PLoS ONE: Novel Analog of Colchicin inducerer Selektiv Pro-død Autophagy og nekrose i humane cancerceller

Abstrakte

Colchicin, et naturligt produkt af

Colchicum autumnae

øjeblikket anvendes til gigt behandling, er en tubulin målrettet forbindelse, som hæmmer mikrotubuledannelse ved at målrette hurtigt delende celler. Denne tubulin-targeting har ledende forskere til at undersøge potentialet i colchicin og analoger som mulige behandlinger mod kræft. En stor undersøgelse udført på en analog af allocolchicine, ZD 6126, blev standset i fase 2 kliniske studier på grund af alvorlige hjerte-toksicitet i forbindelse med behandling. Denne undersøgelse indebærer udvikling og afprøvning af nye allocolchicine analoger, der holder ugiftige anti-cancer egenskaber. I øjeblikket har vi syntetiseret og vurderet de anti-cancer aktiviteter to analoger; N-acetyl-O-methylcolchinol (NSC 51046 eller NCME), som er strukturelt ligner ZD 6126, og (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1), som er en hidtil ukendt derivat af allocolchicine der er isomere i A-ringen. NSC 51046 viste sig at være ikke-selektiv, da den inducerede apoptose i både BxPC-3 og PANC-1 bugspytkirtelkræftceller og i normale humane fibroblaster. Interessant fandt vi, at Green 1 kunne beskedent inducere pro-død autofagi i disse bugspytkirtelkræftceller og E6-1 leukæmiceller, men ikke i normale humane fibroblaster. I modsætning colchicin og NSC 51046, er Green 1 ikke at påvirke tubulinpolymerisation angiver, at det har en anden molekylært mål. Green 1 også forårsaget øget reaktive ilt arter (ROS) produktion i mitokondrier isoleret fra bugspytkirtelkræftceller. Desuden

in vivo

undersøgelser viste, at Green 1 var veltolereret hos mus. Vores resultater antyder, at en lille ændring i strukturen af ​​colchicin tilsyneladende har ændret virkningsmekanismen og fører til forbedret selektivitet. Dette kan føre til bedre selektive behandlinger i kræftbehandling

Henvisning:. Larocque K, Ovadje P, Djurdjevic S, Mehdi M, Green J, Pandey S (2014) Novel Analog af Colchicin inducerer Selektiv Pro-død Autophagy og nekrose i humane cancerceller. PLoS ONE 9 (1): e87064. doi: 10,1371 /journal.pone.0087064

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: August 22, 2013; Accepteret: December 19, 2013; Udgivet: 23 januar 2014

Copyright: © 2014 Larocque et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. The Windsor og Essex County Cancer center Fondens Seeds4Hope Grant og NSERC Discovery Grant-programmet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Siyaram Pandey er en PLoS ONE redaktionelle bestyrelsesmedlem. Det betyder dog ikke ændre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

I Canada, anslås det, at 187 vil 600 personer blive diagnosticeret med kræft og 75, 500 mennesker vil dø af kræft i 2013 [1]. Af det store antal af forskellige typer af kræft, bugspytkirtelkræft er en af ​​de mest dødbringende, da det er meget aggressiv, resistente over for behandling, skrider hurtigt og har en mangel på klare symptomer; derfor er det forbundet med dårlig prognose og sen fase diagnose [2], [3]. Nuværende behandlinger til rådighed for kræft i bugspytkirtlen omfatter kirurgi, stråling, og flere kemoterapi, herunder 5-fluorouracil og gemcitabin [4]. Desværre, effektiviteten af ​​disse behandlingsmuligheder er ikke langtidsholdbare og de er forbundet med alvorlige bivirkninger, som følge af ikke-selektiv målretning af ikke-cancerceller [5]. Selv om der er gjort store fremskridt i mange cancertyper, pancreas kræfttilfælde og dødsfald er stadig i stigning [6]. Det er af stor betydning, at en selektiv, sikrere og ugiftige alternativ til de nuværende behandlingsmuligheder er udviklet til dem, der lider med kræft i bugspytkirtlen. Leukæmi er en anden dødelig form for kræft, der opstår, når blod stamceller i knoglemarven udvikler sig til unormale celler. Det anslås at blive diagnosticeret i 5.800 canadiere i 2013 og dræbte 2600. Selvom behandlingsmuligheder er tilgængelige, er der stadig behov for at udvikle en mere effektiv og mere sikkert alternativ.

Af særlig betydning for overlevelsen af ​​kræftceller er deres evne til at unddrage programmeret celledød (PCD). Specifikt cancerceller er i stand til at omgå apoptose, PCD type I, der er involveret i homeostatiske regulering og udvikling. Apoptose virker til at forhindre beskadigede og muterede celler fra prolifererende og akkumulere [7]. Autophagy, PCD type II, som er en katabolisk proces, der involverer nedbrydningen af ​​beskadigede cellulære komponenter, og kan også give energi i perioder med stress, har også været impliceret i overlevelsen af ​​cancerceller. Denne proces med nedbrydning beskadigede cellulære bestanddele giver cellerne med materialer, der kan anvendes til at generere energi, indtil stressor fjernes [8], [9]. På grund af denne proces har autofagi blevet anset for kun en pro-overlevelse mekanisme; nylig, dog har forskere fundet, at langvarig udsætning for stressfaktorer kan føre til langvarig autophagy og efterfølgende celledød [10], [11]. På grund af dette dobbelte formål, der er et spørgsmål om, hvorvidt det er mere fordelagtigt at hæmme eller inducere autofagi for at forårsage kræft celledød, og forskere er i øjeblikket udforske både veje. Endelig nekrose er en form for patologisk celledød, der forårsages af eksponering for infektion, toksiner, eller traumer [12], [13]. For nylig har det vist sig, at nekrose, ligesom apoptose, kan også programmeres, og dens induktion kan være en anden strategi i cancerterapi [14], [15]. Med forskning i celledød induktion, forskere i stigende grad fokuseret på at finde forbindelser og produkter, med kræft specifikke mål, der kan føre til induktion af celledød programmer i kræftceller selektivt, uden induktion af celledød i ikke-kræftceller, derved omgåelse nogle af toksiciteter forbundet med de nuværende behandlinger mod kræft.

Colchicin er et naturligt stof, der kan isoleres fra enten

høst-tidløs

(eng safran) eller

Gloriosa superba

( glory lilje), som begge tilhører liljefamilien [16]. Colchicin er ikke ukendt at den medicinske verden, som den er blevet anvendt i behandlingen af ​​gigt og er blevet undersøgt i mange andre tilstande, herunder familiær Mediterranean fever [17], cirrose [18] og Sweets syndrom [19]. For nylig er allocolchicines (derivater af colchicin) og andre analoger vist nogle spændende virkninger i cancerceller. Dette skyldes i høj grad allocolchicine evne til at standse mitose ved at hæmme tubulin polymerisering til mikrotubuli [16], hindrer udviklingen af ​​celler gennem hele cellecyklus og fører til induktion af apoptose. Denne inhibering af mikrotubulusdannelse er specielt nyttigt i cancer terapi, fordi kræftceller formerer sig hurtigt og ukontrolleret. En allocolchicine derivat, ZD 6126, som er et pro-drug af N-acetylcolchinol, havde nogle spændende resultater, som det var i stand til at forstyrre cytoskelettet af tumorendotelceller og forårsage apoptose (fig. 1) [20], [21]. ZD 6126 forårsagede tumorcelle nekrose i

in vivo

musemodeller for human lunge (Calu-6), kolorektal (LoVo og HT-29), prostata (PC-3), ovarie (SKOV-3), og bryst (MDA-MB-231) tumorer [22]. Desværre var dette forbindelse standset i kliniske fase 2-forsøg som et resultat af associerede cardio-toksicitet i mennesker [23]. Det er ikke overraskende, at dette derivat og andre derivater var toksiske fordi tubulin og mikrotubuli er afgørende for cellecyklus ikke kun i kræftceller, men også i ikke-cancerceller; Derfor er denne ikke-selektive mål er en af ​​grundene til, at ikke-cancerceller er modtagelige for apoptose induceret af tubulin målrettede midler, der fører til de observerede bivirkninger [24].

Her rapporterer vi anticanceraktivitet af syntetiske derivater af allocolchicine; N-acetyl-O-methylcolchinol (NSC 51046 eller NCME), som er strukturelt ligner ZD 6126, og (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1), som er en hidtil ukendt derivat af allocolchicine der er isomere i A-ringen (fig. 1). I denne undersøgelse, rapporterer vi den differentierede mekanismer to allocolchicine derivater mod leukæmi og bugspytkirtelkræftceller forårsaget af mindre ændringer af deres kemiske struktur. NSC 51046 klart inducerede ikke-selektiv apoptose i bugspytkirtelkræftceller (PANC-1 og BxPC-3) og ikke-kræft føtale fibroblaster (NFF), mens Green 1 forårsagede pro-død autofagi og nekrose selektivt i bugspytkirtelkræftceller (PANC-1 ) og akut T-celle leukæmi (E6-1 eller Jurkat), samtidig med at ringe effekt på ikke-kræft humane fibroblaster (NHF). Til forskel colchicin, ZD 6126 og NSC 51046, Green 1 ser ikke ud til at målrette tubulin og har en anden molekylært mål. Det er meget interessant, at en lille ændring i strukturen af ​​allocolchicine har ændret virkningsmekanismen og føre til forbedret cancer selektivitet. Disse fund kan føre til udvikling af bedre, mere selektive kemoterapeutika for kræftbehandling.

Materialer og Metoder

Cell Culture

De menneskelige kræftceller, der blev brugt i dette undersøgelsen var pancreas epitheloid carcinoma (PANC-1;. Cat No. CRL-1469), pancreas adenocarcinom (BxPC-3;. Cat No. CRL-1687) og akut T-celle leukæmi, klone E6-1 (Jurkat; TIB-152 ), som alle blev anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). De normale cellelinjer anvendt i denne undersøgelse var normale humane fibroblaster (NHF;. Cat No. AG09309) og normale føtale fibroblaster (NFF;. Cat No. AG0443), som begge blev købt fra Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ . PANC-1-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada) og 10 mg /ml gentamicin ( Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada). BxPC-3 og Jurkat-celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich, ON, Canada) suppleret med 10% FBS (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada) og 10 mg /ml gentamicin (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada). NHF og NFF celler blev dyrket i minimalt essentielt medium med Earles balancerede salte (MEM /EBSS), (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) suppleret med 15% FBS Ikke-essentielle aminosyrer (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada) og 10 mg /ml gentamicin (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada). Alle cellelinier blev dyrket og vedligeholdt i en Forma Scientific CO

2 inkubator udstyret med et HEPA-filter (Forma Scientific Inc., Marietta, Ohio) ved 37 ° C, 95% fugtighed og 5% CO

2

Cell Behandling

Allocolchicine derivater, N-acetyl-O-methylcolchinol (NSC 51046) og (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1) blev anvendt som de vigtigste forbindelser til denne undersøgelse [25]. Cellerne blev behandlet med stigende koncentrationer og varigheder af NSC 51046 og Green 1, rekonstitueret i dimethylsulfoxid (Me

2SO). Forud for behandling blev stock koncentrerede forbindelser yderligere fortyndet i phosphatbufret saltvand (PBS). Foruden allocolchicine derivater blev colchicin (Sigma-Aldrich, ON, Canada) anvendes til at sammenligne virkningerne af allocolchicine derivater til den allerede kendte mekanistisk effekt af colchicin. Paclitaxel (Sigma-Aldrich, ON, Canada) og Paraquat (PQ), (Sigma-Aldrich, ON, Canada) blev anvendt som positive kontroller i forskellige eksperimenter.

Vurdering af Virkning af Green 1 og NSC 51046

WST-1 assay.

For at måle cellelevedygtighed, WST-1 farvestof ([2- (4-iodphenol) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4- disulfophenyl) -2

H

-tetrazolium, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) blev anvendt. Dette farvestof er reduceret til formazan i nærværelse af metaboliske enzymer, som er tegn på aktiv metabolisk aktivitet i levedygtige celler. Mængden af ​​formazan kan måles gennem absorbans ved 450 nm. Samme antal celler blev podet i 96-brønds plader (PANC-1:4,000 celler /brønd; NHFs: 4.000 celler /brønd) med et samlet volumen på 100 pi. Efter fastgørelse blev cellerne behandlet med stigende koncentrationer af Green 1 eller NSC 51046. Ved det ønskede tidspunkt blev WST-1 farvestof tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Anvendelse af en Wallac Victor

3 ™ 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada), absorbansværdier blev målt ved 450 nm. Absorbansværdierne af de behandlede celler blev udtrykt som en procentdel af absorbansen valør af kontrol.

trypanblå eksklusion assay.

For at kvantificere procentdelen af ​​døde celler, trypanblåt celleimpermeabelt farvestof blev inkuberet med behandlede celler [26]. En 01:01 blanding af cellesuspension og trypanblåt (Sigma-Aldrich, ON, Canada) blev afpipetteret i et hæmacytometer (Hausser Scientific, Horsham, PA) og antallet af celler (døde celler farves blå og levedygtige celler forblev ufarvede) blev manuelt kvantificeret. Antallet af døde celler blev udtrykt som en procentdel af det totale antal celler. Resultater blev analyseret ved anvendelse af GraphPad Prism 6.0 og rapporteres som middelværdien ± SD af to uafhængige forsøg.

Hoechst Farvning

For at visualisere cellekernemorfologi og induktionen af ​​apoptose, Hoechst 33342 farvestof (Molecular prober blev Eugene, OR, USA) anvendt til at farve kerner. Efter behandling med enten grøn 1 eller NSC 51046 blev celler inkuberet med 10 pM af Hoechst 33342 farvestof i 10 minutter ved 37 ° C. Billeder blev opnået ved hjælp af en Leica DM IRB inverteret fluorescensmikroskop (Wetzlar, Tyskland) ved 400X forstørrelse.

Annexin V Binding Assay

For at afgøre, om NSC 51046 og colchicin var inducere apoptose, en annexin V binding assay blev anvendt. Efter behandling blev PANC-1-celler opsamlet, vasket i PBS og resuspenderet i 50 pi Annexin V-bindingsbuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI

2, pH 7,4). Celler blev derefter inkuberet med Annexin V AlexaFluor-488 konjugat (1:20) (Invitrogen, Canada), 10 pM Hoechst 33342 farvestof (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og 1 ug /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich, ON , Canada) i 15 minutter ved 37 ° C. Billeder blev taget ved 400X forstørrelse med anvendelse af Leica DMI6000 fluorescerende mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland)

MDC Assay

For at detektere autophagy, monodansylcadaverin (MDC;. Sigma-Aldrich, ON, Canada ) var brugt. MDC er indarbejdet i autophagic vakuoler, der producerer en punktformet plet, der kan observeres gennem fluorescens mikroskopi. Celler blev dyrket på dækglas, og efter inkubation natten over blev behandlet med varierende doser af Green 1. Efter behandling blev celler inkuberet med en slutkoncentration på 0,1 mM MDC (fortyndet i PBS) i 35 minutter ved 37 ° C. For yderligere bekræftelse af tabet af cellemembranens integritet og induktion af celledød blev celler modfarvet med cellemembranen uigennemtrængelig nuklear farvning, propidiumiodid ved 1 ug /ml (Sigma-Aldrich, ON, Canada) for at bekræfte induktionen af celledød. Billederne blev opnået ved hjælp af en Leica DM IRB inverteret fluorescensmikroskop (Wetzlar, Tyskland) ved 400X forstørrelse.

Cellular Lysate Forberedelse

Efter behandling med 5 pM Green 1 for forskellige tidsperioder blev celler opsamlet, vasket i PBS og inkuberet i 0,1% NP40-puffer (20 mM Tris-HCI, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) i 25 minutter på is (hvirvelbehandling hver 5 minutter, 15 sekunder). Prøven centrifugeres derefter ved 3000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten (indeholdende den lyserede cellemateriale) opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.

Western Blot

Proteinprøverne blev separeret under anvendelse af SDS-PAGE. Elektroforesebehandlede proteiner blev derefter overført til en nitrocellulosemembran og blokeret med 5% vægt /volumen mælk TBST (Tris-saltvand med Tween-20) -opløsning. Membranerne blev derefter probet med primære antistoffer i 2% vægt /volumen mælk TBST natten over ved 4 ° C i mikrotubulus-associeret protein1 lette kæde 3 (LC3) rejst i kanin (1:500) (Novus Biologicals, Cat. No. NB100- 2220, Littleton, CO, USA); β-Actin rejst i mus (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., katalog nr sc-81.178, CA, USA.); Beclin-1 rejst i kanin (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., katalog nr. Sc-11427, CA, USA). Efter inkubation blev membranerne vasket i TBST og inkuberet et anti-muse (1:2000) eller et anti-kanin (1:2000) peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Abcam, katalog nr ab6728 . Ab6802, Cambridge, MA , USA) i 2% vægt /volumen mælk TBST i 1 time ved stuetemperatur. Efter vaske i TBST, blev visualiseret med forøget kemiluminescens reagens (Sigma-Aldrich, ON, Canada) og densitometri blev udført ved hjælp af ImageJ software.

tubulinpolymerisation Assay

For at observere effekten af ​​allocolchicine derivater på tubulinpolymerisation, et tubulinpolymerisations assaykit (Cytoskeleton Inc. katalog nr. BK006P) anvendt. En plade med 96 brønde blev forvarmet ved 37 ° C i 30 minutter før start af analysen. Kontrolbrønde modtog generel tubulin puffer (80 mM PIPES pH 6,9, 2 mM MgC

2, 0,5 mM EGTA), og de andre brønde modtog generel tubulin puffer og enten Green 1, NSC 51046 eller colchicin (Sigma-Aldrich, ON, Canada). Alle brøndene (herunder kontrol) blev derefter inkuberet med 3 mg /ml tubulin i tubulinpolymerisation buffer (80 mM PIPES pH 6,9, 2 mM MgC

2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP og 10,2% glycerol). OD

340 blev målt hvert minut i en time. Polymerisations- kurver blev genereret under anvendelse af GraphPad Prism 6.0. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

mitokondrie Isolering og måling af reaktive oxygenarter (ROS) Produktion

Mitokondrier blev isoleret fra ubehandlede PANC-1-celler for at undersøge virkningen af ​​Green 1 på ROS produktion og muligheden for mitokondrier som mål for Green 1. Celler blev først vasket to gange i kold PBS, resuspenderet i hypotonisk puffer (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCI, 210 mM mannitol, 70 mM saccharose, 10 uM Leu- pep, 10 uM Pep-A, 100 pM PMSF), homogeniseret og derefter centrifugeret ved 3000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for at pelletere den nukleare fraktion. Supernatanten blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Den cytosoliske supernatant blev bortskaffet, og pelleten (indeholdende mitokondrier) blev resuspenderet i kold reaktionsbuffer og behandlet med 250 pM paraquat (PQ) som en positiv kontrol, 2,5 uM Grøn 1 eller 10 uM colchicin. Amplex Red (Molecular Probes, Eugene, OR), sammen med peberrodsperoxidase blev anvendt til måling mitokondrie ROS produktion. Mitokondrier, der blev isoleret som førnævnte blev resuspenderet i kold hypotonisk buffer og 20 ug protein blev tilsat til hver brønd i en sort 96-brønds uigennemsigtig plade. Fluorescens blev målt (Ex. 560 nm og Em. 590 nm) hver 5 minutter i 5 timer ved anvendelse af et spektrofluorometer (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Aflæsninger blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism 6.0 og udtrykt som relative fluorescensenheder (RFU) pr mikrogram protein og repræsentere data fra tre uafhængige forsøg.

In Vivo

Vurdering af (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Grøn 1)

Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med den canadiske Råd for Animal Care retningslinjer og godkendt af University of Windsor Animal Care Udvalg. Seks uger gamle mandlige CD-1 nu /nu mus blev opnået fra Charles River Laboratories og huset i konstante laboratoriebetingelser i en 12-timers lys /mørke cyklus, i overensstemmelse med de animalske protokoller skitseret i University of Windsor Research Ethics plade- AUPP #: 10-17. Efter akklimatisering blev musene adskilt i to hovedgrupper, én gruppe blev injiceret subkutant i højre og venstre bagben flanker med Me

2SO i PBS (10 pi i 200 pi PBS), mens den anden gruppe modtog subkutane injektioner af Green 1 (10 mg /kg /dag for en samlet volumen på 10 uL Green 1/200 uL PBS) tre gange om ugen i en periode på en måned. For at vurdere toksicitet, mens musene var i live, blev legemsvægte målt tre gange om ugen for varigheden af ​​undersøgelsen. Efter studietiden, blev dyrene aflivet og deres organer og væv (lever, nyrer og hjerte) blev opnået og opbevaret i 10% formaldehyd til immunhistokemisk og toksikologisk analyse

Hematoxylin Eosin (H (I) PANC-1 behandlet med NSC 51046 (Samspil mellem hver koncentration: **** p 0,0001; Kontrol versus kolonne faktor: **** p 0,0001); (Ii) NHF behandlet med NSC 51046 (Samspil mellem hver koncentration: **** p 0,0001; Kontrol versus kolonne faktor: **** p 0,0001); (Iii) PANC-1 behandlet med Green 1 (Samspil mellem hver koncentration: p = 0,9955; Kontrol versus kolonne faktor: **** p 0,0001); (Iv) NHF behandlet med Green 1 (Samspil mellem hver koncentration: p = 0,3642; Kontrol versus kolonne faktor: * p = 0,0370) (B) Efter behandling af humane akut T-celle leukæmi celler (Jurkat) med Green 1, en trypanblå eksklusive assay blev udført. Celler blev farvet med trypanblåt cellemembran uigennemtrængelig farvestof og antallet af trypanblåt-positive celler blev opnået ved anvendelse af et hæmocytometer. Resultater er udtrykt som procent af trypanblåt-positive celler, hvilket indikerer døde celler med ikke-intakte cellemembraner. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD fra to uafhængige forsøg.

Tydelige Modes af celledød induktion ved Allocolchicine Derivater

For at undersøge betydningen af ​​allocolchicine derivater på celledød induktion i kræftceller , kernerne af celler blev farvet med 10 pM Hoechst 33342 farvestof i 10 minutter efter behandling med enten grøn 1 eller NSC 51046 for enten 48 eller 96 timer. I de fremkomne billeder (fig. 3A), blev det observeret, at NSC 51046 behandling førte til kerner, som udviste apoptotisk morfologi, herunder celle blebbing, svind og kondenseret kerner til både kræft i bugspytkirtlen celletyper og de ikke-kræft normale føtale fibroblaster (NFFS) svarende til levedygtigheden data. Men kræft og ikke-kræft celler behandlet med Green 1 Vis ikke denne apoptotisk morfologi, hvilket tyder på, at Green 1 ikke inducere apoptose i bugspytkirtelkræftceller. Den apoptotiske induktion af NSC 51046 blev bekræftet under anvendelse af et Annexin V binding assay. Annexin V binder til af eksternt phosphatidylserin, som er en markør for tidlig apoptose [28]. I de fremkomne billeder (fig. 3B), blev det konstateret, at behandling med begge doser NSC 51046 fører til en udlægning af phosphatidylserin som vist med grønt fluorescerende farvning. Endvidere blev det også observeret, at behandling med colchicin induceret apoptotisk celledød da det førte til nuklear fragmentering, eksternalisering af phosphatidylserin og celledød. Manglen på apoptotisk morfologi og reduktionen i levedygtigheden af ​​bugspytkirtelkræftceller behandlet med Green 1 førte os til at undersøge andre former for celledød. Efter behandling blev cellerne derefter inkuberet med monodansylcadaverin (MDC) for at bestemme, om der var autophagic induktion. Vi observerede induktion af autophagy på 48 timer i alle cancerceller testet, kan sammenlignes med autophagic induktion af vores positiv kontrol for pro-overlevelse autofagi, Tamoxifen [10] (fig. 4A). Endvidere farvning med propidiumiodid (PI) afslørede, at i modsætning Tamoxifen, Green 1 behandlede cancerceller var positive for propidiumiodid og udviste en pro-død form af autofagi (fig. 4A). Denne aktivitet af Green 1 var specifik for cancerceller, som NHFs behandlet med Green 1 ikke farvet positive for tilstedeværelsen af ​​autophagic vakuoler med MDC eller nekrotisk celledød med PI, bekræfter selektiviteten af ​​Green 1 til cancerceller. For at bekræfte induktionen af ​​autofagi forårsaget af Green 1, Beclin-1 ekspression og LC3-I til LC3-II omdannelse blev vurderet ved Western blot-analyser i Panc-1-celler behandlet med 5,0 uM Green 1 for forskellige tidsintervaller (fig. 4B). β-actin blev målt som en intern loading kontrol. Densitometri blev udført, og prøver behandlet i 3 og 6 timer blev sammenlignet med det tidlige kontrol, medens prøven behandlet i 48 timer blev sammenlignet med 48-timers kontrol. De resulterende grafer viser, at Green 1 behandling forårsagede en stigning i Beclin-1-niveauer på alle tidspunkter efter behandling. LC3-II niveauer blev moderat forøget på 6 timer efter behandling med Green 1.

Efter behandling med enten grøn 1 (A) bugspytkirtelkræftceller (BxPC-3 og Panc-1) og normal menneskelig og føtale fibroblaster ( NHFs og NFFS) blev inkuberet med Hoechst 33342 farvestof til karakterisering cellekernemorfologi og detektere induktion af apoptose. Flotte farvede, kondenserede kerner ledsaget af apoptotiske legemer er tegn på apoptose. (B) PANC-1-celler blev inkuberet med Annexin V farvestof at verificere apoptotisk induktion forårsaget af NSC 51046. Celler blev modfarvet med Hoechst 33342 farvestof og propidiumiodid (PI) til at visualisere cellekernemorfologi og celledød. Billeder viste er repræsentative for to uafhængige forsøg på 48 timer efter behandling med NSC 51046 og colchicin.

(A) bugspytkirtelkræftceller, humane leukæmiceller (Jurkat) og NHFs blev inkuberet med monodansylcadaverin (MDC) at bejdse autophagic vakuoler og propidiumiodid (PI) for celledød at afgøre, om autophagic induktion førte til celledød. Bright, punktformet farvning indikerer autophagy, som det ses i vores positive kontrol (Tamoxifen behandlede celler). Billeder blev taget ved 400X forstørrelse på et fluorescerende mikroskop. (B) Western blot-analyser af Beclin-1 ekspression og LC3 konvertering blev udført på Panc-1-celler behandlet med 5,0 pM Green 1 på forskellige tidspunkter. β-actin blev målt som en intern kontrol. Prøver behandlet i 3 og 6 timer blev sammenlignet med det tidlige kontrol, medens prøven behandlet i 48 timer blev sammenlignet med 48-timers kontrol. Resultater udtrykkes som middel ± SD fra to uafhængige forsøg for begge Western blots.

intracellulære mål af Green 1

Colchicin og visse derivater er kendt for at inducere apoptose i cancerceller ved at hæmme tubulin-polymerisation og fører til DNA-beskadigelse, der virker som et signal for initiering af processen af ​​apoptose [29]. Som vi observere forskellige virkninger af Green 1 og NSC 51046 i celledød induktion, vi ønskede for yderligere at undersøge de potentielle intracellulære mål af Green 1, i forhold til NSC 51046 og colchicin. Navnlig blev virkningerne af colchicin og dets derivater på tubulinpolymerisation evalueret. Grøn 1, blev NSC 51046 eller colchicin inkuberet med tubulin oprenset fra porcint hjerne. OD

340 blev målt hvert minut i en time, og den resulterende graf er vist i figur 5A. Vores resultater viser, at NSC 51046 inducerede lille tubulin inhibering ved den lavere dosis, hvilket svarer til tidligere undersøgelser [31], [32]; dog observerede vi, at en højere dosis af NSC 51046 forårsagede hurtig tubulinpolymerisation, som var uventet. Som forventet, colchicin inhiberede tubulinpolymerisation. Behandling med Green 1 ved højere doser førte til en svag stigning i tubulinpolymerisation, mens den nederste Green 1 dosen forblev relativt tæt med kontrolprøven (fig. 5A). Dette bekræfter, at Green 1 og NSC 51046 har distinkte biokemiske mekanismer, som NSC 51046 mål tubulinpolymerisation i langt højere grad end Green 1. Disse resultater antyder, at en simpel ændring i strukturerne af disse allocolchicine analoger har ført til meget forskellige biologiske aktiviteter i normale og cancerøse celler.

(a) Colchicin derivater (grøn 1 og NSC 51046) blev inkuberet med porcint tubulin i en time i en 96-brønds plade. Absorbansen (OD

340 nm) blev opnået hvert minut under én times inkubation. Colchicin blev anvendt til sammenligning med de derivater. (B) isoleret mitochondrier fra PANC-1-celler blev behandlet med Green 1 og ROS-produktion blev målt under anvendelse Amplex Red substrat i nærvær af peberrodsperoxidase (HRP). Resultater blev sammenlignet med kontrol ubehandlede mitokondrier, colchicin behandlede mitokondrier og positiv kontrol, paraquat (PQ). Fluorescensaflæsninger blev taget i 5 minutters intervaller i 4 timer ved Ex. 560 nm og Em.590 nm og udtrykt som relative fluorescensenheder (RFU).