kræft blev co-dyrket med autologe eller sunde responder PBMC’er. I alle tilfælde, CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler udviste en potent evne til at undertrykke proliferative responser på en dosis-afhængig måde. Repræsentative eksempler på proliferative suppression er vist under anvendelse af prøver fra en hund med tonsillær pladecellecarcinom (fig. 3A) og prostata-adenocarcinom (fig. 3B). For at bestemme om suppression var en artefakt af anvendelse af respondenter fra tumorbærende hunde, vi analyseret for proliferativ undertrykkelse ved hjælp af normale responders. Tilføjelsen af ​​CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler, men ikke normale PMN’er, forringet spredning af PBMC’er fra raske hunde (Fig 3C.). Desuden blev mængden af ​​IFN-γ-sekretion vurderet i det konditionerede medium fra disse co-kulturer, hvilket viste, at CD11

+ CD14

-MHCII

– celler, men ikke normale PMN’er, undertrykt sekretion af IFN -γ (figur 3D.)

CD11

+ CD14

-MHCII

-. celler blev sorteret fra perifert blod prøve af hunde med kræft og derefter co-dyrket med autologe PBMC’er (A , B) eller sund hund PBMC’er (C) i nærvær af mitogen for 72 hs. Repræsentative eksempler fra i alt otte hunde er vist. Graferne repræsenterer proliferative responser efter tilsætning af CD11b

+ CD14

-MHCII

– isoleret fra en enkelt hund med pladecellecarcinom (3A), prostata-adenocarcinom (3B) og osteosarkom (3C). Ikke-stimulerede PBMC’er blev anvendt som negativ kontrol og PBMC’er stimuleret in fravær af CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler blev anvendt som positiv kontrol for proliferation. PBMC’er blev også co-inkuberes med PMN’er, at kontrollere for tilstedeværelse af yderligere celler (3C, 3D). Proliferative responser blev målt ved

3H-thymidin. CPM, tællinger per minut. Mængden af ​​IFN-γ-sekretion i co-kultur blev bestemt ved anvendelse hunde specifik IFN-y ELISA assay (3D). Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Middelværdi ± SEM er vist.

MDSCs undertrykker både CD4

+ og CD8

+ T-celler

For yderligere at afhøre den direkte effekt på T-lymfocytter, renset CD11

+ CD14

-MHCII

– celler fra en hund med osteosarkom blev co-dyrket med oprenset CD4

+ og CD8

+ T-celler fra en sund hund i 72 timer. Ikke-stimulerede celler og CD4

+ og CD8

+ celler co-inkuberet med sunde PBMC’er blev anvendt som kontroller. Som forventet, CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler hæmmede udbredelsen af ​​CD8

+ (. Figur 4A) og CD4

+ T-celler (. Figur 4B), mens PBMC’er fra en normal hund ikke. Tilsammen viser disse data, at CD11

+ CD14

-MHCII

-. Celler faktisk funktionelt defineret som hunde MDSCs

Facs sorteres CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler isoleret fra en hund med osteosarkom eller sunde PBMC’er blev co-inkuberet med mitogen-stimulerede CD4

+ og CD8

+ T-celler isoleret fra en sund hund i 72 hs. Ingen stimulerede celler blev anvendt som negativ kontrol. Proliferative responser blev målt ved

3H-thymidininkorporering fra eksperimenter udført i triplikat. CPM, tællinger per minut. Middelværdi ± SEM vises

CD11

+ CD14

-MHCII

-. Celler udtrykker kendetegnende MDSC-afledte immunosuppressive faktorer

Det er vist, at MDSCs kan inhibere T-cellefunktion ved produktion af opløselige faktorer, såsom arginase-1, reaktive oxygenarter, nitrogenoxid og TGF-β (8-10). For at vurdere, om CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler fra hunde med kræft kunne muligvis udnytte disse mekanismer til at mediere T-celle undertrykkelse, vi evaluerede udtryk for ARG1 og iNOS2, samt immunosuppressive cytokiner TGF-β og IL-10, inden denne cellepopulation og fra PMN’er isoleret fra perifert blod fra raske hunde. PCR-analyse af RNA ekstraheret fra FACS isoleret CD11b

+ CD14

-MHCII

-celler bekræftede ekspressionen af ​​ARG-1, iNOS2 enzymer og immunosuppressive cytokiner TGF-β og IL-10 mRNA (fig. 5A) . I modsætning hertil normale hund PMN’er ikke udtrykke ARG1, selvom iNOS, TGF-β og IL-10 mRNA var detekterbar (fig. 5B). Fordi mRNA for ARG-1, iNOS2, TGF β og IL-10 blev alle fundet, konkluderer vi, at disse faktorer kan spille en rolle ved inhibering af T-celleproliferation og effektorfunktion. Men da PMN’er isoleret fra raske hunde udtrykte ikke detekterbar ARG-1-mRNA eller forringe T-cellefunktion, hvilket antyder, at ARG-1 kan være et tumor-induceret mekanisme, MDSCs kunne anvende for T-celle-undertrykkelse. . Dette fund var ikke uventet, og forud er dokumenteret i humane MDSC undersøgelser [19]

RT-PCR-analyse af FACS renset CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler detekteret udtryk for ARG1 og iNOS2, samt TGF-p og IL-10 immunosuppressive cytokiner. ARG-1-ekspression blev ikke påvist i normale PMN’er. CD11b

+ CD14

-MHCII

– celler blev isoleret fra det perifere blod fra en hund med osteosarkom og PMN’er blev isoleret fra en rask hund. NRT, RNA template i fravær af revers transkriptase. Resultaterne er repræsentative tre eksperimenter.

Diskussion

området sammenlignende onkologi viser stor løfte om at fremme udviklingen af ​​nye lægemidler til hunde og menneskelige patienter. Imidlertid har mangel af reagenser og dårligt defineret immunofænotype af hunde leukocytter behersket vores evne til at forstå tumor immunologi hos hunde med naturligt forekommende kræft. Vores data viser, at der foreligger MDSCs i det perifere blod af hunde, som er forhøjet i alle typer af fremskreden eller metastatisk cancer analyserede sammenlignet med tidligt stadium non-metastatisk cancer og raske kontroller. Med denne grundlæggende fundament af viden på plads, vil det nu være muligt at prospektivt overvåge MDSC byrde i hunde behandlet med eksperimentelle lægemidler og immunterapi. CD11b

+ CD14

-MHCII

– cellepopulation som vi defineret som MDSC co-oprenset med PBMC’er, havde polymorfnuclear granulocytisk morfologi, undertrykte T-celleproliferation og effektorfunktion, udtrykt kendetegnende undertrykkende faktorer af human MDSC, og positivt korreleret med tumorbyrde. Proliferationsassays afslørede forholdsvis svag proliferation i PBMC’er fra tumorbærende hunde (fig. 3A, B) sammenlignet med normale respondere (fig. 3C) i fravær af exogent MDSC. Dette afspejler sandsynligvis forhøjede niveauer af endogent (ikke eksperimentelt tilsat) MDSCs og regulatoriske T-celler i PBMC’er fra hunde med cancer. Endvidere er det afgørende at bemærke, at en anden delmængde af MDSC, der er mere monocytisk i naturen er meget værdsat i murine og humane tumor immunologi. Vi fandt ingen beviser for selektiv udvidelse af en CD14

+ monocyt-lignende celle i blodet hos hunde med kræft. Men CD11b

+ MHCII

– celler, der blev oprenset fra hunde med fremskreden kræft, der var også CD14

+ potent hæmmede T-celle proliferation (figur S2), afslører, at selv om monocytær MDSC er ikke en dominerende befolkning i hunde med kræft, er de faktisk til stede. Dette fund af præferentiel udvidelse af granulocytisk MDSC er ikke overraskende, og er i overensstemmelse med lignende undersøgelser i murine tumormodeller [15]. Samlet set vores data er i overensstemmelse med en global tilstand af immunsuppression hos hunde med fremskreden kræft, som sandsynligvis skyldes flere mekanismer.

Den praktiske leverance med denne undersøgelse er en simpel tre markør overflade immunofænotype, der kan bruges til fremadrettet overvåge MDSC byrde hos hunde. Vi har udført pilotundersøgelser for at lede efter yderligere markører. Specifikke foreløbige resultater, der er værd at bemærke, er som følger. Vi har ikke været i stand til at demonstrere succes farvning hjælp af anti-humane CD66b antistoffer. CD66b er en aktivering markør udtrykt på nogle humane MDSC [19]. Den mest udbredte markør for MDSC i musen er Gr-1, og et antistof mod muse Gr-1 krydsreagerer pænt med hundeceller, ligesom anti-muse CD11 (figur S1). Yderligere undersøgelser vil være forpligtet til at afgøre, om hunde celler, der er identificeret ved anti-muse Gr-1 og CD11b antistoffer er faktisk MDSCs.

Et potentielt begrænsning af denne undersøgelse, at mange af de prøver, vi analyserede blev frosset, den optøet inden analyse, som kunne have påvirket cellernes levedygtighed.