PLoS ONE: Tim-3 ekspression i livmoderhalskræft Fremmer Tumor Metastasis

Abstrakt

Baggrund

T-celle immunglobulin mucin-3 (Tim-3) er blevet identificeret som en negativ regulator af anti -tumor immunitet. Nylige undersøgelser fremhæver den vigtige rolle, Tim-3 i CD8

+ T-celle udmattelse, der finder sted i både mennesker og dyr kræftmodeller. Arten af ​​Tim-3-ekspression i tumorcellen og den mekanisme, hvormed det inhiberer anti-tumor-immunitet er uklare. Nærværende undersøgelse har til formål at bestemme Tim-3 udtrykkes i livmoderhalskræft celler og vurdere betydningen af ​​Tim-3 i livmoderhalskræft progression.

Metode

I alt 85 cervikale vævsprøver, herunder 43 menneskelige livmoderhalskræft, 22 cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) og 20 kroniske cervicitis var involveret. Tim-3-ekspression i tumorceller blev detekteret og viste sig at korrelere med klinisk-patologiske parametre. I mellemtiden ekspression af Tim-3 blev bestemt ved RT-PCR, Western Blot og konfokal mikroskopi i cervikale cancercellelinier, HeLa og SiHa. Migrationen og invasion potentiale Hela celler blev evalueret efter hæmme Tim-3-ekspression af ADV-antisense Tim-3.

Konklusioner

Vi fandt, at Tim-3 blev udtrykt på et højere niveau i de kliniske cervikale cancerceller sammenlignet med CIN og kroniske cervicitis kontroller. Vi støttede denne konklusion ved at bekræfte tilstedeværelsen af ​​Tim-3 mRNA og protein i de cervikale cellelinjer. Tim-3-ekspression i tumorceller korrelerede med klinisk-patologiske parametre. Patienter med høj ekspression af Tim-3 haft en betydelig metastatisk potentiale, avancerede kræft kvaliteter og kortere samlet overlevelse end dem med lavere udtryk. Multivariate analyse viste, at Tim-3-ekspression var en uafhængig faktor til at forudsige prognosen for livmoderhalskræft. Betydeligt, nedregulering af ekspressionen af ​​Tim-3-protein inhiberede migration og invasion af Hela-celler. Vores undersøgelse tyder på, at ekspressionen af ​​Tim-3 i tumorceller kan være en uafhængig prognostisk faktor for patienter med cervikal cancer. Endvidere kan Tim-3-ekspression fremme metastatisk potentiale i livmoderhalskræft

Henvisning:. Cao Y, Zhou X, Huang X, Li Q, Gao L, Jiang L, et al. (2013) Tim-3 ekspression i livmoderhalskræft Fremmer tumormetastaser. PLoS ONE 8 (1): e53834. doi: 10,1371 /journal.pone.0053834

Redaktør: Pierre Busson, Institut for cancerologi Gustave Roussy, Frankrig

Modtaget: 27. september 2012; Accepteret: December 6, 2012; Udgivet: 15 Jan 2013

Copyright: © 2013 Cao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne artikel blev støttet af National Science Foundation of China (nr 81.001.049) og National Science fond for Distinguished Young Scholars i Kina (nr 81.025.011). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Igangværende undersøgelser fortsætter med at vise en stærk korrelation mellem Tim-3 ekspression og tumor-associerede immunsuppression [1] – [3]. Sakuishi et al [4] fandt, at Tim-3 blev udtrykt på CD8

+ tumor-infiltrerende lymfocytter (tils) i mus med solide tumorer. Alle Tim-3

+ TIL’er co-udtrykke PD-1, og denne form for TIL’er repræsenterer den dominerende fraktion af T-celler infiltrerer tumorer. Tim-3

+ PD-1

+ TIL’er udviser den mest alvorlige opbrugt fænotype som defineret ved manglende proliferere og at producere IL-2, TNF og IFN-γ. Kombineret målretning af Tim-3 og PD-1 veje er mere effektiv til at genoprette anti-tumor-immunitet end at målrette enten vej alene. Zhou et al [5] detekteret det samme fænomen i mus med dissemineret akut myeloid leukæmi. Selv i melanompatienter, er også fundet opregulering af Tim-3 og PD-1 ekspression til at være forbundet med tumorantigen-specifik CD8

+ T-celle dysfunktion [6]. I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at Tim-3 fortrinsvis blev udtrykt i lymfom-afledte endotelceller og undertrykt aktivering af CD4

+ T-lymfocytter gennem aktivering af interleukin-6-STAT3 pathway. Tim-3 lettet også etableringen af ​​lymfom immun tolerance [7]. Imidlertid, om Tim-3 også udtrykkes på cancerceller i andre nonhematologic cancere forbliver et åbent spørgsmål.

Livmoderhalskræft er en tumor, der besidder forskellige tumorassocierede antigener (TAA’er). Humane papillomavirus (HPV’er) har vist sig at forårsage progressive ændringer i den cervikale epitel, hvilket fører til livmoderhalskræft. Større end 99% af livmoderhalskræft maligniteter havnen HPV (hovedsagelig HPV-16 og HPV-18). E6 og E7 er de to proteiner udtrykt af den virus, der er nødvendige for initiering og progression af cancer [8]. Adskillige undersøgelser [9], [10] viser, at der er andre potentielle roller som Fas-FasL systemet og tab af HLA klasse I for immun flugt i livmoderhalskræft. Fordi mange veje er potentielt involveret i livmoderhalskræft, spekulerede vi hvis Tim-3, et antigen, som er blevet impliceret i udviklingen af ​​forskellige kræftformer, ligeledes kan spille en rolle i udviklingen af ​​cervikal cancer. Desuden er vores tidligere undersøgelse viste, at Tim-3 blev overudtrykt i epiteliale cancere. Disse grunde tilsammen gjort os interesseret i at undersøge rollen som Tim-3 i livmoderhalskræft.

To nylige undersøgelser [11], [12] har identificeret Tim-3 ekspression på leukæmiske stamceller (LSC) hos patienter med akut myeloid leukæmi (AML). Tim-3

+ AML-celler var i stand til at rekonstituere AML og anti-humant Tim-3-antistof blokerede AML indpodning i en xenotransplantat-model. Selvom anti-Tim-3-antistoffer synes at reducere metastatiske potentiale af kræftceller, er virkningsmekanismen ikke godt forstået. I denne undersøgelse anvendte vi ADV-antisense Tim-3 at nedregulere Tim-3 mod cervixcancer Hela-cellelinie og derefter vurderet evnen af ​​cancerceller til at migrere og invadere. Salg

Vores resultater fra dette undersøgelsen bekræftede mRNA og proteinniveauet ekspression af Tim-3 i cervikale cancercellelinier og afslørede for første gang, at Tim-3 fortrinsvis blev udtrykt i de kliniske primære cervikale cancerceller sammenlignet med CIN og kronisk cervicitis. Desuden patienter med høj ekspression af Tim-3 havde en signifikant større metastatisk potentiale og avancerede kræft kvaliteter og kortere samlet overlevelse end dem med lavere Tim-3-ekspression. Derfor kan Tim-3 potentielt være en uafhængig prognostisk faktor for patienter med cervikal cancer. Vi fandt også, ADV-antisense Tim-3 kan inhibere migration og invasion af Hela-celler. Kombineret med vores tidligere undersøgelse, hvor vi fandt, at Tim-3 aktiverer IL-6-STAT3 pathway at undertrykke aktivering af CD4

+ T-lymfocytter, vores undersøgelse åbner muligheden for, at Tim-3 kan fremme metastase gennem aktivering af IL-6-STAT3 pathway.

Materialer og metoder Salg

patienter Salg

prøver af 43 livmoderhalskræft væv, 22 CIN væv og 20 kroniske cervicitis væv blev afledt fra patienter, der gennemgik primær operation for livmoderhalskræft sygdomme ved Institut for Gynækologisk onkologi i Tongji Hospital (Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi, Wuhan, Kina) ud fra 2004-2006. Alle de udvalgte livmoderhalskræft væv mødtes inklusion kriterier følgende: ingen historie enhver anden form for ondartet svulst, uden neoadjuverende terapi før operation. Alle patienter gav informeret skriftligt samtykke til analyse af deres væv til forskningsformål. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Tongji Hospital for analyse af humane væv. Patienterne var i alderen fra 27 til 67 år (median alder, 39 år). Histologisk undersøgelse af det udskårne cervikale væv blev gennemført efter hæmatoxylin eosin (H inkuberet med Tim-3-antistof (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) til natten over ved 4 ° C; vasket; og inkuberet med et peberrodsperoxidase-mærket sekundært antistof æsel-anti-gede-IgG (1:5000) i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev blots udviklet anvendelse af et forstærket kemiluminescens påvisningssystem (Amersham Life Science). I indledende forsøg fandt vi NK-92 cellelinien overvejende udtrykte Tim-3-protein, mens THP-1-cellelinien ikke udtrykte Tim-3-protein. Totalt protein ekstraheret fra NK-92 cellelinien blev anvendt som positiv kontrol af Tim-3-protein, mens totalt protein ekstraheret fra THP-1-cellelinien blev anvendt som negativ kontrol.

Immunfluorescerende Påvisning af HeLa-cellelinje

HeLa-celler blev høstet med en kombination af trypsin og ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og vasket i PBS og dyrket på dækglas. celler derefter blev fikseret i 95% ethnol og blokeret med 1% BSA i 1 time og derefter inkuberet med primært antistof ved 4 ° C natten over. Det primære antistof blev anvendt, var gede-anti-Tim-3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ved en fortynding på 1:100. Eksemplarerne blev derefter vasket i PBS i 5 minutter 3 gange. Negative kontrolglas blev inkuberet uden det primære antistof. Æsel-anti-gede-IgG konjugeret med FITC fortyndet med 2% BSA /PBS til en fortynding på 1:100 blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur blev cellekerner farvet med PI ved en fortynding på 1:1000, kontrolleres ved konfokal mikroskop.

adenovirusmutanterne Salg

AdEasy systemet (MP Biomedicals) blev anvendt i denne undersøgelse for at konstruere en rekombinant replikationsdeficient adenovirus vektor ved navn ADV-antisense Tim-3, som indeholdt et fragment af omvendt Træ- 3-cDNA (bp 198 til 1312). Standard protokoller blev fulgt som tidligere [14] beskrevne. ADV-GFP indeholdende en GFP-genet under kontrol af en Rous sarcoma virus lang terminal repeat-promotoren i regionen af ​​de udskårne E1 adenovirale gener, blev anvendt som en kontrol i denne undersøgelse. Hela-celler blev inficeret med ADV-antisense Tim-3 eller ADV-GFP på en ordentlig MOI bestemt ved apoptose-assay i 2 timer, derefter dyrket i yderligere 24 timer og underkastet efterfølgende forsøg.

Apoptose Assay

Kort fortalt, Hela-celler inficeret med forskellige titere af adenovirusmutanter eller behandlet med PBS i 72 timer. Derefter blev cellerne fikseret med 70% ethanol i 1 time, vasket i PBS og behandlet med RNase i 15 minutter ved 37 ° C og derefter farvet med 50 pg /ml propidiumiodid. Celler blev opsamlet og underkastet FACS-analyse af sub-G1 population.

Sårheling Assay

Cellerne blev dyrket til konfluens i en 6-brønds dyrkningsplade. En lineær sår blev fremstillet ved at skrabe monolaget med en steril 10-ul pipettespids. De sårede monolag blev vasket 3 gange med regelmæssige medium og inkuberet i frisk serum-frit medium. Fotografier blev taget ved 0 timer, 24 timer og 48 timer efter sårede ved fasekontrastmikroskopi.

Transwell Invasion Assay

Cell invasion blev analyseret ved hjælp af Transwell kamre (Costar, Cambridge, MA, USA) med 8-um pore polycarbonatfiltre, der blev overtrukket med Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Celler inficeret med adenovirusmutanter i 24 timer blev podet i de øvre kamre i serumfrit medium ved en densitet på 2,0 x 10

4 per brønd, og 500 pi 10% føtalt bovint serum-holdigt medium blev anbragt i den nedre kammer som kemo-tiltrækningsstof. Efter 48 timer ved 37 ° C i 5% CO2, blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd og farvet med 0,1% krystalviolet opløsning. Celler på den øvre overflade af filteret blev fjernet med vatpinde. Invaderet celler på undersiden af ​​filteret blev fotograferet og talt ved fasekontrastmikroskopi (x 200 forstørrelser). Forsøgene blev udført i tre eksemplarer.

Statistisk analyse

SPSS statistisk software program blev brugt til at teste for sammenhænge mellem kvantitative variabler ved etablering af parametrisk lineær regression. Data er præsenteret som middelværdier ± SD af mindst tre eksperimenter og blev analyseret ved envejs variansanalyse efterfulgt af Student-Newman-Keuls test. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at anslå den samlede overlevelse som funktion af tid. Overlevelse forskelle blev analyseret under anvendelse af log-rank test. Cox proportional hazard model blev anvendt i det univariate og multivariate analyse af prognostiske faktorer. Alle p-værdier var tosidet, og

P

0,05 blev betragtet som signifikant. SPSS software (version 11.5) blev anvendt til alle statistiske procedurer.

Resultater

Tim-3 fortrinsvis udtrykkes i livmoderhalskræft Tissue

Vi analyserede dele af tumorvæv fra 43 patienter, der blev opereret for livmoderhalskræft, fra 22 patienter med CIN og fra 20 patienter med kronisk cervicitis. Positiv farvning for Tim-3-protein blev set i kun 15,0% (3 ud af 20) af kronisk cervicitis, men 50,0% (11 ud af 22) af CIN og 65,1% (28 ud af 43) af livmoderhalskræft farvedes positivt for Tim-3-protein (fig. 1A-D). Når ekspressionen af ​​Tim-3-protein blev yderligere sammenlignet ved semikvantitativ immunreaktivitet H-scoring, livmoderhalskræft og CIN udviste en meget højere Tim-3 score end kronisk cervicitis væv. (0,905 ± 0,584, 0,558 ± 0,123 vs 0,102 ± 0,075;

P

0,01). (Tabel 1)

(A) cervikal pladecarcinom, (B) cervikal adenokarcinom, (C ) cervikal intraepithelial neoplasi, og (D) kronisk cervicitis væv. Original forstørrelse × 200.

Tim-3 Expression korreleret med Clinicopathologic Parametre

Vi korreleret de Tim-3 udtryk data til clinicopathologic karakteristika såsom alder, histologisk type, klinisk kvalitet, histologisk kvalitet, metastase og samlet overlevelse. Høj immunoreaktivitet af Tim-3 viste sig at være signifikant korreleret med klinisk bedømmelse (

s

= 0,018), histologisk bedømmelse (

s

= 0,038) og metastase (

s

= 0,004). Der var ingen signifikante korrelationer med alderen (

s

= 0,178) og histologisk type (

s

= 0,773) (Tabel 2).

I slutningen af vores opfølgningsperioden, 15 patienter døde i Tim-3 positive gruppe, mens 3 i Tim-3 negative gruppe, 5-årige overlevelsesrate var 46,4%

vs

80% henholdsvis (

P

= 0,006) (fig. 2).

En sammenligning af fem år kumulativ-overlevelse kurve af livmoderhalskræft kræftpatienter mellem Tim-3 positivt udtryk (brudt linie) og Tim-3 negative udtryk (tyk linie) er vist.

Tim-3 udtrykkes i cervikal cancercellelinier

RT-PCR og Western blot-analyse blev anvendt til at detektere Tim-3 mRNA og protein niveauer i to humane cervikale cancer cellelinjer Hela og SiHa. Som forventet blev en 749-bp produkt fundet at være til stede i disse to cellelinjer, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af ​​Tim-3-mRNA-ekspression. p-actin oligonukleotider blev anvendt til detekteret en 180-bp RNA band og blev anvendt som en kontrol (fig. 3A). En 33 kd bånd blev fundet bekræfter Tim-3-proteinekspression (fig. 3B). Konfokal mikroskopi blev anvendt til at teste subcellulær lokalisering af Tim-3. Tim-3 blev fordelt i hele cytoplasmaet (grøn fluorescens), i Hela-cellelinjen, med ingen fordeling i kernen (rød) (fig. 3C).

(A) Tim-3-transkripter blev påvist i Hela og SiHa-cellelinier. Skabelonerne af forskellige baner som følger: Bane 1, total RNA PBL; Bane 2, cDNA PBL; bane 3, total RNA af SiHa; bane 4, cDNA of SiHa; bane 5, total RNA fra Hela; bane 6, cDNA fra Hela. (B) Tim-3 protein blev bestemt ved Western blotting i Hela og SiHa-cellelinier. (C) Hela-celler farvet med immunfluorescerende med anti-Tim-3-antistof og observeret med et konfokalt laserscanningsmikroskop. Tim-3-protein (grøn, pilespidser) er i cytoplasmaet i Hela. Cellekerner (rød) blev visualiseret ved farvning med PI.

At undertrykke Tim-3 Expression Hæmmet Migration og Invasion af Hela celler

For yderligere at forstå sammenhængen af ​​Tim-3 og tumor metastase, vi inficerede Hela-celler med ADV-antisense Tim-3. Ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 1, ADV-antisense Tim-3-inficerede HeLa-celler viste signifikant reduceret Tim-3-ekspression med en mindre celledød respons; således blev denne koncentration anvendt i de følgende eksperimenter (fig. 4A-B). Da kræft cellemigration og invasion er direkte relateret til metastase, blev en sårhelende assay og en celleinvasion assay udført for at bestemme, om undertrykkelse af Tim-3-ekspression inhiberer Hela cellemigration og invasion. Hela-celler inficeret med enten ADV-antisense Tim-3 eller med ADV-GFP som en kontrol blev bedømt for 24 timer og 48 timer. Som vist i figur 5A-B, ved 24 timer og 48 timer henholdsvis viste ADV-antisense Tim-3-inficerede celler 40% og 70% sårlukning, mens ADV-GFP-inficerede celler viste 60% og 100%, hvilket antyder, at inhibering af Tim-3-ekspression faldt migrationen af ​​Hela-celler. Som vist i figur 5C-D, antallet af Hela-celler, der passerede gennem filteret i ADV-antisense Tim-3-gruppen (151 ± 33) var markant mindre end i ADV-GFP-gruppen (545 ± 48), som viser, at inhibering af Tim-3-ekspression undertrykkes Hela celleinvasion in vitro.

(A) Western blotting blev udført for at detektere Tim-3-ekspression i HeLa-celler inficeret med ADV-GFP og ADV- antisense Tim-3 eller behandlet med PBS. (B) Typisk resultat af celleapoptose bestemt ved flowcytometri i HeLa-celler inficeret med ADV-antisense Tim-3 og ADV-GFP eller behandlet med PBS. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD af tredobbelte.

(A) Cell migration kapacitet blev bestemt med et sårhelende assay. Fotografier blev taget straks (0 h), ved 24 timer og 48 timer efter sårdannelse. (B) Kvantificering af sårlukning. Dataene præsentere middelafstand af celle migration til sårområdet ved 24 timer og 48 timer efter sårede i tre uafhængige sår steder pr gruppe. (C) at cellernes evne til at invadere Matrigel blev analyseret ved Transwell invasion assay gennem en gelmatrix. Hela-celler blev enten inficeret med ADV-GFP eller med ADV-antisense Tim-3, Efter 10 timer levedygtige invasive celler blev fikseret og talt. Værdier og fejllinjer vist i denne graf repræsenterer gennemsnit og standardafvigelser henholdsvis tre uafhængige forsøg. (D) Repræsentative billeder af transwell invasion analysen.

Diskussion

I vores tidligere arbejde, fandt vi, at Tim-3 fortrinsvis blev udtrykt i lymfom-afledte endotelceller (EC’er) , og at niveauet af Tim-3 i B-celle lymfom endotel var nært korreleret til både formidling og dårlig prognose. Tim-3

+ EC’er moduleret T-celle respons på lymfom surrogat-antigener ved at undertrykke aktivering af CD4

+ T-lymfocytter gennem aktivering af interleukin-6-STAT3 pathway, inhibering Th1 polarisering, der giver beskyttende immunitet, og lette etablering af lymfom immuntolerance. Selvom undersøgelser antyder, at Tim-3 er involveret i immun- reguleringen af ​​tumorer, dets direkte ekspression i tumorcellen og dens funktion i tumormetastase var stadig ukendt.

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at Tim-3 blev fortrinsvis udtrykt i livmoderhalskræft væv, og dens udtryk var signifikant korreleret med avancerede kræft kvaliteter (

s

= 0,018), histologiske kvaliteter (

s

= 0,038), metastaser (

s

= 0,004) og kortere overlevelse (

s

= 0,006). Tilstedeværelsen af ​​Tim-3-mRNA og protein i to cervikale cancercellelinier (Hela og Siha) ud over lokaliseringen af ​​Tim-3 til cytoplasmaet af Hela-celle bekræftede, at Tim-3 faktisk blev udtrykt i livmoderhalskræft celle. For at tydeliggøre sammenhængen mellem Tim-3 og tumor metastase, brugte vi ADV-antisense Tim-3 til at gøre en sårhelende assay og transwell invasion assay. Vi fandt, at ADV-antisense Tim-3-inficerede celler viste 40% og 70% sårlukning ved 24 timer og 48 timer, sammenlignet med de 60% og 100% set i ADV-GFP-inficerede celler. Desuden markant færre Hela-celler ledt gennem filteret i ADV-antisense Tim-3-gruppen (151 ± 33) end i ADV-GFP-gruppen (545 ± 48). Disse resultater antyder stærkt, at nedregulering af ekspressionen af ​​Tim-3 nedsætter migration og invasion af Hela-celler betydeligt.

I overensstemmelse med vores undersøgelse, Wiener et al [15] fandt også, at Tim-3 blev udtrykt ikke kun i mastceller omkring melanomer, men også i tumorceller i vævssektioner og human melanoma cellelinier WM35 og HT168-M1. I mellemtiden Kikushige og Jan [11], [12] identificerede Tim-3-ekspression på leukæmi stamceller (LSC) hos patienter med akut myeloid leukæmi. For at bestemme, om Tim-3 er universelt udtrykkes i tumorceller, er yderligere undersøgelser på andre kræftceller påkrævet.

På trods af fremskridt i forståelsen inddragelse af Tim-3 i tumor immunitet, forbindelsen mellem Tim-3 ekspression og tumorcelle selv er endnu ikke defineret. En af vores mest slående fund er, at når vi brugte ADV-antisense Tim-3 at nedregulere ekspressionen af ​​Tim-3 i HeLa-celler, både migration og invasion af HeLa-celler blev inhiberet signifikant. Faktisk var høj score udtryk for Tim-3 signifikant korreleret med metastaser (

s

= 0,004) i livmoderhalsen kræftpatienter. Det næste skridt ville være at bestemme, hvordan Tim-3-ekspression er korreleret med tumor metastase, og hvilke veje der er involveret? I vores tidligere arbejde har vi bekræftet, at Tim-3 kan aktivere IL-6-STAT3 pathway. Tim-3-ekspression øgede EF-afledte produktion af IL-6 med næsten 10 gange, og tilsætningen af ​​IL-6 forøgede niveauet af phosphoryleret STAT3 (p-STAT3) signifikant. Ifølge offentliggjorte undersøgelser [16] – [19], IL-6-STAT3 pathway spiller en vigtig rolle i tumormetastase. STAT3 kan fremme premetastatic niche dannelse og metastatiske celler kan undslippe de pro-apoptotiske virkninger af TNF-α gennem øget autokrin IL-6-STAT3 signalering. Desuden inhibering af p-STAT3 forøger IFN-α effektivitet mod metastatisk melanom i en murin model. Baseret på disse tidligere resultater og vores resultater fra denne undersøgelse har vi hypotesen, at Tim-3 kunne lette tumormetastase gennem IL-6-STAT3-vejen. Fordi fjernmetastaser er en vigtig faktor i overlevelsen af ​​individer med livmoderhalskræft, Tim-3 kan være en kritisk prognostisk markør for livmoderhalskræft.

Samlet set vores undersøgelse tyder på, at Tim-3 ikke kun negativt regulerer anti -tumor immunitet, men også påvirker cancerudvikling direkte via dets ekspression i cancerceller. For første gang har vi tilknyttet ekspression af Tim-3 i tumorceller med værre kliniske patologiske parametre i livmoderhalskræft. Desuden fandt vi, at inhiberingen af ​​Tim-3-protein-ekspression kan forhindre tumormetastase. Således det er hensigtsmæssigt for fremtidige eksperimenter at udforske Tim-3 som et mål for anti-cancer terapi, tumorimmunterapi, og i kontrollen af ​​metastatiske sygdomme.