PLoS ONE: spredning af kolorektal cancer fremmes af Two Signaling Transduktion Expression Mønstre: ErbB2 /ErbB3 /AKT og MET /ErbB3 /MAPK

Abstrakte

En af de seneste gennembrud i kræftforskning er identifikationen af ​​aktiverende mutationer i forskellige receptor (RTK) veje i mange kræftformer, herunder kolorektal cancer (CRC). Vi hypotesen, at, alternativ til mutationer, kan overekspression af forskellige onkogene RTK også understøtte CRC patogenese, og forskellige RTK kan par med distinkte nedstrøms signalveje i forskellige undertyper af human CRC. Ved immunhistokemi, viser vi her, at RTK-medlemmer ErbB2, ErbB3 og c-Met var i gerning forskelligt overudtrykt i kolorektale kræft patientprøver, der fører til konstitutiv aktivering af RTK-signalveje. Brug ErbB2 specifik inhibitor Lapatinib og c-Met specifik inhibitor PHA-665.752, vi yderligere vist, at denne konstitutiv aktivering af RTK signalering er nødvendig for overlevelsen af ​​kolorektal cancer celler. Endvidere viser vi, at RTK overekspression mønster dikterer anvendelsen af ​​nedstrøms AKT og /eller MAPK pathways. Vores data er vigtige tilføjelser til nuværende onkogene mutation modeller, og yderligere forklare den kliniske variation i terapeutiske reaktioner af kolorektal cancer. Vores resultater fortaler for mere personlig terapi skræddersyet til individuelle patienter baseret på deres type RTK udtryk i tillæg til deres mutation status

Henvisning:. Yao YL, Shao J, Zhang C, Wu JH, Zhang QH, Wang JJ et al. (2013) spredning af kolorektal cancer fremmes af to Signaling Transduktion Expression Mønstre: ErbB2 /ErbB3 /AKT og MET /ErbB3 /MAPK. PLoS ONE 8 (10): e78086. doi: 10,1371 /journal.pone.0078086

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Juni 14, 2013; Accepteret: September 7, 2013; Udgivet: 30 oktober 2013

Copyright: © 2013 Yao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Social Development Foundation of Kunshan (nr. KS1130) og den Videnskabelige Research Foundation i Jiangsu Universitet (nr. 11JGD0090). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tyktarmskræft er en epitelial malignitet forekommer i tyktarmen eller endetarmen. Mere end 1 million mennesker er diagnosticeret med tyktarmskræft årligt på verdensplan resulterer i ca. 0,5 millioner dødsfald. I 2008 var det den anden mest almindelige årsag til tumor-associerede død hos kvinder, og den tredje mest almindelig hos mænd. Det er mere almindeligt i udviklet end i udviklingslande [1] – [3]. Kemoterapi kan anvendes som supplerende behandling som supplement til kirurgi i næsten alle patienter med tyktarmskræft [4] – [6]. Med eller uden lymfeknudemetastaser, er kemoterapi anses for at øge levetiden og reducere muligheden for gentagelse. Kemoterapi narkotika er designet til at virke via en række mekanismer og kan omfatte kombinationer af stoffer såsom fluorouracil, capecitabin, UFT, leucovorin, irinotecan eller oxaliplatin [7] – [9]. Men af ​​forskellige årsager, kan kemoterapi forårsage andre problemer for patienterne hovedsagelig på grund af dens ikke-specifik angreb og relaterede bivirkninger, såsom kvalme, opkastning, hårtab, træthed, anæmi og infektion blandt andre. Derfor har målrettet kræftbehandling opstået som er udviklet på grundlag af viden om cellesignalering. Målrettet kræftbehandling afhænger hovedsagelig af små molekyler lægemidler og monoklonale antistoffer, som forårsager langt færre bivirkninger sammenlignet med traditionel kemoterapi.

Eksogene signaler, såsom epidermal vækstfaktor (EGF) og hepatocytvækstfaktor (HGF) blev tidligere rapporteret at være afgørende at opretholde en vedvarende vækst af tumorceller ved binding til deres receptorer. Disse receptorer tilhører receptortyrosinkinaser (RTK’er) familie og ideelle mål ved cancerterapi som påvist i mange undersøgelser. Efter systemisk profilering af kræft genomer ved hjælp af næste generation sekventering, vi nu ved, at erhvervelsen af ​​aktiverende mutationer i RTK’er eller downstream signalmolekyler er en af ​​de store onkogene mekanismer. Det er dog kun en lille delmængde af patienterne besidder disse mutationer, hvilket tyder på, at andre alternative mekanismer er på spil. En af disse alternative mekanismer kunne være overekspression af pro-spredning og pro-overlevelse RTK’er, og /eller differential brugen af ​​downstream signalveje. Med mere dybtgående analyse af kræft genomer, er vi nu begynde at forstå de individuelle forskelle, som betyder unikke sygdom biologi og krav kliniske behandling.

Familien af ​​epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og c-Met er RTK’er, der er blevet hyppigt rapporteret i kolorektal cancer progression og metastase. Aktivering af disse RTK’er kan stimulere en række specifikke pathways direkte berører tumor migration celle, overlevelse og proliferation. Den afvigende regulering af RTK’er ofte bemærket i fremskreden CRC. Sammenlignet med EGFR, andre EGFR familiemedlemmer, c-MET, ErbB2, ErbB3, og deres relaterede signalveje er relativt unknow [10]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi den differentielle ekspression af RTK c-MET, ErbB2, ErbB3, og ned stream signalmolekyler i delprøver af kolorektale kræftpatienter, samt i repræsentative humane kolorektale cancer cellelinjer.

Materialer og metoder

patienter

i alt 105 kolorektal cancer prøver blev undersøgt i denne undersøgelse, og blev opnået fra patienter på tidspunktet for kirurgisk resektion og endoskopi. Normale kolorektale væv blev opnået fra 40 kinesiske patienter med ikke-svulstsygdomme såsom kedelig lang kolorektal og vaskulær misdannelse. Alle sager blev behandlet ved den første Folkets Hospital i Kunshan, Kina mellem januar 2010 og august 2011, og alle prøverne blev indsamlet i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Skriftlig dokumenteret informeret samtykke til genekspression analyser af alle væv blev opnået fra alle patienter før operation eller endoskopi undersøgelse. Denne undersøgelse og godkendelsesproceduren blev godkendt af de lokale etiske komité af første Folkets Hospital i Kunshan, Kina. Diagnosen og iscenesættelse af kolorektal cancer blev vurderet i henhold til den AJCC (TNM) Iscenesættelse System.

Cell Kultur og reagenser

LoVo, SW948 og SW480 cellelinjer blev opnået fra ATCC. EGF var fra Sigma (Milano, Italien), HRG1-β1 og IGF-1 fra R 0,05, ** P. 0,01 ved Wilcoxon Rank Sum

Resultaterne af ekspression af alle tre proteiner blev forventet, ikke kun på grund til deres rolle som proto-onkogener, men også fordi tidligere tilsvarende undersøgelser har indikeret lignende resultater. Men efter nærmere undersøgelse fandt vi varierende grad af variation i ekspressionen af ​​disse tre proteiner i human colorectal cancer, især i ErbB2-ekspression. Af de 105 undersøgte tilfælde, 45 tilfælde (42,85%) var negative for ErbB2-farvning, viste 8 tilfælde stærke ErbB2-farvning, og resten (52 tilfælde) viste moderat eller svag ErbB2-farvning. Kun 9 tilfælde (8,5%) var negative for c-MET farvning mens 14 tilfælde udviste stærk farvning og 82 sager viste moderat eller svag c-MET farvning. Interessant, ErbB3 var positiv i alle kolorektal cancer undersøgte væv (figur 2A). Desuden blev den heterogene udtryk for disse tre proteiner i fire kolorektal cancer væv undersøges nærmere af western-blot (figur 2B). Forskellen i ekspression mellem cancervæv og normale væv fra alle tre proteiner bekræftede pålideligheden af ​​IHC-farvning og yderligere angivet, at tre typer ekspressionsmønstre eksisterede i 105 tilfælde. Alle de undersøgte tilfælde kunne klassificeres som: ErbB3: c-MET co-overekspression kolorektal cancer, ErbB3: ErbB2 co-overekspression kolorektal cancer, og ErbB3: ErbB2: c-MET co-overekspression kolorektal cancer (figur 2C). Vi mener, at disse resultater er et godt eksempel på variation af tumor RTK udtryk mønster, og endvidere, at de molekylære mekanismer bag de forskellige mønstre er værdig til udforskning.

(A) Ratio for stærk /moderat /svag /negativ farvning af ErbB3, ErbB2 og c-MET i human colorectal cancer. (B) Påvisning af ErbB3, ErbB2 og c-MET i protein udvundet af vævsprøver af 4 tilfælde af kolorektal cancer. (C) Venn diagram, der viser co-ekspression af ErbB3, ErbB2 og c-MET.

Proliferation af colorektal cancer Celler medieres af enten ErbB3 /ErbB2 eller ErbB3 /C-MET signalveje

for at identificere egnede menneskelige kolorektale cancer cellelinjer svarende til de tre molekylære mønstre, som vi opdaget i de humane prøver, udtryk for ErbB2, ErbB3 og c-MET i 9 humane kolorektal cancer cellelinjer blev analyseret ved western blotting ( data ikke vist). Resultatet viste, at SW480 er et repræsentativt cellelinje co-udtrykkende ErbB2, ErbB3 og c-MET. Cellelinien LoVo kun co-over-udtrykker ErbB2 og ErbB3, mens SW948 er en repræsentativ cellelinie, som co-over-udtrykker ErbB3 og c-MET (figur 3A). Cellernes levedygtighed blev åbnet af MTS assay, og de relaterede mekanismer vil blive drøftet yderligere. Nogle inhibitorer og agonister af disse tre proteiner blev udvalgt herunder PHA-665.752 (PHA) og lapatinib, der er inhibitorer af c-MET og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), hhv. Når c-MET-signalering blev blokeret af PHA, cellelevedygtigheden af ​​SW480 og SW948 faldt betydeligt (figur 3 B og D); men ingen signifikant ændring i cellelevedygtighed forekom i LoVo celler, måske på grund af deres lave ekspression af c-MET (figur 3C). Omvendt lapatinib, en ErbB2-inhibitor, reducerede signifikant cellelevedygtigheden af ​​LoVo og SW480 celler, medens der næsten ingen virkning på SW948 celler, som har lav ErbB2-ekspression (figur 3D). Forskellene mellem LoVo og SW948 celler i deres respons på PHA og lapatinib skyldes muligvis forskelle i deres signaltransduktion mønster (Figur 3 C og D). Desuden for at undersøge, om agonisterne kan redde cellelevedygtighed, HGF, en agonist af c-MET, og heregulin-β1 (HRG1-β1), som binder til HER3 og inducerer dets heterodimerisering med de andre familiemedlemmer, blev anvendt. Både HGF og HRG1-β kunne delvist redde levedygtigheden af ​​SW480-celler (figur 3B); Men situationen var anderledes i LoVo og SW948 celler. HGF-stimulering forårsagede en ubetydelig forøgelse af cellelevedygtighed i LoVo-celler sammenlignet med LoVo celler behandlet med PHA (figur 3C). SW948-celler reagerede mere sensitivt på HGF, med en betydelig stigning i cellelevedygtighed sammenlignet med PHA-behandlede SW480-celler (figur 3D). Imidlertid SW948-celler reagerede mindre følsomt på HRG1-β1 sammenlignet med LoVo, måske på grund af deres lave ekspression af ErbB2, men cellelevedygtigheden af ​​SW948 blev stadig forøget, muligvis på grund af de andre receptorer i EGFR familien såsom EGFR og ErbB4 som kan begge dimerisere med ErbB3. Derfor blev forskellige svar udforsket på grund af forskellige molekylære mønstre af udtryk: ErbB3 /ErbB2 og ErbB3 /c-MET. Den nedstrøms signalering blev derefter undersøgt yderligere.

(A) Påvisning af ErbB3, ErbB2 og c-MET i de humane kolorektale cancer cellelinjer LoVo, SW948 og SW480 ved western-blot. (B, C, D) Cellelevedygtighed måles ved MTS-assay i de kolorektale cancercellelinjer LoVo, SW948 og SW480 behandles som angivet i figuren. Data er præsenteret som middelværdi ± SD, og ​​* P 0,05, ** P. 0,01 ved uparret Students t-test

Forskellige Molekylære Mønstre for kolorektal cancer Involver Aktivering af Downstream MAPK eller AKT Signaling

for at undersøge yderligere mekanismen for nedstrøms signalering af både molekylære mønstre i kolorektal cancer, cellelysater blev udnyttet til at analysere aktiveringen af ​​AKT og MAPK signalering som er velkendte nedstrøms signalveje i ErbB2 /ErbB3 og ErbB3 /c-met komplekser. Et inducerbart siRNA-system var involveret i undersøgelsen, og udtryk for ErbB3 kunne tavshed af doxycyclin (DOXY) behandling. Når SW948 blev behandlet med PHA eller DOXY, aktivering af både AKT og MAPK blev blokeret. Begge disse to signalveje kan reaktiveres ved HGF, men ingen signifikant reaktivering blev fundet, når ErbB3 blev stille selv med HGF behandling, hvilket indikerer, at aktivering af MAPK signalering i SW948 afhang mere på ErbB3 (figur 4A). Aktiveringen af ​​AKT og MAPK signalering blev åbnet på en anden måde i LoVo celler på grund af deres høje ekspression af ErbB2 /ErbB3. Både AKT og MAPK signalering blev effektivt blokeret, når de behandles med DOXY og lapatinib, hvilket indikerer værdiforringelse både ErbB3 og andre EGFR-molekyler, som kan inaktivere AKT og MAPK signalering. HRG1-β1 var i stand til kraftigt at aktivere både AKT og MAPK signalering; men dens aktivering virkning på AKT var mere afhængige af ErbB3 mens dens aktivering virkning på MAPK var mere afhængige af andre EGFR familiemedlemmer (figur 4B). Desuden er de behandlingsbetingelser vendes mellem disse to celler. Lapatinib har ringe effekt på aktiveringen i SW948-celler, men HRG1-β1 kan stadig inducere aktivering af både AKT og MAPK signalering selvom aktiveringsgraden er meget svagere end i LoVo celler (figur 4C). Tilsvarende c-MET-inhibitor PHA alene har næsten ingen effekt på AKT og MAPK signalering, og HGF kan næsten aktivere enten AKT eller MAPK signalering sandsynligvis på grund af dets lave ekspression af c-MET (figur 4D). Specificiteten af ​​væksten signalering via ErbB3 /ErbB2 eller ErbB3 /c-MET blev yderligere undersøgt ved hjælp specifikke hæmmere.

(A, B) Påvisning af AKT og MAPK signalering i SW948 og LoVo celler ved western-blot, med behandlingen angivet i figuren. (C, D) Påvisning af AKT og MAPK signalering ved western-blot i LoVo og SW948 celler med HGF eller HRG1-β1 behandling, med eller uden forskellige agonister eller antagonister, som angivet.

AKT og MAPK er to Cell-signalveje Governing Cell levedygtighed af tyk- og endetarmskræft cellelinier med forskellige receptorer Expression Mønstre

for yderligere at undersøge RTK udtryk variation i kolorektale cellelinjer, en række tests af cellernes levedygtighed og cellesignalering veje blev udført ved hjælp af specifikke inhibitorer af AKT og MAPK. For LoVo-celler, blev cellelevedygtighed faldt betydeligt, når de behandles med LY294002, en inhibitor af AKT-signalering. Der var imidlertid ingen signifikant virkning, når den blev behandlet med en inhibitor af c-MET, U0126. Hvis LoVo blev behandlet med begge inhibitorer, redning virkning HRG1-β1 på celler var meget stærkere end den af ​​HGF (figur 5A), og signaleringsaktivering analyse ved western-blot også indebærer, at aktivering af både AKT og MAPK delvist blev restaureret af HRG1 -β1 selv når de behandles med inhibitorer (figur 5B). Dette resultat indikerede, at cellelevedygtighed ikke var meget afhængig af ErbB3 /c-MET /MAPK signalering men i stedet afhang ErbB3 /ErbB2 /AKT signalering. Men situationen er ikke den samme i SW948 celler, hvor svækkelse af cellelevedygtighed ved inhibitor af c-MET, U0126, var stærkere end forårsaget af LY294002, og genoprettende effekt var anderledes end i LoVo celler, når de behandles med både LY294002 og U0126, med den genoprettende virkning af HGF er stærkere end HRG1-β1, og aktiveringen af ​​både AKT og MAPK signalering bliver stærkere induceret af HGF end HRG1-β1 (figur 5C, D). Tilsammen vores resultater viser, at kolorektal cancer udviser variation i onkogen RTK grund af forskellige molekylære ekspressionsmønstre herunder ErbB2 /ErbB3 /AKT og ErbB3 /c-MET /MAPK.

Forskelle i cellelevedygtighed i LoVo (A , b) og SW948 (C, D) celler efter behandling med forskellige agonister eller inhibitorer, som angivet. Data er præsenteret som middelværdi ± SD, og ​​** P. 0,01 ved uparret Students t-test

Diskussion

Aktivering af RTK er afgørende for udbredelsen og overlevelse af normal og maligne celler. For nylig er forskellige RTK aktiverende mutationer blevet identificeret i en undergruppe af kræftpatienter ved næste generation sekventering, hvilket antyder, at konstitutiv aktivering af RTK’er er en af ​​de underliggende mekanismer for udvikling af kræft. Men den resterende population af kræftpatienter har ingen sådanne mutationer indebærer, at der findes alternative RTK aktiverende mekanismer. Her viser vi en af ​​disse alternative mekanismer er overekspression af RTK familiemedlemmer c-MET, og ErbB2, ErbB3, i CRC celler samt repræsentative CRC-cellelinjer.

C-MET er en af ​​de receptortyrosinkinaser (RTK), som er vidt udbredt på overfladen af ​​epiteliale-endotel celler oprindelse. Dens eneste kendte ligand, hepatocytvækstfaktor (HGF), udtrykkes hovedsageligt i celler af mesenchymal oprindelse [11]. C-MET dimeriserer og autophosphorylates upon ligandbinding, hvilket igen skaber aktive docking sites for proteiner, der medierer seriel nedstrøms signalering aktivering herunder MAPK, PI3K-AKT, SRC og STAT. Talrige undersøgelser har rapporteret, at c-MET overudtrykkes i en række forskellige carcinomer, herunder lunge, bryst, ovarie, nyre, colorectal, skjoldbruskkirtel, lever og gastriske carcinomer [12] – [14]. Det er velkendt, at c-MET spiller vigtige roller i udviklingen af ​​kræft gennem sin spredningsfølsomme og angiogenese-fremmende effekter udøves af downstream onkogene veje, og metastase-fremmende virkning, som er overvejende afhængig af metalloprotease produktion. På grund af dets rolle i onkogenese og cancer progression, er c-MET betragtes som et vigtigt mål i anticancerterapi, og nogle biologiske antagonister eller monoklonale antistoffer rettet c-MET er dukket der er kendt som C-MET TKI [15] – [ ,,,0],18]. Visse gastrisk cancer og NSCLC cellelinjer vise udsøgt følsomhed c-MET TKI, men, celler /tumorer behandlet med c-MET TKI i sidste ende udvikle resistens. Denne resistens over for c-MET TKI er et resultat af at overvinde inhiberingen gennem vedvarende høj MAPK og PI3K /AKT-aktivitet, og EGFR familiemedlemmer kan fungere som supplerende receptorer for MAPK og PI3K /AKT aktivering mens c-MET bliver blokeret [19] – [22]. Mens erhvervelse af nye mutationer kan være en af ​​de mulige forklaringer på denne modstand i klinisk behandling, aktiverende mutationer af flere RTK’er, herunder ErbB2, ErbB3 og c-MET blev opdaget i human colorectal cancer og andre kræftformer [23] – [27]. RTK overekspression og dowmstream signal aktivering giver en alternativ og gratis mekanisme. Dog kan variabiliteten af ​​onkogene RTK ekspressionsniveauerne også understreger betydningen af ​​individuel kræftbehandling.

I den foreliggende undersøgelse, vi ikke kun bekræftet overekspression af c-MET, ErbB2 og ErbB3 i human kolorektal cancer , men også afslørede variation og komplementære af disse receptorer. Desuden har vi identificeret

in vitro

cellelinje modeller med forskellige molekylære ekspressionsmønstre, som afslører forskellige følsomhed over for behandling af både antagonister og agonister af c-MET og EGFR-signalering.

ErbB2-gen er også almindeligvis omtales som Her-2 /neu, et af vækstfaktorreceptorer førende cellesignalerende relateret til celleproliferation, adhæsion og bevægelse [28], [29]. Det er også en varm mål for signalering-baseret lægemiddeludvikling. Trastuzumab, en af ​​de relaterede lægemidler rettet mod ErbB2, binder ErbB2 og inducerer frakobling af ligand-uafhængig HER2-HER3 heterodimerer, hvilket forhindrer nedstrøms signalering. Imidlertid har flere undersøgelser vist, at trastuzumab behandling kan inducere resistens både ved amplifikation af signalering via andre ErbB-receptorer og ved krydstale med heterologe RTK’er [30] – [32]. Som vi rapporterer i den foreliggende undersøgelse, er c-MET også vist sig at være opreguleret i trastuzumab-resistent ErbB2-overudtrykkende celler efter udsættelse for trastuzumab. Endvidere en mekanistisk forsøg viste, at aktivering af c-MET beskytter celler mod trastuzumab ved ophævelse af induktion af p27. Dette er i overensstemmelse med resultatet opnået i vores undersøgelse, der viser, at der findes forskellige molekylære mønstre i human colorectal cancer. Heterogen udtryk for ErbB2 og ErbB3 med varierende kombinationer af RTK stiltiende potentielt forskellige kemoterapi projekter

Det forventes, at et stigende antal molekylær signalvej-baserede lægemidler vil dukke op, der tager sigte på en række forskellige mål.; imidlertid er det meget muligt, at ingen af ​​disse lægemidler alene vil have en dominerende antitumorvirkning. Kombinationsbehandling for kræft er en løbende og udvikle konceptet og vigtigere, personlig detektion og analyse af en persons molekylære udtryk mønster er uundværlig for en mere effektiv behandling med færre bivirkninger.