PLoS ONE: Udvikling af en ortotopisk Menneskelig kræft i bugspytkirtlen xenograftmodel Brug ultralydvejledt Injektion af Cells

Abstrakt

Mus har været ansat som modeller for kræft i over et århundrede, der giver betydelige fremskridt i vores forståelse af dette mangesidede familie af sygdomme. Især er ortotopisk tumor xenograft musemodeller fremstår som den præference for cancerforskning følge af forøget klinisk relevans i subkutane musemodeller. I den aktuelle undersøgelse, udviklede vi ortotopisk bugspytkirtelkræft xenograftmodeller i mus ved en minimalt invasiv metode, ultralydvejledt injektion (USGI) kan sammenlignes med meget invasive kirurgiske ortotopisk injektion (SOI) metoder. Denne optimerede metode forhindrede injektion komplikationer såsom rekyl af celler ved injektion kanalen eller lækage af celler ud i bugspytkirtlen i bughulen. Tumorvækst blev overvåget in vivo og kvantificeres ved ultralydsscanning ugentligt blev tumorer også påvist ved in vivo fluorescensimagografi ved anvendelse af en tumor målrettet molekylær probe. De gennemsnitlige tumorvolumener for USGI og SOI modeller efter 2 uger af tumorvækst var 205 mm

3 og 178 mm

3 hhv. Ved USGI af humane pancreas cancer cellelinjer, blev humane ortotopisk bugspytkirtelkræft xenografter etableret. Baseret på ultralydsscanning, den ortotopisk menneskelige bugspytkirtelkræft xenograft tage sats var 100% for både humane bugspytkirtelkræft anvendte cellelinier, MiaPaCa-2 og Su86.86 med gennemsnitlige tumor volumen 28 mm

3og 30 mm

3 . Vi viste, at denne USGI metode er muligt, reproducerbar, letkøbt, minimalt invasiv og forbedret sammenlignet med den meget invasiv SOI metode til oprettelse ortotopisk pancreas tumor xenograftmodeller egnet til molekylær billeddannelse

Henvisning:. Huynh AS, Abrahams DF Torres MS, Baldwin MK, Gillies RJ, Morse DL (2011) Udvikling af et ortotopisk Menneskelig kræft i bugspytkirtlen xenograftmodel Brug ultralydvejledt injektion af celler. PLoS ONE 6 (5): e20330. doi: 10,1371 /journal.pone.0020330

Redaktør: Maria G. Castro, University of California, Los Angeles, og Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: 11. marts 2011; Accepteret: 20. april, 2011; Udgivet: May 27, 2011

Copyright: © 2011 Huynh et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Grant Support : NIH /NCI R01-CA123547 (https://www.nih.gov/, https://www.cancer.gov/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mus er blevet anvendt som modeller for kræft i over et århundrede, der giver betydelige fremskridt i vores forståelse af denne mangesidede familie af sygdomme. Der er i øjeblikket fire hovedområder kræftforskning, der bruger musemodeller: grundlæggende biologi og fysiologi, eksperimentelle lægemidler, forebyggelse og genetik modtagelighed og risiko. Disse modeller har vist sig at være nyttige i validering af genfunktion, karakterisering af nye cancer gener og tumor biomarkører, få indsigt i de molekylære og cellulære mekanismer bag tumor initiering og flertrins processer tumorigenese, og giver bedre kliniske modeller i at teste nye terapeutiske strategier [1]. Især er tumor xenograft musemodeller almindeligvis anvendes i prækliniske undersøgelser. Humane tumor xenograftmodeller er skabt ved injektion af humane tumorceller dyrket fra kultur i en mus eller ved transplantation af en human tumormasse i en mus. Xenotransplantatet kan let accepteres af immunsvækkede mus såsom athymiske nøgne mus eller alvorligt kompromitteret immundefekte (SCID) mus [2]. Der er flere vigtige fordele ved at bruge humane tumorxenografter: de træk kompleksiteten af ​​genetiske og epigenetiske abnormiteter, der findes i den menneskelige tumor befolkning; kan anvendes til at hjælpe i udvikling af individualiserede molekylære terapeutiske metoder; og kan implanteres orthotopisk til at reproducere det organ miljø, hvor tumoren vokser, således at der kan moduleres effekten af ​​tumoren på dens mikromiljø [3].

De to hovedtyper af humane xenograft musemodeller anvendes til cancerforskning, heterotop og orthotopisk er defineret ved placeringen af ​​implanterede xenotransplantat. For heterotopiske subkutane modeller er xenotransplantat implanteret mellem dermis og underliggende muskler og er typisk placeret på flanken, på bagsiden eller trædepuden på musen. I mere end 30 år har det subkutane xenograftmodel været den mest udbredte præklinisk musemodel til kræftforskning, fordi det er hurtig, billig, let at reproducere og er blevet anset for tilstrækkeligt prækliniske at teste anticancerlægemidler. Den subkutane model har også fordelene ved at tilvejebringe visuel bekræftelse af, at mus anvendt i et eksperiment har tumorer før behandling; og tilvejebringelse af et middel til at vurdere tumorrespons eller vækst over tid, sammenlignet med intrakavitær modeller, hvor dyr overlevelse er eneste mål for respons [4]. Imidlertid har store ulemper i den prækliniske brug af subkutane xenograftmodeller blevet klart. Det er blevet konsekvent observeret, at stof regimer, der er helbredende i muse subkutan xenograftmodeller ofte ikke har en væsentlig effekt på human sygdom. Den primære årsag til denne fiasko kan skyldes den iagttagelse, at den subkutane mikromiljø er ikke relevant for den af ​​organet site af primær eller metastatisk sygdom. Derudover subkutane tumormodeller sjældent danne metastaser. Disse observationer tyder på, at heterotope tumormodeller behøver det ikke udgør passende steder for humane tumorer er ikke forudsigende, når de anvendes til at teste reaktioner på anti-cancer medicin [5].

For at afhjælpe manglerne ved subkutane modeller, ortotopisk tumorxenoplantater i stigende grad udforskes for øget klinisk relevans. I denne model er tumor xenograft enten implanteres eller injiceres i den tilsvarende organ, hvorfra cancer stammer, eller hvor metastaser findes i patienter. Fordele ved ortotopisk modeller omfatter anvendelse af det relevante site for tumor-vært interaktioner, fremkomsten af ​​sygdomsspecifikke relevante metastaser, evnen til at studere stedspecifik afhængighed af terapi, organspecifik ekspression af gener og at kliniske scenarier kan replikeres, f.eks kirurgisk fjernelse af den primære tumor eller adjuverende behandling af okkult metastase [5]. Store ulemper er, at ortotopisk tumor xenograft generation er arbejdskrævende, teknisk udfordrende, dyre, kræver længere healing og restitutionstid og at overvågning tumorvolumen kræver relativt lavere throughput billeddannende metoder sammenlignet med anvendelsen af ​​kalibre [5]. Ikke desto mindre er ortotopisk tumormodeller fremstår som den præference for kræftforskning grund af den øgede kliniske relevans.

Der er et stort behov for at udvikle forbedrede modeller til prækliniske undersøgelser af kræft i bugspytkirtlen. Det anslås, at 43,140 mennesker (21,370 mænd og 21,770 kvinder) vil blive diagnosticeret med kræft i bugspytkirtlen i 2010, og at 36.800 mænd og kvinder vil dø af denne sygdom [6]. Prognosen er dårlig, med færre end 5% overlevelse fem år efter diagnosen, og komplet remission er sjælden. Ingen effektive tidlig påvisning metoder er blevet udviklet og fremskridt i udviklingen af ​​behandling og terapi er stagnerende. Gemcitabin har været standard kemoterapi for mere end et årti. Men fordelen ved monoterapi gemcitabin behandling i avanceret og metastatisk bugspytkirtelkræft er lille [7]. Brugen af ​​ortotopisk xenograftmodeller for præklinisk bugspytkirtelkræft forskning kan forbedre udviklingen af ​​terapier og billeddiagnostiske metoder diagnostiske mod denne sygdom.

I denne undersøgelse undersøgte vi mulighederne for at udvikle ortotopisk menneskelige bugspytkirtelkræft xenograftmodeller hjælp ultralydvejledt injektion (USGI) af tumorceller. Ortotopisk tumor xenograft musemodeller for pancreascancer er blevet godt etableret i mange år. Men disse modeller kræver den meget invasive kirurgiske ortotopisk implantation (SOI), i tumorceller eller skiver i bugspytkirtlen. Denne procedure kan resultere i signifikant traume, der kræver postoperativ restitutionstid, og kan føre til bivirkninger, såsom infektion, blødning, tumor adhæsion til andre organer, og andre effekter fra det kirurgiske stress, fx sårheling.

Nylige fremskridt har gjort det muligt at udvikle billed–styrede fremgangsmåder til ortotopisk injektion af celler eller væv ind indre organer, hvilket potentielt eliminerer behovet for højt invasive kirurgiske procedurer. Især kan udføres minimalt invasiv realtid ultralydvejledt injektion (USGI) af tumorceller for at skabe ortotopisk xenograftmodeller. USGI af tumorceller er blevet en accepteret metode til udvikling ortotopisk levercellecancer modeller. For eksempel blev en multiresistent model etableret med succes i nøgne mus via ortotopisk implantation af multiresistente humane HCC-celler instrueret af ultrasonografi [8]. Vi har med succes udviklet en hidtil ukendt ortotopisk xenograft model for lymfeknudemetastaser, hvor præcise antal af tumorceller blev injiceret i armhulen lymfeknuder under anvendelse ultralydbillede vejledning [9].

En syngeniske orthotopisk murine pancreascancer musemodel var udviklet af injektion af murine pankreatiske duktale adenocarcinomceller, Pan02, i eller i nærheden pancreas fra C57BL /6 mus under anvendelse SonoCT ultralyd vejledning [10]. Den ultralydvejledt metode blev indgået for at være gunstig i forhold til den subkutane model til undersøgelse af indflydelsen af ​​immunterapi på tumorvækst [10]. Dog tumorer som følge af denne undersøgelse viste sig at blive formidlet bredt i hele bughulen og ikke isoleret udelukkende bugspytkirtlen, og det var ikke klart, om dette var et resultat af metastase, eller eventuelt celler frigives i det omkringliggende område under proceduren.

Vores nuværende undersøgelse er den første til at rapportere ortotopisk injektion af humane bugspytkirtelkræftceller direkte ind bugspytkirtlen i immunsvækkede mus ved ultralyd-image vejledning. Vi har fuldt karakteriseret tumoren tage i forhold til samme kirurgiske model og har bekræftet ved histologi, at tumorerne oprindeligt blev isoleret på bugspytkirtlen fulgt af efterfølgende metastase i peritonealhulen i senere uger. Derudover har vi vist, at en målrettet molekylær billeddannelse middel kan afgives specifikt gennem vaskulaturen til de resulterende tumorer i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Alle procedurer var i overensstemmelse med vejledningen for pasning og anvendelse af forsøgsdyr Resources (1996), National Research Council, og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, University of South Florida under den godkendte protokol R3715. Immunkompromitterede mus er opstaldet i en ren facilitet med særlige vilkår, der omfatter HEPA filtreret ventilerede bure, autoklaveret strøelse, autoklaveret boliger, autoklaveret vand, bestrålede fødevarer og særlige bur skiftende procedurer. Mus håndteres under aseptiske betingelser, herunder at bære handsker, kittel og sko,.

Cell Culture

MiaPaCa-2-celler (ATCC CRL-1420), SU86.86 celler (ATCC EF- referencelaboratoriet 1837), og de parentale HCT116 celler (ATCC CCL-247) blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA). De HCT116 /δOR + colon cancerceller blev gensplejset fra forældrenes HCT116 cellelinie til højt over-udtrykke δ-opioid receptor [11]. Ekspression af δOR på overfladen af ​​HCT116 og HCT116 /δOR + -celler blev karakteriseret før injektion under anvendelse af en

in vitro

tidsopløst fluorescens bindingsassay [12]. HCT116 /δOR +, og MiaPaCa-2-celler blev dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% normalt kalveserum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) og 1% penicillin /streptomycin-opløsning (Sigma, St. Louis, MO). De SU86.86 celler blev dyrket i RPMI-medier (Invitrogen) suppleret med 10% FBS (Atlanta Biologicals). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO2.

Kirurgisk ortotopisk kræft i bugspytkirtlen xenotransplantat musemodel

I sammenligning med USGI teknikken, 5 kvindelige nu /nu-mus 6-8 uger gamle (Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN) undergik en etableret kirurgisk metode til ortotopisk injektion af celler i pancreas. Til denne procedure blev musene bedøvet under isofluran gas; den abdominale hud og muskel blev indsnit lige ved midterlinjen og direkte over bugspytkirtlen til at tillade visualisering af pancreas lapper; bugspytkirtlen blev forsigtigt tilbagetrukket og placeret til at muliggøre direkte injektion af en 20 pi bolus på 1 × 10

6 HCT116 /δOR + celler /PBS under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 30 gauge nål; vellykket levering af celler i pancreas blev observeret under forstørrelse under anvendelse af et dissektionsmikroskop; pancreas blev placeret tilbage i bughulen; og både muskel- og hudlag lukket med kirurgisk lim. Efter genopretning fra kirurgi blev mus overvåges og vejet dagligt.

Ultrasound Imaging

Visual Sonics Vevo 2100 Imaging Station blev brugt til alle ultralydsscanning. opkøb billede blev udført ved hjælp af den forbedrede abdominale måling pakke i B-mode og indstillinger 3-D-tilstand. Fysiologiske status (EKG, respiration, blodtryk, og legemstemperatur) af musene blev nøje overvåget under hver billedoptagelse session. Mus blev afbildet før tumor xenografting at etablere baseline billeder og derefter filmede ugen i op til 4 uger ved hjælp af ultralyd til at overvåge udviklingen af ​​ortotopisk bugspytkirtelkræft implanteret.

Fluorescens Imaging

Mus bærende ortotopisk pancreas xenotransplantater af HCT116 /δOR + -celler blev administreret 4,5 nmol /kg kropsvægt af DMT-Tic-Cy5 ved injektion i halevenen. DMT-Tic-Cy5 er en høj affinitet (3 nM Ki) peptidomimedic målrettet probe konjugeret til fluorescerende farvestof (Cy5), der blev anvendt til at bestemme placeringen af ​​de HCT116 /δOR + -celler ved

in vivo

ex vivo

fluorescensafbildning [12]. Efter injektion blev musene holdt i et særligt mørkt kammer og beskyttet mod lyseksponering så meget som muligt for at forhindre fotoblegning af farvestoffet. Lucerne-fri mad og særlige bur strøelse blev brugt til at minimere autofluorescens.

In vivo

ex vivo

fluorescens billeder blev erhvervet ved hjælp af Caliper Life Sciences Xenogen IVIS 200-serien Imaging System. Den 615-665 nm excitation og 695-770 nm emission filtre blev anvendt. Indfangningstider varierede fra 0 s til 10 s at holde intensitet tællinger inden for området fra 15.000 til 60.000 for at forhindre mætning. Forud for dataanalyse blev instrument baggrund subtraktioner udført. Living Billede 3.2 Software blev brugt til at tegne regioner af interesse (ROI) i løbet af tumorerne til at bestemme den gennemsnitlige fluorescens signal (effektivitet enheder). Effektivitet enheder er beregnet ved at normalisere fluorescens emission billeder til variationer i den indfaldende excitation lysfordeling på scenen. Autofluorescens baggrund blev fratrukket ved at bestemme den gennemsnitlige tumor fluorescens signal før injektion.

Histologi af pancreas Xenografter

pancreas af musene blev høstet, visuelt, fikseret i 10% formalin buffer, forarbejdede , indlejret, tri-delt, H 0,002 (figur 5). Baseret på

in vivo

ultralyd og fluorescens billeddannelse, take sats var 100% for begge modeller, mens hjælp HCT116 /δOR + tumorceller.

Den blå skraverede område repræsenterer tumoren genereres ved at udføre 3D-tumor volumen målinger. A) ultralyd billede af USGI model, B)

in vivo

fluorescens billede af USGI model, C)

ex vivo

fluorescens billede af musen bugspytkirtlen fra USGI model D) ultralyd billede af SOI model, E)

in vivo

fluorescens billede af SOI model, og F)

ex vivo

fluorescens billede af musen bugspytkirtlen fra SOI model.

for at afgøre, om USGI kan bruges med humane kræft i bugspytkirtlen cellelinjer, 5 mus undergik USGI af 2 × 10

6 MiaPaCa-2-celler i en 20 uL bolus og en anden 5 mus undergik USGI på 2 × 10

6 SU86.86 celler. Efter 2 uger, alle mus havde ortotopisk pancreas tumorxenotransplantater observeret af ultralydbilleddannelse og visuel inspektion (figur 6). Mean tumorvolumener (n = 5) blev afbildet over tid for de MiaPaCa-2 og Su86.86 humane pancreatiske tumorer (figur 7) og registreres i tabel 1. Baseret på

in vivo

ultralydsbilleddannelse, det ortotopisk xenograft tage sats var 100%, mens du bruger både humane bugspytkirtelkræft cellelinjer, MiaPaCa-2 og Su86.86.

den blå skraverede område repræsenterer tumoren genereres ved at udføre 3D tumor volumen målinger.

Validering af Ex vivo fluorescens Imaging og Histologi

Umiddelbart efter

in vivo

fluorescens billeddannelse, den HCT116 /δOR + tumor xeongraft bærende mus blev humant aflivet, visuelt for tilstedeværelsen af tumorer andre steder i kroppen, og vigtige organer (hjerte, lunge, nyrer, lever, milt, pancreas, mavetarmkanal) fjernes, og

ex vivo Salg fluorescensafbildninger erhvervede 24 timer efter indgivelse af det målrettede fluorescerende probe.

ex vivo

betyde fluorescens (n ​​= 5) erhvervet fra pancreas af begge modeller var relativt den samme (figur 5). Som bestemt ved

ex vivo

billeddannelse, probe specifik fluorescens var til stede i 100% af muse pancreas (n = 5) for begge modeller, og blev observeret et lavt niveau af fluorescens i nyrerne (figur 8).

Ved histologi blev tumorer observeret i 100% af pancreas, der undergik USGI eller SOI hjælp HCT116 /δOR + celler. Tumorer blev observeret i kun 4 ud af 5 (80%) af pancreas injiceret med MiaPaCa-2 eller SU86.86 celler, selvom take rate var 100% baseret på den amerikanske billeddannelse. Histologi fra disse pancreas blev først fremstillet ud fra 3 sektioner, der var 50 um fra hinanden, og derfor er det sandsynligt, at tumorer blev overset ved skæring. Figur 9 viser repræsentativ H 0,002, i disse væv sammenlignet med USGI. Dette skyldes muligvis forøget metastase fra xenotransplantater genereret af SOI forhold til USGI samtidig-punkt efter injektion af celler (2 uger). Baseret på den gennemsnitlige mængde malignitet i forhold til normal bugspytkirtlen væv som bestemt af patolog (tabel 1), de 2 metoder gav næsten lige typer af malignitet; med et gennemsnit på 85% cellulær, 11% stromale og 4% nekrotiske komponenter. Derfor har vi påvist, at orthotopisk pankreastumor xenografting af USGI er muligt og sammenlignes med resultater opnået ved SOI.

Da de indledende faser af undersøgelsen anvendte colorektale cancerceller, to humane pancreatiske cellelinjer, MiaPaCa-2 og