PLoS ONE: Forøget ekspression af protease-aktiveret receptor 4 og trefoil-faktor 2 i Human Colorectal Cancer

abstrakt

Protease-aktiveret receptor 4 (PAR4), et medlem af G-protein-koblede receptorer familie, var for nylig rapporteret udviser reduceret ekspression i gastrisk cancer og esophageal skællede cancer, men forøget ekspression under udviklingen af ​​prostatacancer. Trefoil-faktor 2 (TFF2), en lille peptid udtrykkes konstitutivt i maveslimhinden, spiller en beskyttende rolle ved tilbagelevering af maveslimhinden. Altered TFF2 udtryk blev også relateret til udviklingen af ​​gastrointestinal cancer. TFF2 er blevet bekræftet til at fremme celle migration via PAR4, men roller PAR4 og TFF2 i forløbet af kolorektal cancer er stadig ukendt. I denne undersøgelse blev ekspressionsniveauet af PAR4 og TFF2 i kolorektal cancer væv målt ved hjælp af real-time PCR (n = 38), western blotting (n = 38) og væv microarrays (n = 66). MRNA og protein ekspressionsniveauer af PAR4 og TFF2 blev bemærkelsesværdigt forøget i kolorektal cancer sammenlignet med matchede noncancerous væv, især i positiv lymfeknude og dårligt differentierede kræftformer. Den kolorektal carcinom celler LoVo viste en øget respons på TFF2 som vurderet ved celle invasion på PAR4 udtryk. Men efter indgriben PAR4 udtryk PAR4 positiv kolorektal carcinom celler HT-29 var mindre lydhøre over for TFF2 i celle invasion. Genomisk hydrogensulfit sekventering viste hypometylering af PAR4 promotor i kolorektal cancer væv og hypermethyleringen i den normale slimhinde, der foreslog den lave methylering af promotor blev korreleret til øget PAR4 udtryk. Taget sammen viste resultaterne, at opreguleret ekspression af PAR4 og TFF2 hyppigt forekommer i kolorektale cancer væv, og at overekspression af PAR4 kan skyldes promotor hypometylering. Mens TFF2 fremmer invasion aktivitet LoVo celler overeksprimerer PAR4, og denne virkning blev signifikant nedsat, da PAR4 blev knockdowned i HT-29 celler. Vores resultater vil være nyttigt i yderligere undersøgelser af funktioner og molekylære mekanismer i proteinase-aktiverede receptorer (Pars) og Trefoil faktor faktorer (TFFs) under udviklingen af ​​kolorektal cancer

Henvisning:. Yu G, Jiang P, Xiang Y, Zhang Y, Zhu Z, Zhang C, et al. (2015) forøget ekspression af protease-aktiveret receptor 4 og trefoil-faktor 2 i Human kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (4): e0122678. doi: 10,1371 /journal.pone.0122678

Academic Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA

Modtaget: Juni 4, 2014, Accepteret: 24. februar, 2015; Udgivet: 13 April, 2015

Copyright: © 2015 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den kinesiske National Natural Science Foundation (81160302, 31270835), Chinese Academy of Sciences (KJZD-EW-L03), Yunnan provinsen Videnskab og Teknologi afdeling Basic Research Foundation (2011FZ109) og stat Key Laboratory of Genetic Resource og Evolution (GREKF11-13)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den progression af kolorektal cancer er en flertrinsproces involveret i polygenetic ændringer i prooncogenes og /eller tumorsuppressorgener, og afvigende epigenetisk genregulering kan føre til unormal vækst af maligne tumorer [1,2]. PAR’er er syv-transmembrane G-protein-koblede receptorer (GPCR), der omfatter fire medlemmer navngivne PAR1, PAR2, PAR3 og PAR4 [3]. Have evnen til nedbrydning af extracellulære matrixproteiner, PAR’er tjene som signalmolekyler involveret i tumorcellemigration, invasion og metastase [4]. PAR1, som i vid udstrækning blev udtrykt i kræft, fremmet tumor tilblivelse og invasion af brystkræftceller og kolorektal celler [5,6]. PAR2, overudtrykkes i prostatacancer, fremmet prostatacancer cellemigrering [7]. Tværtimod PAR2 viste også en tumor-beskyttende rolle i hudkræft [8]. PAR3 blev fundet i nyre og lever cancer [9,10]. PAR4 ekspression er kraftigt detekteret i lunge, skjoldbruskkirtel, bugspytkirtel, tyndtarm og testis ved Northern blot [11]. Men udtrykket og potentielle roller PAR4 i tumorigenese er stadig ukendt. PAR4 ekspression var til stede i normal colon mucosa, men optrådte indlysende farvning i dysplastiske og colorectalous slimhinde. PAR4 mRNA blev fundet i 10 ud af 14 (71%) humane kolorektal carcinom cellelinjer [12].

Trefoil faktorer (TFFs), i vid udstrækning udtrykt i slimhinden i mave-tarmkanalen, er små og kompakte peptider, der indeholder en eller to trefoil domæner. Tre nært beslægtede TFFs kendes i human, PS2 (TFF1), spasmolytisk polypeptid (SP eller TFF2), og intestinal trefoil-faktor (ITF eller TFF3) [13]. TFFs peptider menes at bidrage til slimhindeheling og tilbagelevering i kraft af at fremme cellevandring og undertrykke apoptose [14]. TFFs er også involveret i tumorigenese [15]. TFF2, der indeholder to trefoil domæner, menes at være den primære cytobeskyttende trefoil-faktor i maven, og ekspressionsniveauet af TFF2 dereguleret i mavesår og kræftvæv [16]. I vores seneste forskning har TFF2 vist sig at fremme epithelcellevandring og sårheling via PAR4 involverede phosphorylering af ERK1 /2 [17], men de detalje funktioner og molekylære mekanismer i PAR4 og TFF2 i progressionen af ​​gastrointestinal tumor er ikke blevet opdaget . I undersøgelsen viste vi ekspressionsniveauerne af PAR4 og TFF2 blev forhøjet i kolorektal cancer væv sammenlignet med den matchede noncancerous slimhinde, og opregulering udtryk for PAR4 i tarmkræft kan skyldes promotor hypometylering. Desuden viste vores data, at TFF2 fremmer kolorektal cancer celle invasion ved at aktivere PAR4.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af Kunming Institute of Zoology, den Chinese Academy of Sciences og Kunming Medical University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienterne, før de får prøver til denne undersøgelse.

Undersøgelse emner

I alt 38 patienter med kolorektal cancer, som indvilligede i at deltage i vores undersøgelse, underskrevet informeret samtykke danne og modtog operationer på First Affiliated Hospital i Kunming Medical University. Kolorektale prøver blev indhentet fra kolorektale tumorvæv og de tilstødende ikke-kræft områder, som var mindst 6 cm væk fra tumoren. De opsamlede væv blev yderligere bekræftet ved histologi og blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Kolorektal cancer væv microarray repræsenterer 66 tarmkræft med deres ikke-neoplastiske resektionsmarginer konstrueret [18] var fra Shanghai overgå Biochip Center (Shanghai, Kina).

RNA ekstraktion og polymerasekædereaktion (PCR)

RNA-ekstraktion og første-streng cDNA-syntese blev udført som tidligere beskrevet [19]. For semi-kvantitativ RT-PCR og real-time PCR, de anvendte primere var som følger: primerne til PAR4 (147 bp produkt) var 5′-CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3 ‘(fremad) og 5′-ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG-3’ (revers ); for TFF2 (74 bp produkt) var 5’CTGCTTCTCCAACTTCATCT-3 ‘(fremad) og 5′-CTTAGTAATGGCAGTCTTCC-3′ (tilbage); og til intern kontrol glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH, 107 bp produkt), var 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 ‘(fremad) og 5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’ (revers). Efter RT-PCR blev amplikoner af PAR4, TFF2 og GAPDH elektroforeret i 2% agarosegeler, farvet med ethidiumbromid og betragtes under ultraviolet belysning.

Kvantitativ PCR blev udført med en kontinuerlig fluorescensdetektor (Opticon Monitor, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). PCR-reaktioner for PAR4, TFF2 og GAPDH blev udført under anvendelse af et SYBR Green real-time PCR kit (Takara, Dalian, Kina) med betingelsen af: indledende denaturering ved 95 ° C i 1 min, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 15 s og 72 ° C i 20 s. Hver prøve blev kørt tredobbelt. Kontroller uden skabelon (ingen cDNA i PCR) blev kørt til påvisning uspecifik eller genomisk amplifikation og primerdimerisering. Fluorescens kurve analyse blev udført ved anvendelse af Opticon Monitor software. Relativ kvantitativ evaluering af PAR4 og TFF2 ekspressionsniveauerne blev udført via e-metoden og udtrykt som et forhold mellem udskrift af PAR4 (TFF2) til GAPDH i tumorvæv. Identiteterne af RT-PCR og real-time PCR-produkter blev bekræftet ved DNA-sekventering.

Tissue immunhistokemi

Tissue immunohistokemi blev udført som tidligere beskrevet [12]. Kort fortalt blev antigen-genvinding udføres ved opvarmning i en autoklav ved 121 ° C i 5 min. Afvoksede snit blev præ-inkuberet med blokerende serum og derefter inkuberet ved 4 ° C natten over med anti-human PAR4 antistof (C-20, 1: 1200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) og det anti-humane TFF2 antistof (P -19, 1: 800; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), hhv. Specifik binding blev detekteret ved et streptavidin-biotin-peroxidase assaykit (Maxim, Fujian, Kina). Afsnittet blev modfarvet med Harris hematoxylin. Direkte mikroskopiske mikrografer blev taget med et Leica DFC320 kamera styret af Leica IM50 software (Leica, Tyskland). Sektioner inkuberet med normalt gede IgG tjente som en negativ kontrol. Specificitet af antistofferne for PAR4 og TFF2 blev bekræftet ved præ-inkubering natten over ved 4 ° C med deres respektive antigener (Santa Cruz) i en 20-fold molært overskud af antigen til antistoffer. Præ-inkubering med PAR4 og TFF2 antigen medførte et fravær af immunolabeling.

Immunhistokemisk farvning blev vurderet semikvantitativt ved at måle både intensiteten af ​​farvning (0, 1, 2 eller 3), og omfanget af farvning (0, 0%, 1, 0-10%, 2, 10-50%, 3, 50-100%). Pointene for intensiteten og omfanget af farvning blev ganget at give et vægtet score for hver enkelt sag (maksimalt mulige, 9). For den statistiske analyse blev de vægtede score grupperet i to kategorier, hvor snesevis af 0-3 blev betragtet negativt og 4-9 positiv [20].

Western blot

Vævsprøver blev homogeniseret i Radioimmunoprecipitaion Assay Buffer (Sigma) indeholdende cocktail af proteaseinhibitorer (Sigma). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved et protein assay kit (Bio-Rad). Prøver (indeholdende 30 ug protein) blev påsat en SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og derefter overført på en PVDF-membran. Membranerne blev derefter blokeret med 3% bovint serumalbumin (BSA) og inkuberet med passende PAR4 og TFF2 primære og sekundære antistoffer, henholdsvis. Proteiner blev visualiseret med Super Signal reagenser (Pierce, Rockford, IL, USA).

Bisulfite sekventering

Genomisk DNA fra tyktarms- og endetarmskræft og ikke-neoplastiske væv blev isoleret med den universelle Genomisk DNA Extraction Kit (Takara) og bisulfit-konverteret ved hjælp af CpGenome Fast DNA Modification Kit (CHEMICON). PAR4 promotorsekvenser blev amplificeret fra bisulfit omdannet DNA ved PCR, oprenset fra agarosegeler og subklonet i pMD19-T Vector (Takara). For hver prøve blev 19 individuelle kloner sekventeret for at identificere methylerede cytosinrester. PCR primer sekvenser (frem og bak) for PAR4 var 5′-TTTAAGGGTGATTTTAGGAAAGGTTTAGAG-3 ‘og 5′-ACTATAACCTCAAACTTCCTACCTC-3’.

Cell kultur

Humane kolorektale cancer cellelinjer LoVo og HT 29 var fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De LoVo celler, der overudtrykker PAR4 (LoVo-PAR4), og cellerne transficeret med en mock plasmid (LoVo-mock) blev selekteret ved 800ug /mL G418 ifølge vores tidligere undersøgelser [17]. LoVo celler blev dyrket i Hams F12-medium suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin, og blev dyrket i en fugtig atmosfære med 5% CO

2 ved 37 ° C. Til behandling med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC, Sigma, 95 St. Louis, MO, USA), blev celler podet med en tæthed på 1 x 10

6 i en 60 mm skål . Efter 24 timer blev celler behandlet med 10 pM 5-aza-dC. DMSO blev behandlet parallelt som kontrol. Totale celler blev opsamlet efter 72 timers tilsætning 5-Aza-dC og underkastet RT-PCR og Western blotting-analyse.

Knockdown af PAR4 i HT-29-celler

lentivirus udtrykker shRNA blev dannet ved co-transfektion PAR4 shRNA plasmider med pCMV-dR8.2 dvpr og pCMV-VSVG emballage plasmider ind 293FT celler. HT-29 celler transficeret med pGIPZ-shPAR4 eller tom vektor pGIPZ blev udvalgt med 5 ug /ml puromycin til generering HT-29-shPAR4 og HT-29-pGIPZ hhv. Cellerne blev dyrket i DMEM suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin.

celleinvasion

Invasion aktiviteter LoVo- mock og LoVo-PAR4 celler og HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 celler in vitro blev målt ved anvendelse af Matrigel invasion assay [21]. Den InnoCyte Cell Invasion Assay Kit (8 um porestørrelse, Calbiochem, Merck) blev anvendt ifølge producentens protokol. Kort fortalt, 5 × 10

4 celler af LoVo-mock, LoVo-PAR4, HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 blev hver tilsat til det øvre kammer, og medium indeholdende rekombinant TFF2 blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubering 24 timer ved 37 ° C blev cellesuspensionen bortkastet, og det øvre kammer inserts blev forsigtigt placeret i cellefarvning opløsning i 30 minutter. Efter det nedre kammer celler indeholdende de løsnede celler blev inkuberet yderligere 30 minutter under de samme betingelser. Endelig 200 pi de løsnede celler blev overført dobbelt til brøndene i en 96-brønds plade, og målte fluorescens ved en excitationsbølgelængde på 485 ± 10 nm og en emissionsbølgelængde på 520 ± 10 nm. I mellemtiden blev det nedre kammer celler fotograferet gennem det konfokale laser fluorescensmikroskopi.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført af SPSS 11.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) . Den chi i anden-test (tabel 1 og 2) og Mann-Whitney U Text blev anvendt til betydningen af ​​korrelationer mellem PAR4 og TFF2 ekspression og kliniske patologiske parametre. Forskelle i de numeriske data mellem de parrede grupper blev evalueret ved brug af parret Students test. Niveauet af statistisk signifikans blev fastsat til niveauet for

s

. 0,05

Resultater

Ekspressionsniveauerne for PAR4 og TFF2 mRNA øges i kolorektale cancer væv

udtryk for PAR4 og TFF2 mRNA i kolorektale væv blev undersøgt ved RT-PCR. Som vist i fig 1A, blev RT-PCR udført på matchede normale og cancer prøver tilfældigt udvalgt fra fire patienter, og resultaterne viste PAR4 og TFF2 mRNA-niveauer væsentligt forøgede i kræftformer væv sammenlignet med de matchede normale væv.

(A) De matchede normale (normale) og kræft (kræft) væv fra hver patienter udvalgt tilfældigt blev analyseret ved RT-PCR under anvendelse PAR4- og GAPDH- specifikke primere (n = 4). Efter prøverne var normaliseret til GAPDH niveauer, blev mRNA-niveauer af PAR4 og TFF2 steget betydeligt i kræft i forhold til de normale væv; (B) Western blot af væv lysater fra fire tilfælde af kolorektal cancer (kræft) og relevante tilstødende ikke-neoplastiske slimhinde (normal). Ekspressionen af ​​actin blev tjente som kontrol. Den betydelige opregulering ekspression af PAR4 blev observeret i cancervæv i modsætning til deres matchede normale væv (n = 4).

Dernæst undersøgte vi niveauerne af PAR4 og TFF2 mRNA i 38 kolorektal cancer prøver ved real-time PCR. Den opreguleret af PAR4 og TFF2 i kolorektale tumorer var 58% (22 af 38) sammenlignet med den matchede ikke-neoplastisk slimhinde. Vi undersøgte yderligere det kliniske betydning af opreguleret udtryk på klinik patologiske data. Der var signifikante forskelle i PAR4 og TFF2 mRNA-ekspression i lymfeknude invasive tumorer versus ikke-invasive tumorer (

s

= 0,016 og

s

= 0,002, chi kvadreret tekst). Forskellen blev også observeret i dårlig-opdelte tumor versus vel- /moderated- differentierede tumorer (

s

= 0,002 og

s

= 0,020, chi kvadreret tekst) (tabel 1). I detaljer blev PAR4 mRNA steg med 2,2 (1,8, 4,7) (kvartil 25, kvartil 75) folder på 14 lymfeknude invasive tumorer og med 1,0 (0,4, 2,0) folder på 24 ikke-invasive tumorer (

p

= 0,008, Mann-Whitney U tekst); TFF2 mRNA blev forøget med 3,2 (2,2, 7,6) folder i 14 lymfeknudeceller invasive tumorer og med 0,8 (0,3, 1,5) foldes på 24 ikke-invasive tumorer (

s

= 0,001, Mann-Whitney U Text) (fig 2A). Desuden blev PAR4 mRNA forøget med 2,3 (2,0, 3,8) folder i 16 fattige-opdelte tumorer og med 0,9 (0,5, 1,2) folder i 22 vel- /moderated- differentierede kræftformer (

s

= 0,001, Mann -Whitney U tekst); TFF2 mRNA blev forøget med 2,2 (1,8, 5,8) folder i 16 fattige differentierede tumorer og med 0,8 (0,3, 1,5) folder i 22 vel- /modereret-opdelte kræftformer (

s

= 0,002, Mann-Whitney U Text) (fig 2B).

Angivelse af PAR4 og TFF2 blev målt i 38 patienter med tyktarmskræft ved real-time PCR. (A) PAR4 mRNA blev forøget i 86% (12 af 14) lymfeknude invasive tumorer og 42% (10 af 24) ikke-invasive tumorer. TFF2 mRNA blev forøget i 93% (13 af 14) lymfeknude invasive tumorer og 38% (9 af 24) ikke-invasive tumorer. Der var signifikant forskel i PAR4 (p = 0,008) og TFF2 (p = 0,001) mRNA-ekspression mellem lymfeknude invasive tumorer og ikke-invasive tumorer; (B) PAR4 mRNA blev forøget i 88% (14 af 16) dårlige-opdelte kræft og 36% (8 af 22) vel- /modereret-opdelte kræftformer. TFF2 mRNA blev forøget i 81% (13 af 16) dårlige-opdelte kræft og 46% (9 af 22) vel- /modereret-opdelte kræftformer. Også der er en signifikant forskel på PAR4 (p = 0,001) og TFF2 (p = 0,002) mRNA-ekspression mellem dårlig differentieret og vel- /modereret-opdelte cancere; Mean gange stigning i tumorvævet i forhold til ikke-neoplastisk colorektal væv blev vist. Median (kvartil 25, kvartil 75) blev anvendt til at sammenligne folder af PAR4 (TFF2) stigning i lymfeknudeceller invasive tumorer og ikke-invasive tumorer, og fattige-opdelte cancere og vel- /modereret-opdelte cancere. De øgede folder ” 1″ blev defineret som “øget”, hvorimod forøgede folder af “≤1” blev defineret som “ikke øget”

Protein niveauer af PAR4 og TFF2 blev forøget i. de kolorektale cancer væv

PAR4 og TFF2 proteiner var lave eller opdages i den normale kolorektal slimhinde ved western blotting analyse (figur 1B). Men i patientens væv med kolorektal cancer, efter prøverne blev normaliseret til p-actin niveauer, en betydelig forøget ekspression af PAR4 og TFF2 blev observeret i kolorektale cancer væv sammenlignet med de matchede ikke-maligne væv (Fig 1B).

Dernæst udførte vi immunhistokemisk farvning til at analysere protein ekspressionsniveauerne af PAR4 og TFF2

in vivo

. Der var næsten ingen ekspression af PAR4 og TFF2 i ikke neoplastiske colorektale epithelceller, men ekspression blev signifikant forøget i maligne kolorektale epitelceller. Desuden blev de fleste af PAR4 og TFF2 farvning i maligne kolorektale cancer prøver lokaliseret i cytoplasmaet (figur 3). I 66 analyserede prøver blev PAR4 udtryk opreguleret i 57 (86,1%) kolorektal cancer prøver sammenlignet med den matchede normale slimhinde. TFF2 udtryk blev opreguleret i 46 (69,7%) kolorektal cancer prøver. Hertil kommer, at forskellene i PAR4 og TFF2 proteinekspression mellem fattige-opdelte og vel- /moderated- differentierede tumorer var signifikant (

s

= 0,017 og

s

= 0,022, chi kvadreret tekst) (tabel 2).

(A) immunhistokemisk farvning for PAR4. (A) normal kolorektal slimhinde; (B) kolorektal cancer væv af nummer én patient. (C) kolorektal cancer væv af nummer to patient; (B) immunhistokemisk farvning for TFF2. (D) normal colorektal slimhinde; (E) kolorektal cancer væv af nummer én patient; (F) kolorektal cancer væv af nummer to patient. Bar, 100 um for hvert panel, og 50 um for mellemværker.

Overekspression af PAR4 øget invasion aktivitet af LoVo celler induceret af TFF2

Vores tidligere resultater har vist, at TFF2 fremmer celle migration via PAR4 [17]. For at undersøge rollen af ​​PAR4 i TFF2-induceret celleinvasion, undersøgte vi virkningen af ​​TFF2 på LoVo-mock og LoVo-PAR4 celler invasions aktiviteter. Som vist i fig 4A, var 200 nM TFF2 fremprovokere invasion aktivitet i LoVo-mock celler ved Matrigel assay. Men det signifikant øget invasionen aktivitet i LoVo-PAR4 celler. Det konfokale mikroskopi viste også, at invasion aktivitet af LoVo-PAR4 celler var 2 folder højere end LoVo-mock celler, når stimuleret med TFF2 (Fig 4B).

(A) Cell invasion stimuleret af TFF2 blev testet under anvendelse af en InnoCyte celleinvasion assay. Invasion af LoVo-mock og LoVo-PAR4 celler stimuleret af 200 nM TFF2 blev testet, med BSA og 10 nM EGF som kontroller. Resultaterne viste signifikant forskel på 200 nM TFF2 på LoVo-mock og LoVo-PAR4 celler invasion aktivitet. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05; (B) Invasion af LoVo-mock og LoVo-PAR4 celler stimuleret af 200 nM TFF2 blev undersøgt ved Confnocal laser fluorescensmikroskopi.

PAR4 Knockdown i HT-29 celler nedsat celle invasion aktivitet i reagere på TFF2

Derefter bestemte vi effekten af ​​TFF2 på celler invasion aktivitet i PAR4- knockdowned HT-29-celler. Som vist i fig 5A, 200 nM TFF2 steget betydeligt invasionen aktivitet af HT-29-pGIPZ celler ved Matrigel assay, men havde ingen virkning på PAR4-knockdowned celler. Konfokal mikroskopi Resultaterne viste også, at invasion af HT-29-pGIPZ er mere end 3-4 folder af HT-29-shPAR4 celler, når cellerne stimuleres af TFF2 (Fig 5B). Resultaterne antydede, at TFF2-induceret invasion var PAR4-afhængig.

(A) Cell invasion stimuleret af TFF2 blev testet under anvendelse af en InnoCyte invasion celleassay. Invasion aktivitet af HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 celler blev behandlet med 200 nM TFF2 at vurdere invasionen aktivitet, blev BSA og 10 nM EGF anvendt som kontroller. Der var signifikant forskel på 200 nM TFF2 på HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 celler invasion. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige eksperimenter, * p 0,05; (B) Invasion celler af HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 stimuleret af 200 nM TFF2 blev undersøgt af Confnocal laser fluorescensmikroskopi.

Restaurering af PAR4 udtryk ved behandling af 5-Aza-skøge i kolorektale LoVo celler

Som rapporteret i Zhang forskning papir, blev PAR4 ikke udtrykkes i human coloncancercellelinie af LoVo [17]. For at belyse den potentielle molekylære mekanisme bag PAR4 opreguleret udtryk i kolorektal cancer væv blev LoVo celler behandlet med 5-Aza-dC, en demethyleringsmiddel. I fig 6A og 6B, RT-PCR og Western blotting viste, at ekspressionsniveauet af PAR4 blev restaureret efter 3 dages behandling med 5-aza-dC, og humane kolorektal cancer cellelinjer HT-29 udtrykkende PAR4 blev anvendt som kontrol.

LoVo, en ikke PAR4 udtrykkende celler blev inkuberet med 5-aza-dC (10 uM) eller DMSO i 72 timer, og cellerne blev anvendt til at ekstrahere mRNA og protein. (A) Ekspressionsniveauet af PAR4 mRNA blev undersøgt ved RT-PCR; (B) Ekspressionsniveauet af PAR4-protein blev undersøgt ved western blot. Den kolorektal cancer cellelinie HT-29 udtrykte PAR4 blev anvendt som en positiv kontrol.

Analyse methylering niveau af promotorregionen af ​​PAR4 i colorektale cancervæv Salg

Fordi demethylering med 5- Aza-dC fører til genoprettelse af PAR4 udtryk i LoVo celler, vi sammenlignede methylering niveau PAR4 promotor mellem kolorektal cancer og de matchede normale væv. Brug af det genomiske bisulfit sekventering metode undersøgte vi 19 CpG sites i en 380 bp region af PAR4 promotoren. Tre kolorektal cancer prøver med høj PAR4 udtryk viste udtalte hypomethylations, og deres gennemsnitlige methylering satser 19 CpG sites er 22,1%. Imidlertid blev hypermethyleringen fundet i matchede andet væv, som havde lav ekspression af PAR4, og deres gennemsnitlige methylering satser var 41,6% (fig 7A). High PAR4-ekspression HT-29 celler udviste hypometylering i sin fremme mens ikke-PAR4 ekspression LoVo celler udviste hypermethylering (fig 7B).

(A) PAR4 promotor methylering blev analyseret i DNA fra tre kolorektal cancer og deres matchede ikke neoplastiske væv. (B) PAR4 promotor methylering i DNA fra kolorektale kræftceller linjer, LoVo og HT-29. Gennemsnitlig methylering på hvert analyserede CpG site i PAR4 promotoren er angivet baseret på bisulfit sekventering af 19 individuelle kloner.

Diskussion

Forskellen udtryk for PAR4 og TFF2 blev påvist i forskellige tumorer , såsom bugspytkirtel, lungecancer og mavecancer, og denne forskel ekspression blev associeret med tumorcellevækst, migration, invasion og angiogenese [11,22-24]. Fordi PAR’er spiller vigtige roller i forskellige cancerformer og de er blevet attraktivt for udviklingen af ​​hidtil ukendte terapeutiske mål [25]. I undersøgelsen, præsenterede vi nogle fundamentale data, ekspressionsniveauerne af PAR4 og TFF2 blev øget betydeligt i kolorektal cancer væv sammenlignet med de matchede noncancerous væv, især i de metastatiske positive lymfeknuder og dårligt differentierede tumorer. Hovedparten af ​​PAR4 og TFF2 i kolorektal cancer væv er lokaliseret i cytoplasmaet, som vist ved immunfarvning. Stigningen i PAR4 udtryk i kolorektal cancer var i overensstemmelse med Gratio forskningsresultater [12], hvor PAR4 var fraværende i normal colon mucosa og epitelceller, men højt i kolon adenocarcinom væv, og 71% humane kolorektale cellelinjer viser stærk immunfarvning af PAR4 [12]. Tværtimod blev PAR4 udtryk faldt i mavekræft, esophageal skællede kræft og lunge adenocarcinom væv sammenligner med den relative normal slimhinde [17,26,27]. Resultaterne indikerede, at funktionen af ​​PAR4 var anderledes i tumor progression. Da de ukendte faktorer kan være involveret i den afvigende ekspression af PAR4, der er meget værker nødt til at forstå den mekanisme af PAR4 regulering, før det kan være et potentielt mål lægemiddel til kræftbehandling.

TFF2, som en principal cytobeskyttende trefoil faktor, var primært udtrykt i maven, og udtrykket blev dysreguleret under mavekræft progression [16,23,28]. I Jiang undersøgelse blev TFF2 ekspression markant nedsat i gastrisk cancer, hvilket tyder rolle TFF2 som tumorsuppressor i gastrisk carcinogenese og metastase [29]. I colon mucosa, blev TFF2 udtrykkes med lav intensitet, men udtryk for TFF2 i udviklingen af ​​kolorektal cancer var ikke klart [30]. I vores forskning, var det interessant at finde TFF2 ekspression blev også forøget i cancervæv sammenlignet med den relative normal colorektal slimhinde. Furthermor, vores resultater viste, at det rekombinante humane TFF2 kunne aktivere PAR4 at fremme LoVo-PAR4 og HT-29-pGIPZ celleinvasion aktivitet, men havde ingen signifikant virkning på invasion LoVo-mock og HT-29-shPAR4 celler. Resultaterne består med vores tidligere fund, at TFF2 aktiveret PAR4 at fremme epithelcellevandring via ERK1 /2 phosphorylering [17]. Phosphorylering af ERK1 /2 er nødvendig for celle migration og er centralt for TFF medieret signalering [14,31]. Derfor de kendsgerninger, som op-regulering udtryk for PAR4 og TFF2 i kolorektal cancer, deres co-lokaliserede cytoplasma udtryk patters, og TFF2 fremme celle migration og invasion via PAR4, hvilket tyder på interaktionen mellem PAR4 og TFF2

in vivo

og

in vitro

via ukendt mekanisme skal undersøges nærmere.

Transcriptional silencing ved promotor hypermethylering har for nylig vist sig som en af ​​de vigtige mekanismer i gastrisk udvikling af kræft [32]. I denne undersøgelse fandt vi, at 5-Aza-dC, en demethyleringsmiddel, restaureret PAR4 ekspression i LoVo celler. Vi analyseret yderligere status methylering af cytosin i CpG dinukleotid beliggende inden for ikke-CpG øer på PAR4 promotor-regionen ved hjælp af kolorektal cancer væv og cellelinjer med forskellige PAR4 udtryk niveau. Promotor hypermethylering blev bekræftet i normal kolorektal slimhinde med lav udtryk for PAR4. Imidlertid blev promotor hypometylering fundet i kolorektal cancer væv med høj ekspression af PAR4. Resultaterne viste, at promotor hypometylering kan fremme transskription af PAR4. Zhang et al fandt, at tab af PAR4 ekspression i gastriske cancere kan skyldes hypermethylering af PAR4-promotoren [33]. Men PAR4 faldt udtryk i lungeadenokarcinom var ikke relateret til promoter methylering [2727]. Disse kendsgerninger foreslog, at promotor methylering niveau var kun én faktor, der fører til forskellen af ​​PAR4 udtryk, og dens udtryk blev reguleret af flere faktorer.

Som konklusion forskning viste, at PAR4 og TFF2 udtryk var ofte opreguleret i kolorektal cancer og den øgede ekspression var forbundet med klinisk aggressiv fænotype. DNA hypometylering fører til den opreguleret udtryk for PAR4 i kolorektal cancer væv. Vi viste også PAR4 fremmet invasion kolorektal kræftceller ‘i reagere på TFF2. Disse resultater vil hjælpe os forstå molekylære mekanisme af TFFs og PAR’er i carcinogenese og progression af tarmkræft.

Tak

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den kinesiske National Natural Science Foundation (81.160.302, 31.270.835 ), det kinesiske videnskabsakademi (KJZD-EW-L03), Yunnan-provinsen Videnskab og Teknologi Institut Basic Research Foundation (2011FZ109) og stat Key Laboratory of Genetic Resource og Evolution (GREKF11-13).