PLoS ONE: Effekter af Methylering Status for CpG steder inden for HPV 16 Lang Kontrol Region med HPV16-Positiv hoved- og halscancer Cells

Abstrakt

Målsætning

For at kortlægge omfattende status methylering af CpG steder i HPV16 lange kontrol region (LCR) i HPV-positive kræftceller, og yderligere at undersøge virkningerne af methylering status HPV16 LCR om celle bioaktivitet og E6 og E7 udtryk. Hertil kommer, at analysere status methylering af LCR til HPV-positive svælg pladecellekræft (OPSCC) patienter.

Metoder og Materialer

methylering mønstre af HPV 16 LCR i UM-SCC47, CaSki og SiHa-celler og HPV16-positiive OPSCC prøver blev påvist ved bisulfit-sekventering af PCR og TA kloning. For celler behandlet med 5-aza-2′-deoxycytidin og E6 og E7 knockdown, MTS og trypanblåt-farvning, annexin-V og 7-AAD-farvning, og prodidium iodid blev anvendt til at evaluere cellevækst og celleproliferation, celleapoptose, og cellecyklusstop hhv. E6 og E7 mRNA og proteinekspression blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR og immuncytokemi, henholdsvis.

Resultater

Hypermethylering status LCR i UM-SCC47 (79,8%) og CaSki-celler ( 90,0%) og unmethylation status LCR i SiHa-celler (0%) blev observeret. Ved demethylering, cellerne med forskellige methylering niveauer reagerede forskelligt under vækst, apoptose, og cellecyklusstop, samt med hensyn til deres E6 og E7-ekspression. I HPV16-positive OPSCC patienter var methylering satser var 9,5% i hele LCR region, 13,9% i 5′-LCR, 6,0% i E6 enhancer, og 9,5% i p97-promotoren, og hypermethylering af p97-promotoren blev fundet i en delmængde af sager (20,0%, 2/10).

konklusioner

Vores undersøgelse afslørede to forskellige methylering niveauer i LCR i HPV16-positive cancerceller og OPSCC patienter, der kan repræsentere forskellige carcinogenese mekanismer HPV-positive cancerceller. Demethylering de meCpGs i HPV 16 LCR kan være et potentielt mål for en undergruppe af HPV16-positive patienter med hoved og hals pladecellekræft

Henvisning:. Zhang C, Deng Z, Pan X, Uehara T, Suzuki M, xie M (2015) Virkninger af Methylering status for CpG steder inden for HPV 16 lang Kontrol Region med HPV16-Positiv hoved- og halscancer Cells. PLoS ONE 10 (10): e0141245. doi: 10,1371 /journal.pone.0141245

Redaktør: Scott M. Langevin, University of Cincinnati College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: May 5, 2015; Accepteret: 5 Oktober 2015; Udgivet: 28 Oktober 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China, (81372477 til MX); (https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/), Japan Society for fremme af Science (KAKENHI 26.462.610 til MS og KAKENHI 26.462.611 til ZD); (https://www.jsps.go.jp/english/), Specialized Forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelser, Kina (20114433110001 til MX); (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm), Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (2014A030310411 til ZD) (https://www.gdstc.gov. cn /eng /mission.html), og en bevilling fra Videnskab og Teknologi Development center, Undervisningsministeriet i Kina (20134433120021 til ZD); (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Vedvarende infektion med human papillomavirus højrisiko (HPV) er blevet etableret som en ætiologisk faktor i tillæg til overdreven tobak og alkohol til hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) [1-4]. Det gælder svælg pladecellekræft (OPSCC) i særdeleshed; 50-70% af OPSCC patienter er smittet med HPV 16 [2-7]. E6 og E7 er de to vigtigste virale oncoproteiner ansvarlige for vedligeholdelsen af ​​HPV-medieret malign transformation gennem deres interaktion med flere vigtige cellulære proteiner, såsom p53 og pRb [8,9]. E2 protein kan bidrage til flere biologiske processer, herunder viral transskription og viral DNA-replikation [10-13], og fremkalde vækst anholdelse og celle apoptose via dens virkninger på ekspression af E6 og E7 og andre virale proteiner [14-16]. Alle disse aktiviteter E2 er afhængige af dets evne til at binde til det virale DNA-genom, især den tidlige promotor p97 ved specifikke E2-bindingssteder (E2BSs) anbragt inden i lange kontrolregion (LCR) af HPV-genomet [15,17] . Den forstærker, placeret i 5′-enden af ​​p97-promotor, bidrager også til reguleringen af ​​E6 og E7 udtryk [12].

Tidligere undersøgelser har vist, at integrationen af ​​virale genomer i værtsgenomet er ofte forbundet med forstyrrelser af E2-genet, hvilket fører til ukontrolleret ekspression af E6 og E7 oncoproteiner [15,18,19], Wilson et al fandt signifikant berigelse af potentielle integration sites inden for E2-regionen, hvilket antyder, at E2 var også en fælles placering af afbrydelse på en integration i værtsgenomet i HNSCC [19]. en række undersøgelser viste imidlertid, at mange maligne HPV-associerede karcinomer mangler integrerede virale genom kopier eller omfatte integrerede virale genomer ledsaget af episomale virale genomer. Selv om nogle virusgenomer er fuldt integreret, kan E2-genet være intakte og multiple kopier af HPV-genomet tilbageholdes i tandem arrays, også kaldet “concatemerer,” såsom HPV16-inficerede CaSki-cellelinien [20]. Således har man forsøgt at forstå andre mekanismer, herunder methylering eller sekvensvariationer i LCR, der regulerer E6 og E7-ekspression [7,21,22].

DNA methylering refererer til overførslen af ​​en methylgruppe til cytosinrester, der normalt fører til gene silencing ved enten fysisk at hæmme bindingen af ​​transkriptionsfaktorer eller kromatinstruktur remodeling [15,23]. status methylering af HPV 16 genomet, som indeholder 15 dinukleotid CpG steder i LCR, i livmoderhalskræft cellelinjer og kliniske prøver er blevet analyseret, men roller HPV genom methylering i carcinogenese fortsat uklare [24-29]. Øget methylering af HPV-genomet er fundet konsekvent på de fleste steder i livmoderhalsen carcinoma eller high-grade cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) sammenlignet med lav kvalitet CIN [24,25]. Methylering af HPV-genomet er opstået som en biomarkør for kræft progression i livmoderhalskræft [15,24,30,31]. Desuden rapporterede nogle forskere, at hypometylering status CaSki celler induceret af en DNA-methylering inhibitor reducerede cellulære levedygtighed, men påvirkede ikke bioaktivitet i HeLa celler, der indeholder en helt methyleret HPV-18-genom [27], der inspirerede os til at udforske de potentielle nye effekter af status HPV methylering i HPV-positive kræftformer.

til dato, men der er ingen oplysninger om virkningerne af methylering variation og dens regulering mekanisme i HNSCC celler. Eftersom methyleret CpG (meCpG) er potentielt reversibel, demethylering de meCpGs af HPV genomet kan være et værdifuldt mål for kræftbehandling. For at udfylde dette hul i viden, vi udnyttet HNSCC celler for første gang at foretage omfattende kortlægge status methylering af CpG steder i LCR, og på yderligere at undersøge virkningerne af demethylering HPV16 LCR på celle bioaktivitet og E6 og E7 udtryk. Desuden meget få undersøgelser undersøgte HNSCC prøver, og deres resultater er inkonsekvent [19,32,33]; derfor vi viste status methylering af LCR i HPV-positive OPSCC patienter.

Materialer og metoder

Cell kultur og 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-DC) behandling

HNSCC cellelinje UM-SCC47, som blev udviklet fra en patient med lateral tungen kræft [34] (en gave fra professor Thomas E. Carey, University of Michigan), og livmoderhalskræft cellelinjer CaSki ( ECACC, Salisbury, UK) og SiHa (ATCC, Tokyo, Japan) blev karakteriseret i denne undersøgelse (tabel 1). En integreret HPV16-genomet blev påvist i UM-SCC47, CaSki, og SiHa cellelinjer, som indeholder 15, 600, og 1-2 kopier af HPV 16 genomet henholdsvis [35,36]. Cellerne blev dyrket i RPMI1640 (for UM-SCC47 og CaSki) eller EMEM (for SiHa) indeholdende 10% føtalt bovint serum og 100 IU /ml penicillin /streptomycin. Demethyleringsreagenset 5-aza-dc (Sigma, St. Louis, MO) blev opløst i DMSO ved 50 mM og opbevaret i portioner ved -80 ° C indtil anvendelse. Eksponentielt voksende celler blev behandlet med 5-aza-dc ved forskellige koncentrationer (0,1-5 uM) i 72-120 timer. Kulturmediet indeholdende frisklavet 5-aza-DC blev udskiftet hver 24 timer.

Kliniske prøver

De tumorvæv blev indsamlet fra patienter behandlet på Institut for Otorhinolaryngologi, leder og halskirurgi, University of the Ryukyus mellem december 2008 og maj 2011. etiske komité af University of the Ryukyus specifikt godkendt denne undersøgelse, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. HPV16 infektion blev bestemt ved PCR-amplifikation og sekventering som tidligere [5,37] rapporteret. Prøver fra 10 repræsentative OPSCC patienter med HPV16-infektion blev undersøgt i denne undersøgelse (tabel 2).

Bisulfit modifikation, PCR-opformering, TA kloning og DNA-sekventering

DNA-ekstraktion fra celler og vævsprøver blev udført under anvendelse af en Gentra Oprensning Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA) som tidligere rapporteret [5], og DNA (1-2 ug) blev bisulfit omdannet ved anvendelse af en EpiTect

® Plus bisulfit Kit (QIAGEN, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol.

det modificerede DNA blev amplificeret i 3 amplikoner med bisulfit-sekventering af PCR (BSP) -primer assays og betegnet BSP-1, BSP-2, og BSP-3 (S1 Tabel). For UM-SCC47 og nogle vævsprøver, der var negativ på PCR-amplifikation ved hjælp af primer sæt BSP-1 eller BSP-2, vi vedtog primeren sætter BSP-5 og BSP-6 i stedet (S1 tabel). BSP blev udført i et 25 pi volumen indeholdende 0,2 mM af hver af de 4 dNTP’er, 2 mM MgC

2, 10 pmol af hver primer, 1,25 enheder AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), og 300 ng bisulfit-modificeret DNA. BSP-betingelserne var 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 45 cykler ved 95 ° C i 1 min, 54 ° C i 1 min og 72 ° C i 2 min, med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min. Som tidligere rapporteret [5], blev PCR-produkter oprenset under anvendelse af en Wizard

® SV Gel og PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI) og derefter klonet ind i pCR ™ 4-TOPO

® vektor (Invitrogen , Carlsbad, CA) til sekventering. For hver amplikon blev mindst 6 individuelle kloner sekventeret ved anvendelse af en ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Methylering-specifik PCR

Nested PCR blev udført for at analysere den overordnede status for methylering af LCR og methylering variation efter demethylering behandling. De anvendte primere for nested PCR er vist i S1 tabel, og deres produkter dækker 7 methylerede /umethylerede (M /U) CpG sites i 5′-LCR og forstærker region. Bisulfit-modificerede DNA blev først amplificeret ved PCR med BSP-6 primersæt. BSP blev udført i et 25 pi volumen indeholdende 0,2 mM af hver af de 4 dNTP’er, 2 mM MgC

2, 10 pmol af hver primer, 1,25 enheder AmpliTaq DNA-polymerase (Applied Biosystems), og 100 ng bisulfit-modificerede DNA. BSP-betingelserne var 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 25 cykler ved 95 ° C i 60 s, 54 ° C i 60 s og 72 ° C i 2 min, med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min. Derefter blev produktet fra den første runde af PCR blev underkastet en anden runde af amplificering under anvendelse af methylering specifik PCR primersæt (S1 Table), kunne så methylerede og ikke-methylerede sekvenser amplificeres separat. PCR blev udført i et 20 pi volumen indeholdende 0,2 mM af hver af de 4 dNTP’er, 2 mM MgC

2, 10 pmol af hver primer, 1,0 enhed AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems), og 3 pi produkt af første runde af BSP. PCR-betingelserne var 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 25 cykler af 95 ° C i 40 s, 58 ° C i 40 s og 72 ° C i 1 min, med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min.

Knockdown af E6 og E7

Lyddæmper

® Vælg siRNA rettet mod HPV 16 E6 og E7 (5′-GUA UGG AAC AAC AUU AGA A-3 ‘), Silencer

® siRNA targeting GAPDH (positiv kontrol), og krypterede siRNA (negativ kontrol) blev opnået fra Ambion (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan). For siRNA transfektion blev cellerne udsået i 6-brønds plader (1,0 x 10

5 celler /brønd). Efter genvinding natten over blev cellerne transficeret individuelt med 60 nM siRNA anvendelse af en Lipofectamine RNAiMax

® Reagent (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Cellerne blev underkastet total RNA-ekstraktion ved 72 timer efter transfektion, og vækstinhibering, apoptose, og cellecyklusstop blev analyseret efter 96 timer efter transfektion.

Påvisning af proliferation og apoptose, og cellecyklusanalyse

for at detektere vækstinhibering efter demethylering behandling blev cellerne udsået in triplo i 96-brønds plader (1.500 celler /brønd). Efter genvinding natten over blev cellerne behandlet kontinuerligt med frisk fremstillet 5-aza-dc fra dag 1 til dag 7. Celleproliferation på forskellige tidspunkter blev målt under anvendelse af en CellTiter 96

® Aqueous One Solution celleproliferationsassay (MTS; Promega , Madison, WI) og absorbansen (OD 490 nm) blev målt ved anvendelse af en microreader (SH-1000; Wakenyaku, Kyoto, Japan). Efter knockdown af E6 og E7, vi hovedsageligt fokuseret på hæmning af spredning på 96 timer. Således har vi udnyttet trypanblåteksklusion for cellevækst hæmning efter siRNA. Cellerne blev podet tredobbelt i 6-brønds plader (1,0 x 10

5 celler /brønd). Efter 96 timer efter transfektion af siRNA’er blev cellerne løsrevet og farvet med 0,4% trypanblåt opløsning, og vækstinhibering udbytte kan bestemmes ved at tælle og sammenligne dye-eksklusiv celler mellem grupperne transficeret med scrambled siRNA eller siRNA targeting E6 eller E7 . Desuden kunne de døde celler efter tab af E6 og E7 sammenlignes mellem forskellige grupper

For at vurdere hastigheden af ​​apoptose, annexin-V og 7-AAD farvning. (Guava nexin Reagent, Millipore, Hayward, CA) blev undersøgt ved flowcytometri (Guava EasyCyte Plus flow Cytometer, Millipore). Cellerne blev podet i plader med 6 brønde (1,0 x 10

5 celler /brønd). Efter genvinding natten over blev cellerne behandlet med 5-aza-DC eller transficeret med siRNA som beskrevet ovenfor. Ifølge producentens instruktioner, blev logaritmen annexin-V-PE og 7-AAD vises på x- og y-akser cytogram hhv. Annexin-V-positive celler plottet i nederste højre og øvre højre kvadranter blev evalueret så tidligt apoptotiske celler og sent apoptotiske /døde celler.

Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse propidiumiodidfarvning at bestemme DNA-indhold . Cellerne blev behandlet med 5-aza-DC eller transficeret med siRNA som beskrevet ovenfor. Efter opsamling af dyrkningsmediet, blev cellerne vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og fritliggende. De frigjorte og flydende celler i dyrkningsmediet og PBS blev opsamlet ved centrifugering. Efter bortkastning af supernatanten og fiksering af cellerne med iskold ethanol blev cellerne farvet med Guava cellecyklus reagens og data blev erhvervet ved anvendelse af en Guava EasyCyte Plus Flow Cytometer. Modfit LT ™ 4.0-software (Verity Software House, Topsham, ME) blev anvendt til at analysere cellecyklus resultater.

Kvantitativ real-time PCR

For at opdage E6 og E7 udtryk efter 5-aza -dc behandling eller E6 og E7 knockdown, blev totalt RNA ekstraheret fra cellerne og omdannes til cDNA som tidligere [36] rapporterede. β-Actin blev vedtaget som en intern kontrol; β-actin, E6 og E7 blev amplificeret under anvendelse af ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) og TaqMan

® PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Foster City, CA) som beskrevet tidligere [32,36] . De relative udtryk for E6 og E7 blev beregnet som E6 /β-actin og E7 /β-actin.

Immuncytokemi

Cellerne blev podet i plader med 6 brønde med steriliserede dækglas i bunden af brønden og behandlet med 5-aza-DC som beskrevet ovenfor. Efter at cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur blev dækglassene blokeret med 3% H

2O

2 i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev dækglassene underkastet inkubation natten over ved 4 ° C med et primært anti-HPV16-E6-antistof (C1P5, 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) eller anti-HPV16-E7-antistof (ED17, 1: 100 ; Santa Cruz Biotechnology). Cellerne blev vasket med PBS og inkuberet med et peberrodsperoxidase-konjugeret ged anti-mus sekundært antistof (MTM Laboratories AG, Heidelberg, Tyskland) i 30 minutter ved stuetemperatur. Sektionerne blev derefter farve-udviklet i 3-3′-diaminobenzidin i 3 minutter og modfarvet med hæmatoxylin.

Statistisk analyse

Sammenligninger af to grupper blev udført ved anvendelse af t-test eller ikke- parametriske tests. Forskellen i frekvenser mellem to grupper blev analyseret under anvendelse af Pearsons χ

2 test eller Fishers eksakte test. Foreningerne mellem methylering status og virusmængde, og E2 /E6 sats blev analyseret ved Spearman rang korrelation. En P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske tests var to-sidet, og alle analyser blev udført med SPSS software v12.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultater

Forskellige LCR methylering mønstre i HPV16- positive cancercellelinier

i alt 15 CpG der ligger inden for LCR af HPV16-genomet, som er rig på regulatoriske elementer, blev undersøgt i denne undersøgelse (fig 1A og S1 fig). Da dette var den første undersøgelse af LCR UM-SCC47 celler købte vi LCR sekvens ved PCR ved hjælp af 3 primersæt, der er, LCR-1, -2, og -3, som vist i S1 tabel. Siden 2 nucleotid (nt) mutationer (nt7435 og NT31) ændret tilstedeværelsen af ​​bindingssteder for CpG (Fig 1B og 1C, og S1 Fig), blev kun 13 CpG sites vurderet i UM-SCC47 celler (S1 Fig). I dette studie viste UM-SCC47 og CaSki celler hypermethylering i LCR (79,8% og 90,0%, henholdsvis) (fig 2A og 2B). Den CpG websted (nt7862) placeret i E2BS-2 var relativt hypomethylated (37,5% i UM-SCC47 og 12,5% i CaSki), mens CpG steder i E2BSs andre end nt7862 blev hypermethyleret i UM-SCC47 (97,9%) og CaSki (100%) celler. Derimod alle CpG steder i LCR i SiHa celler umethyleret (0/120) (fig 2C). Således kunne SiHa celler anvendes som en negativ kontrol for yderligere undersøgelser af demethylering af meCpG sites.

A) Strukturen af ​​HPV 16 LCR og placering af CpG sites. Transkriptionsfaktorbindingssites er også vist. B, C) Nukleotid- mutationer ved nt7435 (G → A) og NT31 (C → T) af UM-SCC47 celler påvirket af tilstedeværelsen af ​​de CpG-steder.

Otte individuelle kloner blev sekventeret for at identificere tilstedeværelse og skift af hver methyleret CpG-dinukleotid før og efter demethylering induceret af 0,5 uM 5-aza-DC i 96 timer i A) UM-SCC47, B) CaSki, og C) SiHa-celler. Udfyldte cirkler repræsenterer methylerede CpG’er (meCpGs), åbne cirkler repræsenterer ikke-methylerede CpG’er, og asterisker repræsenterer fravær af CpG sites. D) Methylering af CpG sites i væv. For hver CpG-sted, blev 6 kloner sekventeret for at identificere tilstedeværelsen og hyppigheden af ​​meCpG kloner. Procentdelene af meCpG kloner er angivet med venstre lodrette bjælke. Nederst i figuren, er placeringen af ​​de CpG sites markeret.

5-Aza-dc inducerer CpG hypometylering i LCR i UM-SCC47 og CaSki celler

Som en stærk demethyleringsreagens, 5-aza-dc har vist terapeutiske virkninger på hæmatologiske maligne sygdomme og visse faste tumorer, herunder HNSCC [38]. I den foreliggende undersøgelse, behandling med 0,5 pM 5-aza-DC i 96 timer viste optimal demethylering styrke (0,1-5 uM testet) (S2 Fig).

Efter 0,5 pM 5-aza-dc behandling, den satser meCpGs inden LCR i UM-SCC47 og CaSki-celler var signifikant faldt til 19,2% (20/104; P 0,001) og 29,2% (35/120; P 0,001), hvorimod ingen ændring blev fundet i SiHa-celler (0%, 0/120) (Fig 2). Interessant nok i UM-SCC47 celler behandlet med 5-aza-dc, ikke kun var meCpGs i promotorregionen demethyleres betydeligt mere end i 5′-LCR og enhancer region (P = 0,038), men også meCpGs inden E2BSs havde signifikant større demethylering variation (P = 0,025).

LCR demethylering falder E6 og E7 udtryk i UM-SCC47 og CaSki celler

Ved demethylering behandling med 0,5 pM 5-aza-dC i 96 timer, ekspressionen af ​​E6 og E7 mRNA blev signifikant reduceret i UM-SCC47 (P = 0,021 og P = 0,008, henholdsvis) og CaSki-celler (P = 0,017 og P = 0,023, henholdsvis), men ikke i SiHa-celler (fig 3A og 3B ). Desuden vi opdaget E6 og E7 proteiner i UM-SCC47 og CaSki celler ved immuncytokemi. E6- og E7-proteinerne blev lokaliseret i cytosolen og kernen af ​​UM-SCC47 og CaSki-celler, og procentdelen af ​​farvede celler og farvningsintensitet var betydeligt reducerede efter demethylering (fig 3C og 3D).

Demethylering af CpG sites induceret af 0,5 uM 5-aza-DC i 96 timer faldt E6 og E7-ekspression, som blev påvist ved revers transkription-PCR A) og kvantitativ real-time PCR B); E6 og E7 var klart faldet i UM-SCC47 og CaSki celler, men der var ingen tydelig ændring i SiHa celler. Værdierne (middelværdi ± SD) blev opnået fra mindst 3 uafhængige forsøg. C) E6 og D) E7 protein efter demethylering af bindingssteder for CpG blev påvist ved immunocytokemi; E6 og E7 oncoproteiner blev fordelt i cytoplasmaet og kernen af ​​UM-SCC47 og CaSki-celler med en stærk farvning intensitet (× 100, bar = 100 um), og begge de procentsatser og intensiteten af ​​farvede celler var klart faldt efter demethylering (× 100 , bar = 100 um).

hypometylering af HPV 16 LCR reducerer celleproliferation, øger apoptose, og inducerer cellecyklusstop i uM-SCC47 og CaSki celler

for at undersøge, om demethylering af HPV16 LCR med 5-aza-dc påvirker celle bioaktivitet, vi analyserede proliferation, apoptose, og cellecyklusstop. Vækst- og fysiske egenskaber af alle 3 cellelinjer blev ikke åbenbart ændret sig i de 2 dage efter 5-aza-dc behandling. Men 4 dage efter behandling, væksten af ​​UM-SCC47 og CaSki-celler blev næsten fuldstændig inhiberet (fig 4A), hvilket var i overensstemmelse med den optimale behandlingsvarighed og det efterfølgende tab af E6 og E7-ekspression. Væksthæmning af SiHa-celler som følge af 5-aza-dc behandling blev også observeret, hvilket kan være forbundet med cytotoksicitet af 5-aza-dc induceret af den akkumulerede inkorporering i cellulært DNA [39]; Men effekten var beskedent sammenlignet med CaSki og UM-SCC47 celler (Fig 4A).

A) Efter demethylering af CpG sites, blev cellevækst stærkt hæmmet i UM-SCC47 og CaSki celler, men ikke i SiHa-celler. B) E6 og E7 ekspression blev signifikant nedsat efter siRNA transfektion. C) Cellevækst blev inhiberet ved 96 timer efter E6 og E7 knockdown. Alle data er gennemsnit ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter i a) og c), og middelværdier ± SD fra 3 uafhængige eksperimenter i B).

apoptotiske celler blev kvantificeret ved annexin-V-PE-farvning og flowcytometri. Med demethylering af meCpGs med 5-aza-dc behandling blev apoptotiske satser af UM-SCC47 og CaSki celler signifikant forøget (P = 0,026 og P = 0,001, henholdsvis). Desuden 5-aza-dc øget antallet af UM-SCC47 og CaSki celler standset i S-fasen (P = 0,048 og P = 0,003) og G2 /M-fase (P = 0,002 og P = 0,044, henholdsvis) (Fig 5). Derimod i SiHa-celler, som har en enkelt ikke-methyleret HPV-genomet, ingen signifikante ændringer i apoptose eller cellecyklusstandsning ved S og G2 /M-faser blev observeret (Fig 5).

A) Efter demethylering af CpG sites, antallet af apoptotiske celler signifikant forøget i UM-SCC47 og CaSki-celler, men ikke i SiHa-celler. B) Efter demethylering af bindingssteder for CpG, antallet af celler standset i både S og G2 /M-faser steg i UM-SCC47 og CaSki-celler, men ikke i SiHa-celler. Alle data er middel ± SEM fra 3 uafhængige forsøg.

Cell bioaktivitet ændringer efter demethylering behandling er forbundet med tabet af E6 og E7 udtryk

For at afgøre, om de bioaktivitet ændringer efter 5-aza-dc behandling var associeret med tabet af E6 og E7-ekspression forårsaget af demethylering, transficerede vi de 3 cellelinier med siRNA at vælte E6 og E7 (fig 4B). Efter 96 timer efter transfektion, blev væksten af ​​UM-SCC47, CaSki, og SiHa-celler inhiberes (P = 0,044, P = 0,006, og P = 0,022, henholdsvis) (Fig 4C); desuden apoptose (P = 0,026, P = 0,050, og P = 0,016, henholdsvis) og G2 /M-fase standsning (P = 0,027, P = 0,035, og P = 0,012, henholdsvis) blev fremkaldt (fig 6). Disse fund var i overensstemmelse med virkningerne på celler efter demethylering. Vores resultater antyder, at de betydelige bioaktivitet ændringer efter 5-aza-dc behandling kan induceres ved nedsat E6 og E7-ekspression forårsaget af meCpG demethylering. Imidlertid bør det bemærkes, at den dramatiske vækstinhibering efter transfektion foreslog E6 /E7 siRNA muligvis havde off-target effekter.

A) Antallet af apoptotiske celler steg ved 96 timer efter E6 og E7 knockdown i UM -SCC47, CaSki, og SiHa-celler. Cellerne blev anholdt i G2 /M fase B) UM-SCC47 og C) CaSki celler, og i begge G2 /M og S faser i D) SiHa celler. Alle data er middel ± SEM fra 3 uafhængige forsøg.

Forskellige methylering mønstre i HPV-positive OPSCC patienter

Vi indsamlede eksemplarer af 10 OPSCC patienter med HPV16 infektion til analyse af deres LCR mønstre for methylering (tabel 2). Den gennemsnitlige methylering sats i de 10 prøver var 9,5% for hele LCR region, 13,9% i 5′-LCR, 6,0% i E6 enhancer, og 9,5% i p97-promotoren (fig 2D). Mere end 70% af de CpG sites (111/150) var helt methyleret, mens 26,0% (39/150) heterogent blev methyleret (≥ 1 meCpG klon). Alle CpG kloner var umethyleret på nt7862, hvilket er i overensstemmelse med den klare hypometylering status i UM-SCC47 og CaSki celler. Men på de andre CpG sites, blev fundet mindst 1 meCpG klon.

Selvom stikprøvestørrelsen var relativt lille, vi udførte yderligere analyse og klassificeret de methylering profiler som hypermethylering og hypometylering. To patienter med tonsillar cancer (OPSCC-1 og OPSCC-10) havde en hypermethylering status (41,6% og 40,0%, henholdsvis) i p97-promotoren. Men i de andre patienter, blev opdaget kun sporadiske meCpG kloner eller alle umethylerede CpG-kloner, og den gennemsnitlige methylering sats var 4,1% (24/585). De tydelige methylering profiler i OPSCC patienter var meget lig de methylering typer i HPV-positive kræftceller. Derudover analyserede vi forholdet mellem methylering status og viral belastning (E6 kopier), og E2 /E6 sats [36]. Efter at have udelukket 2 tilfælde (OPSCC-5 og OPSCC-7) med outliers i scatter plot, blev frekvensen af ​​p97 promotor methylering positivt korreleret med E2 /E6 rate (r = 0,759, P = 0,029). Der blev imidlertid ikke signifikant sammenhæng fundet mellem methylering frekvensen af ​​p97-promotoren og viral belastning (P = 0,220).

Discussion

Tidligere undersøgelser af HPV16 LCR methylering var hovedsageligt baseret på cervikale celler og kliniske prøver. Efter rekombination med det cellulære genom, kan status for methylering af HPV16-genomet ændres, og afhængig af typen af ​​integration begivenhed og sandsynligvis virusbelastning [30]. I den foreliggende undersøgelse blev HPV16 LCR hypermethyleret i cervikale CaSki-celler med tandem integrerede HPV16-genomet (en type 2 integrant) og umethyleret i SiHa-celler med integration af individuelle HPV16 genomer (en type 1 integrant). Disse resultater var i overensstemmelse med resultaterne af tidligere undersøgelser [7,15,25,32]. Vi først identificeret HNSCC UM-SCC47 celler indeholdende et intakt E2-genet af HPV16-genomet og et hypermethyleret LCR som cervikale CaSki-celler, i hvilke HPV-genomer er integreret i det cellulære genom i tandemrækker [20]. Methylering af E2BSs i HPV16 LCR var korreleret med ekspressionen af ​​den onkogene E6 og E7, og demethylering af HPV16 LCR i UM-SCC47 celler undertrykt E6 og E7-ekspression, inhiberede proliferation, og i sidste ende forårsagede cellecyklusstandsning ved G2 /M. Vores resultater tyder på, at methylering inden HPV16 LCR også spiller en afgørende rolle i den virale livscyklus i HNSCC celler, der indeholder en type 2 integrant HPV 16 genom. Endvidere kan methylering også tolkes som en alternativ forsvarsmekanisme for at lukke munden viral replikation og transkription [40], som kan repræsentere en hidtil ukendt mekanisme, hvorved HPV-genomet er konverteret fra en produktiv infektiøst agens til et hidtil ukendt kræftfremkaldende.

Det er vist, at helt methylerede HPV16 genom transkriptionelt inaktive [41] og tidligere undersøgelser antydet, at tunge methylering der ikke er behov for LCR E2BSs at påvirke p97 promotor-aktivitet [27,42]. Undertrykkelse af promotoren kan gendanne de normale funktioner af p53 og pRb samt andre mål for E6 og E7 [43-45]. Desuden har genindførelse af E2 i association med enten E6 eller E7 under kontrol af et E2-uafhængig promotor blevet anvendt til at præcisere yderligere funktioner E6 og E7 i transformerede celler [43,45]. Vore data viste CpG sites i 5′-LCR og promotorregionen af ​​UM-SCC47 celler, herunder alle E2BSs blev methyleret fortrinsvis, og 5-aza-dc demethylering var mere effektivt for meCpGs i promotorregionen og E2BSs end andre CpG steder i HPV16 LCR i UM-SCC47 celler, hvilket tyder på, at disse vigtige steder og region kan være sårbare over for methylering i carcinogenese og demethylering. Imidlertid CpG ved nt7862, som er placeret i linker-regionen mellem enhanceren og promotoren, tendens, der skal hypomethylated i begge UM-SCC47 og CaSki-celler, såvel som OPSCC prøver, med lignende resultater også rapporteret tidligere [24,25, 29,30,33]. Dette antyder, at CpG stedet kan være involveret i den virale replikationsorigin og dens unmethylation status er ofte bibeholdes for at opretholde den virale livscyklus. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forklare dette fænomen.

Undersøgelser har vist, at HPV-positive HNSCCs har en bedre respons på strålebehandling og /eller kemoterapi end HPV-negative HNSCCs [46,47].