PLoS ONE: Cirkulerende microRNA profilering Identificerer en delmængde af metastatisk prostatacancer Patienter med tegn på kræft-associerede Hypoxia

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) er små (-22 nukleotid) ikke-kodning RNA’er, der regulerer et utal af biologiske processer og ofte dysreguleret i kræft. er blevet påvist cancerassocierede microRNA i serum og plasma og holde lovende som minimalt invasive cancer biomarkører, potentielt til vurdering sygdomskarakteristika hos patienter med metastatisk sygdom, der er vanskelig at biopsi. Her anvendte vi miRNA profilering at identificere cancerassocierede miRNA, der udtrykkes differentielt i sera fra patienter med metastatisk kastrationsresistent prostatacancer (mCRPC) sammenlignet med raske kontroller. Af 365 miRNA profilerede, vi identificeret fem serum miRNA (MIR-141, miR-200a, miR-200C, miR-210 og miR-375), som blev forhøjet i tilfælde sammenlignet med kontroller på tværs to uafhængige kohorter. En af disse, MIR-210, er en kendt transkriptionel mål af hypoxi-responsive HIF-1α signalvej. Eksponering af dyrkede prostata kræftceller til hypoxi førte til induktion af miR-210 og dens udgivelse i det ekstracellulære miljø. Desuden fandt vi, at serum miR-210 niveauer varierede meget blandt mCPRC patienter, der gennemgår terapi, og korreleret med behandlingsrespons som vurderet ved ændring i PSA. Vores resultater antyder, at (i) cancerassocieret hypoxia er en hyppig, tidligere under-værdsat karakteristisk for mCPRC, og (ii) serum MIR-210 kan udvikles yderligere som en prædiktiv biomarkør hos patienter med dette særskilt sygdom biologi.

Henvisning: Cheng HH, Mitchell PS, Kroh EM, Dowell AE, Chery L, Siddiqui J, et al. (2013) cirkulerende microRNA profilering Identificerer en delmængde af metastatisk prostatacancer Patienter med tegn på kræft-associerede Hypoxi. PLoS ONE 8 (7): e69239. doi: 10,1371 /journal.pone.0069239

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA

Modtaget: April 23, 2013; Accepteret: 6 Juni 2013; Udgivet: 30 Jul 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var leveret af Canary Foundation (til MT), Damon Runyon-Rachleff Innovation Award (til MT), DOD prostatakræft New Investigator Award (til MT), National Institutes of Health (NIH) CA093900 (til KJP), NIH CA143055 (til KJP) , NIH PA1 CA085859 (til RLV), NIH SPORE P50 CA69568 (til KJP og AMC), NIH SPORE P50 CA97186 (til PSN, MT, og RLV), NIH TR01 5R01DK085714 (til MT), NIH T32CA009515-28 (til HHC) , Prostata Cancer Foundation Kreativitet Award (til MT), og Richard M. Lucas Foundation (til RLV). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Muneesh Tewari er en navngivet opfinder på den verserende patentansøgning med titlen, “Anvendelse af Ekstracellulær RNA til måling Disease, “nr.12 /993.828. H.H.C., P.S.M., E.M.K., A.E.D., L. C., J. S., P.S.N., B.S.K., R.L.V., A.M.C., K.J.P., og C.M. erklære ingen konkurrerende interesser. Forfatterne bekræfte, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Den naturlige historie af patienter med metastatisk kastrationsresistent prostatacancer (mCPRC) varierer bredt, hvilket tyder på en heterogen sygdom biologi i denne patientpopulation. Men lidt om biologisk heterogenitet i mCPRC og tilgange til klinisk lagdeling af patienter er begrænset, i vid udstrækning, fordi metastatisk væv er ikke rutinemæssigt til rådighed for undersøgelsen. Minimalt invasiv (f.eks blod-baserede) nærmer, der kan hjælpe stratificere patienter på grundlag af særskilte tumor biologi kunne hjælpe informere valg af behandling, hvilket er særligt relevant med den nylige indførelse af flere nye effektive behandlinger for mCRPC.

Cirkulerende microRNA (miRNA) er en ny klasse af blod-baserede biomarkører med potentiale til at give oplysninger om særskilt tumor biologi i individuelle patienter [1]. miRNA er små (-22 nukleotid), ikke-kodende RNA-molekyler, som post-transkriptionelt regulerer genekspression ved translationel undertrykkelse eller nedbrydning af målrettede udskrifter [2]. Specifikke miRNA har vist sig at regulere en række kritiske processer i tumor fysiologi, herunder angiogenese [3], epithelial-til-mesenchymal overgang [4], metastase [5], og tumoren respons på hypoxi [6]. miRNA er blevet demonstreret at være effektive vævsbaserede cancer biomarkører-in diagnosticere kræft i ukendt vævsoprindelse og forudsige kliniske resultater [7] – [9]. Vi og andre har vist, at cirkulerende, cellefrie, tumorafledte miRNA er meget stabile og påviselige i serum fra cancerpatienter [1]. I tidligere arbejde, brugte vi en kandidat miRNA tilgang til at identificere betydelig forhøjelse af miR-141 i serum fra patienter med metastatisk kastrationsresistent prostatacancer (mCRPC) [1].

For at mere omfattende identificere prostatakræft associeret cirkulerende miRNA, i den aktuelle undersøgelse, vi profileret serum miRNA fra patienter med mCPRC. Vi identificerede fem serum miRNA, der blev væsentligt forhøjet i tilfælde sammenlignet med raske kontroller, herunder den hypoxi-associerede miR-210. For at afgøre, om prostatacancerceller kan frigive MIR-210 som respons på hypoxi, vi udsat prostatakræft-cellelinier til hypoxiske betingelser og fandt, at MIR-210 blev induceret og frigives til det ekstracellulære miljø. I analysen af ​​kliniske prøver og resultater, fandt vi tegn på, at en delmængde af mCPRC patienter har øget miR-210 niveauer, og at dette korrelerer med behandlingsrespons, hvilket tyder på, at øget hypoxi er en funktion i mCPRC der kan definere en undergruppe af patienter med en tydelig sygdom biologi.

Materialer og metoder

Cell Culture

LNCaP (ATCC ® CRL-1740 ™) og VCAP [10] humane prostatakræft-cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 og DMEM henholdsvis hver suppleret med 10% FBS (eller under serumfrie betingelser, som bemærket), ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Hypoxiske betingelser (1% O

2) blev etableret i en Thermo Scientific 3595 Incubator (ThermoFisher), med celler opretholdt under normoxiske forhold (20% O

2) parallelt.

RNA Isolation fra dyrkede celler og konditionerede medier

Konditionerede medier blev fjernet fra celler dyrket i 24, 48 eller 72 timer under normoxiske eller hypoxiske betingelser. Celler blev vasket med 5 ml PBS og lyseret på is direkte i kulturen fad med 600 pi Lysis /Binding buffer fra

mir

Vana miRNA isolation kit (Ambion). Lysater blev høstet manuelt med en steril celleskraber og overføres til en RNase- /DNase-fri 2 ml mikrocentrifugerør. RNA blev ekstraheret fra cellelysater ifølge producentens anbefalede protokol for total RNA-isolering. Cellerester blev fjernet fra en 500 pi alikvot af konditioneret medium (10 ml totalvolumen) ved filtrering gennem et 0,2 um NanoSep filtreringsenhed (Millipore) ved 14.000 ×

g

, 5 min, ved stuetemperatur. 400 pi filtrerede prøve blev kombineret med 400 pi 2X denaturerende opløsning (Ambion) og vortexet.

C. elegans

spiked-in oligonukleotider blev indført (som en blanding af 25 fmol af hvert oligonukleotid i 5 pi samlet volumen pr væskeprøve) efter denaturering og anvendt til normalisering af variabilitet i RNA-isolering tværs prøver som tidligere beskrevet [1]. RNA blev ekstraheret fra aircondition medier lysater ved hjælp af

mir

Vana PARIS kit (Ambion) efter producentens anbefalede protokol for total RNA isolation.

Etik Statement

Alle kliniske prøver opnået fra personer, som forudsat skriftligt informeret samtykke. Undersøgelser blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen retningslinjer og med etik godkendelse fra Institutional Review Boards ved University of Washington, Fred Hutchinson Cancer Research Center og University of Michigan.

Blood Forarbejdning og isolering af serum fra Klinisk prøver

Alle kliniske prøver opnået ved University of Washington og University of Michigan blev indsamlet og behandlet som tidligere beskrevet [1], [11].

RNA Isolation fra kliniske Serum prøver

Totalt RNA blev isoleret fra 400 pi serum udtaget på University of Washington under anvendelse af Mirvana PARIS kit (Ambion) som tidligere beskrevet [1]. Lige store volumener af hver prøvetype blev samlet til at skabe mCPRC og sunde donor serum pools (n = 25 for hver pulje) for TLDA profilering. Totalt RNA blev isoleret fra serumprøver indsamlet på University of Michigan hjælp af miRNeasy RNA-isolering (Qiagen) som følger: 400 pi serum blev opdelt i fire, 100 pi alikvoter. Hver alikvot blev denatureret under anvendelse af 10X volumen (1 ml) Qiazol, som blev hvirvlet og inkuberet ved stuetemperatur i 10 min.

C. elegans

spiked-in oligonukleotider blev indført (som en blanding af 25 fmol af hvert oligonukleotid i 5 pi samlet volumen pr væskeprøve) efter denaturering, som blev anvendt til normalisering af variabilitet i RNA-isolering tværs prøver som tidligere beskrevet [1] . RNA blev ekstraheret under anvendelse af 0,2 x volumen chloroform (220 pi), og totalt RNA blev isoleret efter fabrikantens protokol. For en given prøve, blev RNA isoleret fra hver 100 pi alikvot samlet og koncentreret til 100 ul volumen over Microcon YM-3 filterenheder (Millipore) ved 14.000 ×

g

, 1,5 time 4 ° C, som var indlæst krænges ind forvejede 1,5 ml mikrocentrifugerør og elueres ved 1000 x

g

, 3 min, 4 ° C. Rør plus eluat blev vejet på en analytisk målestok og bragt til 100 pi med Elution Buffer. RNA blev opbevaret ved -80 ° C.

Indsamling og behandling af kliniske vævssnit

Laser-capture mikro-dissektion (LCM) af frosne vævssnit.

Sektioner af flash-frosne prostata og lymfeknude opnået fra radikal prostatektomi og hurtig obduktion henholdsvis blev vurderet af en patolog til at definere områder af tumor epitelceller. For laser capture mikrodissektion 5 um sektioner af frosne væv blev foretaget på en Leica ™ CM3050S kryostaten ved -20 ° C (Leica, Wetzlar, Tyskland), placeret på PEN Membran Frame Slides (MDS Inc., Ontario, Canada) og derefter farves og faste ifølge HistoGene ™ LCM Frozen Section Staining Kit protokollen (MDS Inc.). For hver prøve ca. 2.000 celler blev laser opfanget ved 200x forstørrelse (Veritas, Arcturus MDS Inc., Ontario, Canada). Det optagne prøve blev anbragt i 300 pi lysepuffer fra RNAqueous® RNA Isolation Kit (Ambion, Austin, Texas), inkuberet i 30 minutter ved 42 ° C og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-isolering blev udført. miRNA blev derefter isoleret ved anvendelse af RNAqueous® RNA Isolation Kit (Ambion).

RNA-isolering fra LCM vævsprøver.

Totalt RNA blev isoleret fra LCM vævsprøver ved hjælp af RNAqueous-Micro RNA-isolering kit (Ambion) som følger: Frosne lysater blev optøet på is, hvirvelbehandlet og centrifugeret ved 16.100 x g, 30 sek, stuetemperatur.

C. elegans

spiked-in oligonukleotider blev indført (som en blanding af 25 fmol af hvert oligonukleotid i 5 pi samlet volumen pr væskeprøve) og anvendt til normalisering af variabilitet i RNA-isolering tværs prøver som tidligere beskrevet [1], efterfulgt af tilsætning af 3 pi LCM Additive. RNA blev udfældet fra lysatet blanding med 1,25 volumener 100% molekylær-grade EtOH og blev efterfølgende bundet til Micro Filterelementet (forvandes med 30 fil Lysis Solution i 5 min) ved centrifugering ved 10.000 x g, 1 min. Filteret blev vasket (180 pi Wash Solution 1, 10.000 ×

g

, 1 min, 2 × 180 pi Wash Solution 2/3, 16.100 ×

g

, 30 sek, luft kun, 16.100 ×

g

, 30 sek). RNA blev elueret fra kolonne to gange med 10 pi 95 ° C Elution Buffer i forvejede rør. Eluater blev vejet på en analytisk målestok og bragt til 20 pi med Elution Buffer. RNA blev opbevaret ved -80 ° C.

microRNA analyse under anvendelse TaqMan Low-Density Array miRNA QRT-PCR og Biomarker Candidate Selection

RNA fra poolet serum fra mCPRC patienter eller raske kontroller (bestående af lige RNA volumen fra hver af 25 prøver pr pool) blev omvendt transskriberet i dublerede reaktioner fra 2 pi samlet RNA ved hjælp af TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit og TaqMan miRNA Multiplex RT Analyser (human pool Set). En samleprøve tilgang blev valgt til omkostningseffektiv opdagelse af miRNA-biomarkører. miRNA ekspression blev profileret fra hver RT-reaktionen replikat ved hjælp af TaqMan Low-Density Array (TLDA, v1.0) som tidligere beskrevet [1]. Multiplex reverse-transskription TLDA QRT-PCR blev udført på et Applied Biosystems 7900HT thermocycler hjælp producentens anbefalede cykelforhold. Data blev analyseret med SDS Relativ Kvantificering Software version 2.2.2 (Applied Biosystems), med en automatisk tildelt minimumsgrænse, hvilket var over baseline af alle undersøgelser, som viser målbar forstærkning over baggrunden. Værdier, der var under minimumsgrænsen blev vilkårligt tildelt en tærskel cyklus (CT) værdi på 40.

P

-værdier blev tildelt af t-test vurdere replikere profilering af data fra hver pulje til at bestemme signifikante forskelle i miRNA udtryk mellem mCPRC pool og sunde kontrol pool RNA-prøver. Fold-ændring (FC) værdier blev afledt ved at beregne 2

∧ (AveCT

mCPRC pool-AveCT

sund styring pool). MicroRNA kandidat biomarkører blev udvalgt af kriterium FC 5 og

P

. 0,05

Måling af miRNA og mRNA-niveauer af de enkelte TaqMan Quantitative Reverse-transskription PCR (QRT-PCR)

miRNA-afledt serumprøver blev revers-transkriberet under anvendelse af TaqMan miRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems) og kvantificeres ved TaqMan miRNA QRT-PCR under anvendelse af miRNA-specifikke primer /probesæt (Applied Biosystems) som beskrevet tidligere [ ,,,0],1]. En komplet beskrivelse af TaqMan assays anvendt i denne undersøgelse er tilvejebragt i tabel S4.

miRNA afledt af serumprøver opnået fra University of Michigan blev kvantificeret ved TaqMan miRNA QRT-PCR under anvendelse af syntetiske miRNA standardkurver for absolut kvantificering identisk der er beskrevet for University of Washington prøvesæt [1] med den undtagelse, at præ-amplifikationstrin blev udelukket fra alle andre end mIR-210 miRNA kvantificering (dette var baseret på empirisk bevis for, at præ-amplifikation ikke øger den absolutte kopi antallet af miRNA påvises i andre TaqMan miRNA analyser der anvendes her, data ikke vist)

Gen-ekspression blev kvantificeret ved TaqMan QRT-PCR som følger:. input RNA var omvendt transskriberet ved hjælp af TaqMan Gene-Expression Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) i et mindre RT-reaktionen [bestående af 0,5 pi 10X bagside-Transskription Buffer, 0,5 pi 10X vilkårlige primere, 0,2 pi 100 mM dNTP’er med dTTP, 0,25 pi Multiscribe Reverse-transkriptase og 3,55 pi input RNA; andre end input RNA komponenter blev fremstillet som et større volumen mastermix], under anvendelse af en Tetrad2 Peltier Thermal Cycler (BioRad) ved 50 ° C i 2 minutter, efterfulgt af 30 cykler ved 95 ° C i 10 min, 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 60 sek. Resulterende cDNA blev kombineret med 3,75 pi præ-amplifikation assayreagenser [bestående af 2,5 pi TaqMan PREAMP Master Mix og 1,25 pi TaqMan Gene-Expression Assay (GUSB eller KRT18) fortyndet 1:100 i TE; andre end input cDNA komponenter blev fremstillet som et større volumen masterblanding at generere en 5,0 pi totalvolumen PCR-reaktion], under anvendelse af en Tetrad2 Peltier Thermal Cycler (BioRad) ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 14 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 4 min. GUSB eller KRT18 forforstærkning reaktionsprodukter blev kombineret med 2,75 pi PCR assayreagenser [bestående af 2,5 pi TaqMan 2X Universal PCR Master Mix, nr AmpErase UNG og 0,25 pi 20X TaqMan Gene-Expression Assay) til at generere en 5,0 pi totalvolumen PCR reaktion til GUSB eller KRT18 hhv. Real-time PCR blev udført på et Applied BioSystems 7900HT thermocycler ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. Data blev analyseret med SDS Relativ Kvantificering Software version 2.2.2 (Applied Biosystems), med den automatiske CT indstilling for at tildele baseline og tærsklen for CT-bestemmelse (Se tabel S3 for resultaterne af messenger RNA målinger).

Resultater og diskussion

for effektivt at opdage serum miRNA, der er forskelligt rigelige mellem kræfttilfælde vs. kontroller, vi brugte real-time PCR-baserede miRNA TaqMan Low-Density Arrays (TLDA) at screene for differentieret overflod af 365 miRNA i serum RNA poolet fra mCPRC patienter (

n =

25) versus aldersmatchede kontroller (

n =

25; alle kontroller havde normal PSA og normale digital rektal eksamen resultater). Efter normalisering af data ved hjælp af spike-in kontrol miRNA og sammenligning af puljet serum RNA fra mCPRC sager til at kontroller (fig. 1

A

og

indsat

), vi identificeret ni miRNA viser en større end 5-gange ændring i overflod (ukorrigerede

P

0,05, t-test). Vi næste individuelt målte disse ni miRNA fra serum RNA af individuelle mCPRC sager og kontroller ved hjælp af miRNA-specifikke Taqman QRT-PCR-analyser. Serum niveauer af fem miRNA blev bekræftet at være signifikant forhøjede i mCPRC tilfælde sammenlignet med kontroller (MIR-141:

P

0,0001, miR-200a:

P =

0,007, miR-200C :

P =

0,017, miR-375:

P =

0,009, og miR-210:

P =

0,022, Wilcoxon signed-rank analyse). Den gennemsnitlige fold-forskel mellem cases og kontroller varierede fra 4,6 (miR-375) til 27,9 (miR-141) (fig. 1

B

,

øvre

og tabel S1). Desuden modtager-drift karakteristiske (ROC) plots demonstrere kapacitet i disse miRNA til at skelne mellem de to grupper (miR-141 arealet under kurven (AUC) = 0,899; miR-200a AUC = 0,699; miR-375 AUC = 0,773 ; miR-200C AUC = 0,721 og miR-210 AUC = 0,678) (figur 1

B

,

lavere

).. Vigtigt er det, vi bekræftet, at kontrol miRNA blev ikke forskelligt udtrykt mellem de to populationer (fig. S1).

(

A)

Måling af cirkulerende miRNA i sera puljede fra patienter med fremskreden prostatacancer, som sammenlignet med raske donorer (som omfatter en Discovery Set) af TLDA profilering. Blue- og brune fyldt cirkler repræsenterer serum miRNA øget eller nedsat (med ukorrigeret p-værdi 0,05), henholdsvis i mCPRC patienter sammenlignet med raske kontroller.

Indsat:

Ni miRNA demonstrerede 5-fold ændring (ikke-justerede

P

0,05, t-test). FC, fold-ændring. (

B)

Bekræftelse af mCPRC-associerede serum miRNA i de enkelte prøver fra Discovery Set fra University of Washington prøver.

Øvre

: miRNA biomarkør kandidater blev målt i de enkelte prøver ved TaqMan miRNA QRT-PCR (

P Drømmeholdet værdi tildelt af Wilcoxon-test), hvor miRNA overflod er givet i form af miRNA kopier /pl serum. Røde barer, gennemsnit +/- SEM af miRNA kopier /pl serum for hver gruppe.

Lavere

: Receiver opererer karakteristiske (ROC) kurver plot følsomhed vs. (1 – specificitet) at vurdere evnen af ​​hver miRNA biomarkør at skelne sager fra kontroller.

(C)

Validering af mCPRC-associerede serum miRNA i en uafhængig Validation Set.

Øvre

: Serum koncentrationen (kopier /ul) af miR-141, miR-375, miR-200C, miR-200a og miR-210 blev målt ved TaqMan miRNA QRT-PCR. Dot-plot forbundet

P

værdier blev tildelt af Wilcoxon-test. Dot plots og ROC kurver blev genereret som beskrevet for fig. 1.

Lavere

:

Red

, resultater fra validering prøve sæt fås fra University of Michigan.

Black

, resultater fra delprøven sæt fås fra University of Washington gengivet fra fig. 1

B

, lavere

. AUC, areal under kurven; mCPRC, prostatacancer patient sera; FC, fold-ændring; CTL, kontrol sera (fra aldersmatchede mandlige individer med normal PSA og negativ digital rektal eksamen).

For at validere disse resultater i en uafhængig eksemplar sæt indsamlet på en anden institution, vi målte miR-141 , miR-200a, miR-200C, miR-375 og miR-210 fra sera af yderligere 21 mCPRC patienter og 20 aldersmatchede raske kontrolpersoner indsamlet på University of Michigan. Alle fem miRNA blev forhøjet i sera fra mCPRC sager i forhold til kontrol i denne uafhængige validering sæt. MIR-141, miR-375 og miR-210 var signifikant på et

P

-værdi tærskel af 0,01 i den anden kohorte (

P =

0.001,

P =

0,021,

P =

0,022 henholdsvis) og miR-200a og miR-200c tendens mod signifikans (

P =

0,073,

P =

0,055 henholdsvis) (fig. 1

C

,

øvre

). ROC kurver var generelt overensstemmende mellem specimen sæt fra de to institutioner (fig. 1

C

,

lavere

). Analyse af serum miRNA markører i forskellige kombinationer vist, at tilføje yderligere miRNA til serum MIR-141 (som havde den bedste ydelse alene) forbedrede ikke evnen til at skelne mellem tilfælde og kontroller (data ikke vist). I overensstemmelse med denne observation, fandt vi, at blandt kræfttilfælde, hvor ekspressionen af ​​miR-141, miR-200a, miR-200C, og miR-375 var højere end alle raske kontrolpersoner, blev disse miRNA også signifikant korreleret med hinanden og med serum PSA (tabel S2). I modsætning hertil miR-210 viser ikke signifikant sammenhæng med nogen af ​​disse fire miRNA (tabel S3) eller med serum PSA, hvilket tyder på, at det giver tydelig information om sygdommen biologi.

For at afgøre, om de fem serum miRNA-markører af mCPRC udtrykkes i prostatakræft væv og kunne derfor være plausibelt kræftcelle-afledt, målt vi deres udtryk i epitelceller, der havde været laser capture mikro-dissekeret fra primær prostatakræft væv (

n =

8) og lymfeknudemetastaser (

n =

8). Vi har detekteret miR-141, miR-200a, miR-200C, miR-375 og miR-210 i alle typer væv evalueret (tabel S3), hvilket tyder på, at disse fem miRNA, da de blev fundet i kredsløbet, kan stamme fra prostatakræft, selvom andre yderligere kilder kan ikke udelukkes.

Tre af serum prostata cancer-associerede miRNA identificeret (miR-141, miR-200a og miR-200C) er epitel-specifikke, meget beslægtet i rækkefølge og har kendte roller i opretholdelse epitel tilstand ved suppression af epitel-til-mesenchymal overgang [4]. Vi hypotesen, at forhøjede cirkulerende niveauer af miR-141, miR-200a og miR-200C afspejler epitel oprindelse af prostata kræftceller.

Tilstedeværelsen af ​​forhøjede cirkulerende miR-141 og miR-375 i mCPRC patienter har også blevet observeret i de seneste mCPRC cirkulerende miRNA biomarkør undersøgelser [12] – [16]. Interessant nok forhøjede MIR-210 blev ikke rapporteret i disse andre undersøgelser, selv om vi har observeret dette i uafhængige specimen sæt fra to forskellige institutioner. Dette kan skyldes forskellige sammenligningsgrupper benyttes (f.eks, lokaliseret prostatacancer snarere end raske kontroller som komparatoren til mCPRC), anvendelse af plasma i stedet for serum, forskelle i data analytisk fremgangsmåde, der anvendes til at identificere differentielt udtrykte miRNA, samt potentielle forskelle i de kliniske karakteristika for mCPRC patienter i forskellige undersøgelser.

forhøjede niveauer af mIR-210 i serum fra patienter med mCPRC var særlig interessant, fordi denne miRNA er velkendt at være transskriptionelt aktiveret af hypoxi -inducerbare faktor 1 alfa (HIF-1α) [17], [18] og kan bidrage til tilpasning til hypoxi i tumorer [19], [20]. Dette rejser den mulighed, at MIR-210 er produceret og frigivet af hypoxiske celler i prostatacancer (og /eller ved tumormikromiljøet), en potentiel forklaring på forhøjede niveauer af MIR-210 vi observeret i serum hos en undergruppe af patienter med mCRPC.

for at teste, om hypoxi kan stimulere produktion og frigivelse af miR-210 i prostata kræftceller, vi karakteriseret miR-210 overflod i LNCaP og VCAP prostatakræft-cellelinier (samt i filtreret konditioneret medie) under normoxisk (20% O

2) og hypoxiske (1% O

2) betingelser over en 72-timers kursus (fig. 2). MIR-210-niveauer blev øget med hypoxi sammenlignet med normoxi med en initial induktion i LNCaP-celler efterfulgt af en efterfølgende øget niveau i de konditionerede medier (fig. 2). I VCAP celler, vi ikke observere den samme stigning i miR-210 kopier /ng af RNA og niveauet faldet på 72 timer. Vi spekulere, at dette kunne skyldes celledød, eller alternativt, at reguleringen af ​​miR-210 som respons på hypoxi i VCAP celler kan være primært forekommende på niveau med udgivelsen. Men vi observere en trinvis, tidsafhængig stigning i niveauet af ekstracellulær MIR-210 i det konditionerede medium af VCap celler (Fig. 2). Tilsammen viser resultaterne, at forhøjede niveauer af miR-210 påvist i serum kunne afspejle tumor hypoxi.

Venstre kolonne,

miR-210 kopier /ng RNA i LNCaP- og VCAP menneskelig prostatakræft cellelinjer dyrket i normoxisk (20% O

2) (hvide søjler) eller hypoxiske (1% O

2) (blå søjler) betingelser i 24, 48 eller 72 timer.

Right kolonne,

miR-210 kopier /ul i filtreret konditioneret medium svarende til celleprøver. *,

P Drømmeholdet værdi 0,05; **,

P Drømmeholdet værdi 0,01; ***,

P Drømmeholdet værdi. 0,001 (t-test)

Tumor hypoxi er en velkarakteriseret proces, der bidrager til kræft progression og metastase i mange humane kræftformer [21]. Evaluering af tumor hypoxi i mCPRC har været begrænset til dato på grund af sjældne prøveudtagning af metastaser til rutinemæssig klinisk pleje. I en immunhistokemisk undersøgelse af HIF-1α udtryk, der indarbejdet en lille sæt af prostatakræft metastaser, blev der observeret HIF-1α udtryk varierer meget i metastatiske læsioner [22]. Her viser vi, at en undergruppe af patienter med metastatisk prostatacancer har øget niveauer af serum miR-210, der beviser for tidligere under-værdsat iltsvind i mCPRC. Selv ikke-tumor væv kilder miR-210 ikke kan udelukkes, at den omstændighed, at systemisk hypoxæmi er ikke et typisk træk ved mCPRC er i overensstemmelse med en model, hvor tumorvæv hypoxi er oprindelsen af ​​den overskydende serum miR-210. Især forhøjet cirkulerende miR-210 er også blevet observeret hos patienter med pancreas adenocarcinom [23], en sygdom, hvor tumor hypoxi er velkendt og er på grund af høj interstitielle pres på grund af værtens desmoplastiske respons.

En veldokumenteret fænomen forbundet med tumor hypoksi er foreningen med resistens over for behandling med strålebehandling, kemoterapi og andre behandlinger [21]. For at bestemme om observerede serum miR-210 niveauer blev forbundet med behandling modstand, vi efterfølgende vurderet, om patienter reagerer eller resistente over for igangværende terapi ved at beregne% PSA ændring /dag ved hjælp af tilgængelige kliniske PSA-værdier målt senest forud for og på tidspunktet for serum miR-210 draw. Terapier varierede blandt patienter i denne retrospektive population, men typisk involveret androgen deprivation terapi under anvendelse af en GnRH-agonist i kombination med et kemoterapeutisk middel (fx docetaxel, mitoxantron). Vi fandt, at serum miR-210 niveauer blev signifikant korreleret med% PSA ændring /dag under behandlingen (fig. 3

En

, Pearson r = 0,46,

P =

0,029). For at reducere potentielle støj fra patienter, der er mindre informative på grund af lave niveauer af kræft-associerede serum miRNA, vi analyserede også en undergruppe af patienter med høje niveauer af mCPRC-associerede serum miRNA (dvs. “miRNA-høj delmængde”, defineret som patienter hvis serum mIR-141, mIR-200a, mIR-200C og /eller mIR-375 niveauer var større end den højeste observeret i nogen af ​​de 25 raske kontroller værdi). I denne gruppe, sammenhængen mellem serum miR-210 og% PSA ændring /dag var endnu stærkere (fig. 3

En

, Pearson r = 0,61,

P

= 0,029). Desuden serumniveauer af miR-210 var markant lavere hos patienter, hvis sygdom var at reagere på behandlingen (PSA stabil eller faldende), i forhold til dem, hvis sygdom var resistent over for behandling (PSA stigning på ≥25%) (fig. 3

B,

P

=

0,001). Vigtigere er det, vi ikke observere dette samarbejde med de øvrige fire serum miRNA identificeret i vores undersøgelse (fig. 3

C

). Vores data tyder på en model, hvor øget hypoxi respons signalering er til stede i en delmængde af mCPRC patienter, hvilket fører til øget serum miR-210 og terapi modstand

Øvre:.

MIR-210 kopier /pi serum versus% PSA ændring /dag. % PSA ændring /dag repræsenterer et mål for respons på behandling og blev beregnet ved anvendelse tilgængelige kliniske PSA-værdierne senest målt før og på tidspunktet for serum MIR-210 draw. Mean tidsrummet mellem de to blod trækker var 30 dage. Lukkede cirkler repræsenterer den delmængde af patienter, defineret som “miRNA-høj” baseret på højere overflod af mCPRC-associerede serum miRNA i forhold til alle kontrol individer (som beskrevet i Resultater og Diskussion). Åbne cirkler repræsenterer patienter med mCPRC, som ikke opfylder definitionen for “miRNA-høj”. Optrukne linie repræsenterer tendensen linje i miRNA-høj patientundergruppe, punkterede linie repræsenterer trendlinjen af ​​alle patienter.

Mellemøsten:

miR-210 kopier /pi serum hos patienter med enten en PSA Response (R) eller Nej PSA Response (NR). PSA respons er defineret som en faldende eller stabil PSA (enhver ændring mindre end en 25% stigning), og nr PSA respons er defineret som en PSA stigning på 25% eller derover, svarende til prostatakræft Working Group kriterier.

Nedre:.

Kopier /pi serum af miR-141, miR-200a, miR-200C og miR-375 i patienter, R og NR

Så vidt vi ved, er dette den første rapport af cirkulerende miR-210 i samarbejde med mCPRC. Vores resultater rejser den mulighed, at serum MIR-210-niveauerne kunne anvendes til at identificere en biologisk distinkt, delmængde af mCPRC patienter med tumorassocieret hypoxi for hvem kunne anses udviklingen af ​​alternative behandlingsmetoder. For eksempel er der rapporteret plasma MIR-210 niveauer at være forhøjet i patienter med pancreascancer og som indikator for hypoxi [23], [24], samt korreleret med respons på trastuzumab hos brystkræftpatienter [25]. Desuden er mTOR inhibitorer blev undersøgt hos prostatacancer, og prækliniske studier har vist, at mTOR inhibering kan føre til AKT aktivering og HIF-1α transkriptionel aktivering [26]. I denne sammenhæng spekulere vi, at forhøjet serum MIR-210 kunne have potentiel anvendelighed som en prædiktiv eller respons biomarkør for denne klasse af terapeutiske midler.