PLoS ONE: Den reg4 Gene, Amplified i de tidlige stadier af kræft i bugspytkirtlen Development, er en lovende terapeutisk mål

Abstrakt

Baggrund

Formålet med vores arbejde var at identificere de gener, der specifikt ændret i pancreas adenocarcinom og især dem, der er ændret tidligt i udviklingen af ​​kræft.

Metode /vigtigste resultater

Gene kopi nummer blev systematisk vurderes med en ultra-høj opløsning CGH oligonukleotid microarray i DNA fra prøver af kræft i bugspytkirtlen. Flere nye cancer-associerede variationer blev observeret. I dette arbejde har vi fokuseret på en af ​​dem, der involverer

reg4

gen. Gene kopi nummer gevinst af

reg4

genet blev bekræftet af qPCR i 14 kræft prøver. Det blev også fundet med forøget kopiantal i de fleste PanIN3 prøver. Forholdet betweena gevinst i

reg4

genkopital og cancerudvikling blev undersøgt på den humane pancreas cancercellelinie Mia-PaCa2 xenotransplanteret under huden på nøgne mus. Når celler blev transficeret med en vektor tillader reg4 ekspression, de genererede tumorer næsten dobbelt større i størrelse. Desuden er disse tumorer var mere resistente over for gemcitabin end kontroltumorer. Interessant ugentlig intraperitoneal administration af et monoklonalt antistof mod reg4 halveret størrelsen af ​​tumorer genereret af Mia-PaCa2 celler, hvilket antyder, at antistoffet forstyrret en parakrin /autokrin mekanisme, der involverer reg4 og stimulere udviklingen af ​​kræft. Tilsætningen af ​​gemcitabin medførte yderligere reduktion, tumorer bliver 5 gange mindre end kontrollen. Udsættelse for reg4 antistof resulterede i et signifikant fald i intra-tumor niveauer af Pakt, Bd-XL, Bcl-2, survivin og cyclin D1.

Konklusioner /Signifikans

Det konkluderedes, at adjuvans behandlingsformer rettet mod reg4 kunne forbedre standard behandling af kræft i bugspytkirtlen med gemcitabin

Henvisning:. Legoffic A, Calvo E, Cano C, Folch-Puy E, Barthet M, Delpero JR, et al. (2009)

reg4

Gene, Amplified i de tidlige stadier af kræft i bugspytkirtlen Development, er en lovende terapeutisk mål. PLoS ONE 4 (10): e7495. doi: 10,1371 /journal.pone.0007495

Redaktør: Joy Sturtevant, Louisiana State University, USA

Modtaget: Juni 8, 2009; Accepteret: September 28, 2009; Udgivet: 16 Oktober 2009

Copyright: © 2009 Legoffic et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra INSERM, Ligue Contre le Cancer og INCA til JLI og ved FIS PI081608 projektet, Acción Integrada HF2006-0092 og CIBERehd. CIBERehd er finansieret af Instituto de Salud Carlos III til EF-P og DC. EF-P er modtageren af ​​en Ramón y Cajal kontrakt fra det spanske ministerium for uddannelse og videnskab og MF-M er modtageren af ​​en FIS-Instituto de Salud Carlos III kontrakt PI050599. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen udgør 2% af alle nye tilfælde af kræft, men fører til 5% af alle kræftdødsfald, med en fem års overlevelse på kun 4% [1]. Diagnosen er forsinket på grund af fraværet af symptomer og mangel på specifikke markører muliggør detektion ved en potentiel kurativ fase. I den almindelige befolkning pancreascancer bærer en livstidsrisiko på ca. 0,5-1% [2]. Genetisk disposition er involveret, fordi levetid risiko for kræft i bugspytkirtlen er 4,7% for første grads slægtninge til bugspytkirtlen kræfttilfælde og risikoen for bugspytkirtelkræft stiger med hvert berørte familiemedlem. Desuden kan det være arvet som en del af en multi-cancer-syndrom, men det store flertal af pancreascancer er sporadiske. Endelig tobaksrygning og sygdomme som diabetes og især kronisk pancreatitis prædisponere til kræft i bugspytkirtlen og omkring 10% af patienterne med intrapapillary mucinøse neoplasmer (IPMNs) vil udvikle pancreas adenocarcinom.

Genomisk ændringer kan fremkalde over- eller under- ekspression af gener, med vigtige konsekvenser, når onkogener eller tumorsuppressorgener er involveret. De genetiske abnormaliteter, der forekommer i forstadielæsioner [3] samt ved initiering og progression af pancreascancer er delvis beskrevet [4] – [7]. Faktisk analyser komparativ genomisk hybridisering (CGH) identificerede hyppige gevinster på kromosomer 1q, 3, 5, 7 p, 8Q, 11q, 12p, 17q, 19q og 20q, og tab på kromosomerne 3P, 6, 8P, 9P, 10Q, 13q, 15q, 17p og 18q [8] – [13]. Målet med vores arbejde var at identificere, ved hjælp af en ultra-høj opløsning CGH oligonukleotid microarray, generne specifikt ændret i pancreas adenocarcinom celler og især dem, der er ændret tidligt i udviklingen af ​​kræft. Flere kandidater blev identificeret ved hjælp af denne metode, blandt hvilke den

reg4

gen [14] viste genkopitallet gevinst i 14/14 analyserede prøver. Dette er for at vores viden den første rapport af

reg4

genkopitallet gevinst i bugspytkirtelkræft.

I dette papir vi rapportere, at

reg4

gen, placeret på kromosom 1p13 0,1-p12, er til stede i forøget kopi nummer i bugspytkirtelkræftceller og i slutningen af ​​forstadier bugspytkirtlen læsioner. Undersøgelser af en xenotransplanteret bugspytkirtelkræft cellelinje viste at reg4 overekspression stimulerer tumorvækst og omvendt, at blokering cirkulerende reg4 protein med et specifikt antistof hæmmer tumorvækst.

Resultater

reg4

gen er til stede i forøget kopi nummer i bugspytkirtelkræftceller og Panin 3 forstadier til kræft

Brug af en Affymetrix mikrochip-baserede DNA-scanning tilgang, vi identificerede flere gener med en unormal kopi nummer i DNA fra bugspytkirtelkræftceller. Vi først fokuseret på gener ændret i alle 14 DNA-prøver og oplevede, at

reg4

viste systematisk øget kopi nummer. Alle microarray data rapporteret i manuskriptet er beskrevet i overensstemmelse med MIAME retningslinjer. Komplette data, der beskriver andre DNA abnormiteter vil blive offentliggjort andetsteds.

reg4

gen øget kopi nummer var særlig interessant, fordi dens udtryk tidligere var involveret i aggressivitet af flere kræftformer [15] – [17], herunder bugspytkirtlen [18]. Figur 1 viser det amplificerede locus, omfattende

reg4

gen, i DNA fra disse patienter. Vi overvåges også kopien antal

reg4

i bugspytkirtlen forstadier til kræft navngivne PanINs. Ved at kombinere en laser capture tilgang og en qPCR metode, vi målte antallet af reg4 eksemplarer på tre kvaliteter af Panin læsioner og fandt et øget antal kopier af

reg4

i 0/6, 1/7 og 6/7 af PanIN1, PanIN2 og PanIN3 læsioner, henholdsvis (figur 2). Som kontrol kopiere antal

TERT

(Telomerase Reverse transkriptase) og

RPP21

(RNaseP protein p21) gener blev vurderet på de samme DNA-prøver og to kopier blev altid fundet (data ikke vist) . Tilsammen tyder disse data, at

reg4

gen kopi nummer er ofte steget i bugspytkirtelkræft og i den sidste fase af forstadier til kræft (PanIN3), men sjældent i tidligere faser (PanIN1 og PanIN2).

Allelle nøgletal blev beregnet med Partek Genomics Suite, version 6.4. HapMap (270 prøver) blev brugt til at skabe baseline kopital. Genomisk segmentering blev anvendt til at detektere kopi nummer gevinst eller tab. Regioner blev påvist ved hjælp af følgende segmentering parametre: mindst 10 genomiske markører; segmentering p-værdi lavere tærskel end 0,001; et signal til støj lig med 0,3. A. Skematisk repræsentation af

reg4

locus. Placering af de 7 gener til stede i dette locus er angivet: fra venstre til mennesk:

ZNF697

,

PHGDH

,

HMGCS2

,

REG4

,

NBPF7

,

ADAM30

NOTCH2

. B. Placering af kopi nummer gevinst segment findes i alle 14 DNA-prøver fra kræft i bugspytkirtlen, som omfatter

reg4

gen. C. Genomisk ændringer i den forstærkede segment af

reg4

locus, bestemmes af Affymetrix Genome Wide Menneskelig SNP Array 6.0 analyse i de 14 pancreas cancer prøver. Genetiske gevinster vises som røde bjælker og tab som blå søjler, grå søjler svarende til 2 kopier, som angivet i skalaen vist nedenunder. Bemærk overvægten af ​​gevinster (røde) i

reg4

region. D. Detalje af gevinst /tab i

reg4

gen og dets flankerende regioner for alle 14 analyserede prøver.

Homogene populationer af celler blev omhyggeligt mikrodissekeres ved hjælp af en laser Capture mikrodissektion System. PanINs blev gradueret 1 til 3 som en funktion af betydningen af ​​arkitektoniske og cytologiske abnormiteter. DNA fra pancreas cancer prøver opnået ved endoskopisk ultralyd (EUS) -Guidede finnålsaspiration blev anvendt. DNA fra blodleukocytter blev anvendt som kontrol.

reg4

genkopital blev bestemt ved qPCR udført tredobbelt og resultaterne blev analyseret ved anvendelse af RealQuant software.

reg4 overekspression stimulerer cellevækst og forøger modstanden mod gemcitabin i MiaPaCa2 celler

In vitro

Det er tidligere vist, at tvungen reg4 overekspression

in vitro

øger celle vækst og modstandsdygtighed over for programmeret celledød i ikke-pancreas cancer-afledte celler. Vi opnåede Mia-PaCa2 celler, der overudtrykker reg4 protein (Mia-PaCa2 /reg4) ved transduktion af en rekombinant retrovirus (figur 3) og analyseret deres evne til at vokse og til at modstå antitumormakrofagaktivatoren lægemiddel gemcitabin

in vitro

. Vi observerede, at celler, der udtrykker reg4 voksede omkring 50% hurtigere end Mia-PaCa2 /tomme celler. Vi bekræftede, at øget cellevækst skyldtes reg4 overekspression af knockingdown reg4 med et specifikt siRNA transfektion og fandt et tab af denne kapacitet, som vist i figur 4. Tilsvarende, når Mia-PaCa2 celler blev behandlet med 50 pM gemcitabin i 48 timer, modstanden mod lægemidlet blev forøget i celler, der overudtrykker reg4, sammenlignet med kontrolgruppen, men tabte i celler med tiden transficeret med et siRNA mod reg4 (figur 4). Disse resultater viser, at reg4 er involveret i cellevækst og resistens over for anticancerlægemidler i bugspytkirtelkræft-afledte celler som tidligere foreslået i ikke-pancreasceller.

Hele den kodende sekvens af reg4 cDNA blev subklonet i pLPCX retrovirale vektor. Phoenix amfotropiske pakningscellelinie celler blev transficeret med den retrovirale plasmid til opnåelse af supernatanten indeholdende retrovirale partikler. Target Mia-PaCa2 celler blev udpladet i nærværelse af supernatanten indeholdende retrovirale partikler som beskrevet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. Bestandene af reg4 udtrykker Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /reg4) og kontrol celler (Mia-PaCa2 /tom), inficeret med den tomme vektor, blev isoleret ved puromycinselektion. Ekspression af REG4 blev målt ved Western blot på celleekstrakter, anvendelse af anti-reg4 monoklonalt antistof. Efter udvikling blev membranen strippet og igen undersøgt for β-actin.

Mia-PaCa2 /reg4 og Mia-PaCa2 /tomme celler blev transficeret med en bestemt siRNA mod reg4 (A) eller inkuberes i nærvær af et anti-REG4 monoklonalt antistof (B) og deres vækst og deres modstand mod gemcitabin blev målt ved MTS-assayet. Resultaterne blev udtrykt som procent af ubehandlede Mia-PaCa2 /tomme celler.

REG4 er en 16 kDa sekretorisk protein. For at teste, om virkningerne af REG4 på cellevækst og modstandsdygtighed over for gemcitabin var grundet dens endokrine /parakrin funktion i pancreasceller, vi tilføjet et specifikt monoklonalt antistof mod REG4 protein til dyrkningsmediet, for at blokere dets aktivitet. Under disse forhold, virkningerne af reg4 overekspression forsvandt næsten fuldstændigt, som vist i figur 4. Disse resultater viser, at REG4 udøver sine virkninger på cellevækst og modstand mod gemcitabin gennem en endokrin /parakrin måde.

reg4 overekspression stigninger tumorigenicitet og modstand mod gemcitabin behandling

Vi sammenlignede kapacitet Mia-PaCa2 /tom og Mia-PaCa2 /reg4 celler til at danne tumorer efter subkutan injektion i nøgne mus. Som vist i figur 5, tumorer, der er dannet af celler over-udtrykkende reg4 protein voksede hurtigere end celler, som ikke udtrykker genet. Tumor volumen var 70% større, når du bruger Mia-PaCa2 /reg4 celler end med kontrol Mia-PaCa2 celler. Interessant, når mus blev behandlet med gemcitabin, tumorer overudtrykker reg4 protein de viste forøget resistens mod behandlingen, sammenlignet med tumorer dannet med Mia-PaCa2 /tomme celler. Mens mængden af ​​tumorer genereret med Mia-PaCa2 celler falder med 60% efter gemcitabin behandling, mængden af ​​reg4-udtrykkende celler faldt med 20% alene.

Ca. 2 × 10

6 Mia-PaCa- 2-celler blev podet subkutant med 0,1 ml Matrigel til nøgne mus. Gemcitabin (100 mg /kg) blev injiceret intraperitonealt to gange om ugen. Tumor dimensioner blev målt en gang ugentligt og tumorvolumener beregnet med formlen længde × bredde × dybde × 0,5236. Værdier er udtrykt som middelværdien +/- SE for seks målinger.

Systemisk behandling med et antistof mod reg4 nedsætter tumorigenicitet

Det næste skridt var at analysere effekten af ​​at blokere reg4 med et specifikt monoklonalt antistof på væksten af ​​tumorer induceret af subkutan injektion af Mia-PaCa2 celler. Som vist i figur 6, behandling med reg4 antistof faldt tumorudvikling med omkring 50%. Desuden kombinerer reg4 antistofbehandling med gemcitabin resulterede i yderligere reduktion af tumorvolumen. Tilsammen indikerer disse resultater, at målretning reg4 protein kan anvendes i samarbejde med gemcitabin til behandling af kræft i bugspytkirtlen.

Ca. 2 × 10

6 Mia-PaCa-2-celler blev podet subkutant med 0,1 ml Matrigel til nøgne mus. En dag før tumoral celleinokulering, kontrolgruppen fik en intraperitoneal injektion af 150 pi PBS, mens assayet gruppe fik 0,25 mg reg4 monoklonalt antistof i 150 pi PBS. Køretøj buffer eller anti-reg4 antistof blev injiceret ugentligt i dyr. Tumor dimensioner blev målt en gang ugentligt og tumorvolumener beregnet med formlen længde × bredde × dybde × 0,5236. Gemcitabin (100 mg /kg) blev injiceret intraperitonealt to gange om ugen. Værdier er udtrykt som middelværdi +/- SE (n = 6).

Intraperitoneal injektion af reg4 antistof reducerer niveauerne af antiapototic proteiner og cellecyklus-associerede proteiner i Mia-PaCa2-inducerede tumorer

Fordi systemisk behandling med antistoffet reducerer tumorvækst og øger følsomheden over for gemcitabin, anvendte vi western blot-analyse for at overvåge i tumorer indflydelse af reg4 antistofbehandling på de intracellulære niveauer af proteiner forbundet med apoptose (phosphoryleret AKT, Bcl- 2, Bcl-xL og survivin) og cellecyklus (cyclin D1). Som forventet niveauer af phosphoryleret AKT, Bcl-2, Bcl-XL og survivin blev væsentligt reduceret i tumorer fra mus behandlet med reg4 antistof sammenlignet med kontrol. Niveau af cyclin D1 blev også fundet reduceret i reg4 antistof-behandlede mus (figur 7). Disse fund sandsynligvis udgør den observerede reducerede vækstraten. Salg

Tumor vævsprøver blev lyseret i en homogeniseringsbuffer indeholdende en cocktail af antiproteaser. Cellerester og uopløselige materialer blev fjernet ved centrifugering, og opløselige fraktioner blev lagt i Laemmli-puffer på en 12,5% SDS-polyacrylamidgel. Proteinerne blev overført til nitrocellulosemembran og membranen inkuberet med anti phosphorylerede AKT (phospho-Ser473), anti-pan AKT, anti-Bcl-2, anti-Bcl-xL, anti-survivin eller anti-cyclin D1-antistoffer. Efter udvikling blev membranen strippet og testet igen for β-actin.

Diskussion

I denne undersøgelse vores hypotese var, at tidlige genomiske abnormiteter forekommer i bugspytkirtelkræftceller er ansvarlige for dårlig prognose af patienterne og for manglen på et fyldestgørende svar til anti-cancer medicin, herunder gemcitabin. Adskillige DNA-regioner med ændret genkopital blev faktisk observeret i tumorer fra patienter uden påviselige metastaser på tidspunktet for undersøgelsen. I det foreliggende arbejde har vi fokuseret vores opmærksomhed på kromosomet region, der indeholder

reg4

gen, fordi det viste øget kopi nummer i alle 14 patienter analyseres. Desuden blev et øget antal kopier af denne region også findes i næsten alle PanIN3, den seneste fase af forstadier læsioner i bugspytkirtlen, hvilket tyder på, at

reg4

genamplifikation er en tidlig begivenhed i bugspytkirtlen udvikling af kræft. reg4 er en lille secerneret protein, der indeholder en enkelt velbevaret kulhydrat-genkendelsesdomæne [14], [15]. reg4 er medlem af en multigenic familie ved navn

reg Hotel (revideret i 19). Hos mennesker har fem strukturelt beslægtede medlemmer blevet identificeret til dato, og inddeles i tre underklasser på grundlag af de primære strukturer af de kodede proteiner nemlig REG1A og REG1B (Type 1), REG3A og REG3G (Type 3) og REG4 (type 4). I modsætning til

reg1A

,

reg1B

,

reg3A

og

reg3G

gener, alle beliggende på kromosom 2p12,

reg4

er på kromosom 1p13.1-p12. Adskillige rapporter i litteraturen tyder på en stor rolle for REG4 i kræft. For eksempel, REG4 udtryk synes at være ansvarlig for celle resistens overfor lægemidler mod cancer, såsom 5-fluouracil og methotrexat [15], [20], det fremmer AKT phosphorylering og overekspression af de antiapoptotiske proteiner Bd-2, Bd-XL og survivin [21], [22], det aktiverer EGF-receptoren /Akt /AP1 signalvej [21] og dens udtryk korrelerer med øget peritoneal metastaser i gastriske carcinomer [22], [23]. Den er systematisk overudtrykt i ondartede væv afledt af kolon [15], [24], mave [16], prostata [25] og bugspytkirtel [18] og ved sygdomme disponerer for tyktarmskræft, såsom colitis ulcerosa [14], [26] , Crohns sygdom [14] og kolorektal adenom [24]. Den tidlige amplifikation af dets gen i bugspytkirtelkræft beskrevet i denne undersøgelse (figur 1 og 2) og dens onkogene aktivitet rapporteret i litteraturen fået os til yderligere at undersøge den rolle, REG4 i pancreas tumorigenicitet og resistens af pancreascancer til gemcitabin. Den første observation var, at pancreas-cancer-afledte celler, der overudtrykker REG4 protein voksede hurtigere og var mere resistente over for gemcitabin (figur 4). Det andet, mere vigtig observation var, at i en xenotransplantat-model, tumorer induceret med Mia-PaCa2 celler, der udtrykker reg4 voksede hurtigere end kontroltumorer, opnået med native Mia-PaCa2 celler (figur 5). Desuden fandt vi, at de inducerede tumorer af Mia-PaCa2 celler, der udtrykker reg4 var mere resistente over for gemcitabin behandling end kontrol tumorer efter aftale med

in vitro

data og tidligere rapporter tyder inddragelse af REG4 i celle resistens overfor lægemidler mod cancer [15], [20] og reaktion på strålebehandling [27]. Det tredje, meget spændende resultat blev opnået, når mus med Mia-PaCa2-inducerede tumorer blev behandlet med systemisk administration af et specifikt anti-reg4 antistof (figur 6). Vi observerede en vigtig reduktion i tumorstørrelse og en forøget følsomhed over for gemcitabin i mus, der fik en gang om ugen anti-reg4 antistof. Fordi den begrænsede effektivitet af pancreascancer behandling med gemcitabin kan skyldes tilstedeværelsen af ​​stroma i tumorer [28], kiggede vi om reg4 overekspression påvirket omfanget af stromadannelse i subkutant xenotransplanterede Mia-PaCa2 celler. Semikvantitativ analyse afslørede ingen signifikant forskel mellem tumorer overudtrykker eller ikke REG4, eller behandlet med REG4 antistof, alle af dem viser meget begrænset stroma (data ikke vist). Imidlertid kunne vores resultater forklares, i det mindste delvist, ved, at niveauer af antiapoptotiske-associerede proteiner, såsom aktiveret AKT, Bcl-2, Bd-XL og overlevende, samt cellecyklussen-associeret protein cyclin D1 blev kraftigt reduceret (figur 7), hvilket viser, at apoptose og cellecyklus reguleres af reg4. Fordi antistoffer ikke er meningen at trænge tumorceller i store mængder, skal en autokrin eller parakrin effekt overvejes. Ved udskillelse af tumorceller, ville reg4 aktivere, sandsynligvis gennem specifikke receptorer, intracellulære signalveje som begunstiger udviklingen af ​​kræft. Disse data er i overensstemmelse med resultater fundet i colon og gastrisk kræftceller

in vitro

[21], [22]. Tilsammen antyder disse resultater, at overekspression af REG4 protein, induceret af sin tidlige gevinst i genkopiantal, spiller en stor rolle i pancreas tumorudvikling og modstandsdygtighed over for anticancerlægemidler. Målretning cirkulerende REG4 protein vises som en lovende adjuvans til nuværende behandlinger af pancreas adenocarcinom, baseret på gemcitabin administration.

Materialer og metoder

Undersøgelse af

reg4

genkopiantallet i bugspytkirtelkræft

Fjorten hinanden følgende bugspytkirtelkræft prøver blev opnået ved endoskopisk ultralyd (EUS) -Guidede fin nål aspiration cytologi mellem juni 2007 og september 2007 kl hospitalet Nord, Marseille. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere. Seks prøver blev opnået fra patienter uden påviselig metastase henviser 8 præsenteret med metastaser på tidspunktet for punktur-. DNA blev ekstraheret, amplificeret og hybridiseret på Affymetrix hele genomet human SNP-array 6.0 i overensstemmelse med producentens instruktioner (Affymetrix Inc.). Den Affymetrix Genome Wide Menneskelig SNP Array 6,0 funktioner mere end 1,8 millioner markører for genetisk variation, herunder mere end 906,600 enkelt nukleotid polymorfier (SNP) og mere end 946,000 prober til påvisning af kopi nummer variation. Den mediane inter-markør afstand overtaget alle 1,8 millioner SNP og kopiere nummer markører kombineret er 696 baser. Rækken indeholder også 202.000 sonder rettet mod 5.677 kendte områder af kopi nummer variation, løse i 3.182 distinkte, ikke-overlappende segmenter, fra Toronto Database over Genomisk varianter. Hybridisering, vask, farvning, og chip-scanning blev udført af CRCHUL microarray Core Facility ved hjælp af materialer og metoder, som fabrikanten (Affymetrix Inc.).

Samlet hybridisering kvalitet blev estimeret af indkaldelsen sats indekset fås fra GeneChip genotypning Analysis Software (GTYPE, fuglefrø algoritme, der anvender standard parameterindstillinger). Alleliske nøgletal blev beregnet med Partek Genomics Suite, version 6.4 (Partek Inc., St. Louis, MO) ved hjælp af de proprietære standardparametre. A 270 HapMap prøver blev brugt til at skabe kopier nummer fra baseline. Genomisk segmentering blev anvendt som en metode til påvisning af kopital ændringer. Regioner blev påvist ved hjælp af følgende segmentering parametre: mindst 10 genomiske markører; segmentering p-værdi lavere tærskel end 0,001; og et signal til støj lig med 0,3. Ved hjælp af disse parametre, blev påvist 10263 segmenter. Udvalgte segmenter blev visualiseret i en genomisk sammenhæng med Partek® Genomics Suite.

DNA fra Panin læsioner

Syv mikron snit fra formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsblokke blev farvet med hematoxylin og eosin. Homogene populationer af celler blev omhyggeligt mikrodissekeres hjælp af en PixCell II Laser Capture microdissection System (Arcturus, Mountain View, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. PanINs blev gradueret 1 til 3 i henhold til gældende anbefalinger (https://pathology.jhu.edu/pancreas_panin/og [29]) som en funktion af, hvor vigtigt det arkitektoniske og cytologiske abnormiteter. Syv humane pancreas prøver blev analyseret, hvor vi systematisk fundet PanIN2 og PanIN3 læsioner men PanIN1 læsioner blev fundet i kun seks af dem. I alt 300 celler blev indsamlet for hver kategori fra vævssnit serielle. Opsamlede celler blev overført til et Eppendorf-rør og resuspenderet i 20-50 pi lysisbuffer indeholdende 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 (pH 8,3), og 5 pi proteinase K (20 mg /ml). Prøver blev inkuberet 24 timer ved 55 ° C efterfulgt af kogning i 10 minutter for at inaktivere proteinase K. DNeasy Tissue Kit (Qiagen) blev anvendt til at ekstrahere DNA ifølge producentens protokol. Ekstraherede DNA blev kvantificeret ved hjælp af en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE).

reg4

genkopital estimering af Real-Time PCR

reg4

genkopital blev bestemt under anvendelse af hreg4-F: 5′-TTTACTCCCTGTGGTCTGGG-3 ‘og hreg4-R: 5′-CTCTTTTCTCCAGCAAGGCA-3’ primere. Amplifikation blev udført i et LigthCycler 480 (Roche Diagnostic) ved følgende skema: 10 s denaturering ved 95 ° C, 45 cykler af 8 s denaturering ved 95 ° C, 7 s annealing ved 60,5 ° C og 14 sekunders forlængelse ved 72 ° C. Melting kurve blev opnået ved opvarmning ved 20 ° C /s til 95 ° C, afkøling ved 20 ° C /s til 65 ° C og opvarmning ved 0,1 ° C /s til 95 ° C med fluorescens dataindsamling 0.1 ° C intervaller. Standardkurver blev dannet ved anvendelse af en 10-fold fortyndingsrække i området fra 0,1 ng til 100 ng. Udførte vi qPCR for hvert individ i tre eksemplarer og bestemt den normaliserede relative kopiantal ved at generere en standardkurve og normalisere tværs prøver. PCR-resultater blev analyseret ved anvendelse af RealQuant software (Roche Diagnostic). De samme 14 DNA-prøver fra pancreascancer anvendt til hybridisering på Affymetrix Genome-Wide human SNP-array 6.0 blev anvendt til qPCR. DNA fra blodleukocytter opnået fra tilsyneladende raske individer blev anvendt som kontrol.

retroviral vektor og retroviral genoverføring

Hele den kodende sekvens af reg4 cDNA blev amplificeret ved PCR under anvendelse af primerparret 5 ‘-GGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG-3′ (fremad) og 5’-GGCTCGAGCTATGGTCGGTACTTGCACAGG-3 ‘(revers), som indeholdt EcoRI- og Xhol restriktionssites (understreget). Produktet blev subklonet i EcoRI-Xhol-restriktionssteder i pLPCX retrovirale vektor opnået fra S. Lowe (Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Phoenix amfotropisk pakkeceller (10

6) blev udpladet i en seks-brønds plade, inkuberet i 24 timer og transficeres med polyethylenimin med 5 ug retroviral plasmid. Otteogfyrre timer senere blev mediet indeholdende virus filtreret (0,45 um filter, Millipore) til opnåelse af første supernatant. Target Mia-PaCa2 blev udsået på 2 × 10

5 celler pr 35 mm skål og inkuberet natten over. For infektion, blev dyrkningsmediet erstattet med en passende blanding af den første supernatant og dyrkningsmedium (v /v), suppleret med 4 g /ml polybren (Sigma), og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C. Bestanden af ​​reg4 udtrykker Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /reg4) blev isoleret ved selektion i tilstedeværelse af puromycin (1 mg /ml). Mia-PaCa2 inficeret med den tomme vektor (Mia-PaCa2 /tom) blev anvendt som kontrol.

in vitro

undersøgelser

Cell dyrkningsbetingelser og siRNA transfektion.

De bugspytkirtelkræft cellelinier Mia-PaCa2 /reg4 og Mia-PaCa2 /tom blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin i en befugtet 5% CO

2 atmosfære. Dagen før siRNA transfektion blev celler udpladet i 6-brønds plader til sidst give 30-50% konfluens. Efter fjernelse af mediet blev celler vasket en gang med serumfrit medium og transfektion blev udført i serum-frit medium ved tilsætning af en blanding bestående af 10 pi Oligofectamine Reagent (Invitrogen) og 200 pmol siRNA (reg4 siRNA [5’CTTCAGGAAGCTGAGGAAC3 ‘ ] eller kontrol siRNA [5’AATTCTCCGAACGTGTCACGT3 ‘] målrettede sekvenser) fortyndet i 240 pi serum-frit medium. Efter en inkubationsperiode på 4 timer ved 37 ° C blev transfektionsblandingen medium indeholdende siRNA’er erstattet med frisk medium.

Cellevækst og gemcitabin.

10

4 celler /brønd podet på plader med 96 brønde i 100 pi kulturmedium. Den næste dag, gemcitabin (købt hos Eli Lilly) blev tilsat i 100 pi medium til en slutkoncentration på 50 uM i nærvær eller ikke af 1 ug reg4 monoklonalt antistof. Efter 48 timer, 20 pi MTS ([3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium] reagens opnået fra Promega) blev tilsat blev pladerne inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter, og absorbansen aflæses ved 490 nm.

in vivo

undersøgelser

Vurdering af

in vivo

tumorvækst.

Institutionelle retningslinjer for korrekt og human brug i forskning blev fulgt. Ca. 2 × 10

6 Mia-PaCa-2-celler blev podet subkutant med 0,1 ml Matrigel (BD Biosciences Discovery Labware) til 6 uger gamle mandlige nøgne mus. En dag før tumoral celleinokulering, kontrolgruppen fik en intraperitoneal injektion af 150 pi PBS (bærer), mens assayet gruppe fik 0,25 mg reg4 monoklonalt antistof i 150 pi PBS. Køretøj buffer eller anti-reg4 antistof blev injiceret ugentligt i dyr. Tumor dimensioner blev målt en gang ugentligt og tumorvolumener beregnet med formlen længde × bredde × dybde × 0,5236 som tidligere rapporteret [30]. Gemcitabin (100 mg /kg) blev injiceret intraperitonealt to gange om ugen. Alle undersøgelser blev udført i overensstemmelse med EU-regler for dyreforsøg. Forsøgene blev godkendt af den etiske komité ved Marseille Universitet.

Western blot-analyse.

Mia-PaCa2 celler og tumor vævsprøver blev lyseret i en homogenisering buffer indeholdende pepstatin (1,45 mM), leupeptin (2,1 mM), DTT, triethanolamin (50 mM) og EDTA /EGTA (0,1 mM). Cellerester og uopløselige materialer blev fjernet ved centrifugering (14.000 g, 30 min ved 4 ° C) og opløselige fraktioner blev enten umiddelbart analyseret eller opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse. Totalt protein (50 ug) blev lagt i Laemmli-puffer på en 12,5% SDS-polyacrylamidgel i en Mini Cell (Bio-Rad). Proteinerne blev overført til nitrocellulosemembraner i 1 time under anvendelse af en Mini Trans-Blot elektroforetisk Transfer Cell (Bio-Rad). Membranen blev blokeret i 1 x PBS /0,05% Tween 20/5% fedtfri tørmælk natten over ved 4 ° C. Efter to vaske i 1 x PBS /0,005% Tween 20 blev primære antistoffer tilsat i 1-2 timer. Efter yderligere tre gange vask blev det sekundære antistof tilsat i 1,5 time. Membranen blev udviklet ved hjælp af forøget kemiluminescens (ECL) (Amersham Life Science) på Kodak film i mørke rum. Membranen blev derefter strippet og testet igen for β-actin ved anvendelse af protokollen beskrevet i ECL kit Salg

Antistoffer

Anti-humant reg4 monoklonalt antistof (Klon 200214) blev indkøbt fra R D Systems; Bcl-2 (C21), Bd-XL (H-62), survivin (FL-142), cyclin D1 (C20) og β-actin (N-21) kanin-polyklonale antistoffer var fra Santa Cruz Biotechnology; phosphoryleret AKT (phospho-Ser473) polyklonalt antistof var fra Upstate Biotechnology Inc;