PLoS ONE: Sammenligning af Genetiske og Epigenetisk Ændringer af primære tumorer og matches Plasma Prøver i patienter med kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Selv om de seneste fremskridt inden for cirkulerende DNA-analyse tillader forudsigelse af tumor genomer ved invasive midler, nogle udfordringer, som begrænser udbredelsen af ​​cfDNA i kræftdiagnostik. Vi analyserede status af de to bedste kendetegnet kolorektal cancer (CRC) genetiske og epigenetiske ændringer i en kohorte af CRC patienter, og derefter sammenlignet i hvilken grad de to mønstre flytter fra væv til plasma for at forbedre vores forståelse af biologien modulere overensstemmelse mellem væv og plasma methylering og mutation profiler.

Metoder

plasma og tumorvæv blev indsamlet fra 85 patienter (69 ± 14 år, 56 mænd).

KRAS

SEPT9

status blev vurderet ved allel ildfast mutation systemet kvantitativ PCR og kvantitativ methylering-specifikke PCR hhv. Seks af de mest almindelige punktmutationer i codon 12 og 13 blev undersøgt for

KRAS

analyse.

Resultater

KRAS

mutationer og

SEPT9

promotor methylering var til stede i 34% (29/85) og i 82% (70/85) af primære tumorer vævsprøver. Både genetiske og epigenetiske analyser af cfDNA afslørede en høj samlet konkordans og specificitet sammenlignet med tumor-væv analyser. Patienter med både genetiske og epigenetiske ændringer i vævsprøver (31,8%, 27/85) blev anset for yderligere analyser. De mediane methylering satser i tumorvæv og plasmaprøver var 64,5% (12,2-99,8%) og 14,5% (0-45,5%), hhv. Medianen

KRAS

mutation belastning (for matchede mutationer) var 33,6% (1,8-86,3%) i væv og 2,9% (0-17,3) i plasmaprøver. Plasmaet /væv (p /t) forhold på

SEPT9

methylering var signifikant højere end p /t-forhold på

KRAS

mutation belastning, især i fase cancere tidlige (p = 0,0108) .

Konklusion

resultaterne af denne undersøgelse viser en afvigende hastighed på epigenetiske vs. genetiske ændringer flytter fra væv til plasma. Mange faktorer kan påvirke mutation cfDNA analyse, herunder både tilstedeværelsen af ​​tumor klonal heterogenitet og streng opdeling af

KRAS

mutation profil. Den foreliggende undersøgelse fremhæver betydningen af ​​at overveje karakteren af ​​ændringen ved analyse tumor-afledt cfDNA

Henvisning:. Danese E, Minicozzi AM, Benati M, Montagnana M, Paviati E, Salvagno GL, et al. (2015) Sammenligning af Genetiske og Epigenetisk Ændringer af primære tumorer og matches Plasma Prøver i patienter med kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (5): e0126417. doi: 10,1371 /journal.pone.0126417

Academic Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Modtaget: Februar 11, 2015; Accepteret: April 1, 2015; Udgivet: 6. maj 2015

Copyright: © 2015 Danese et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bevis, der kan detekteres tumorspecifikke genetiske og epigenetiske ændringer i cirkulerende DNA ekstraheret fra plasma fra cancerpatienter har vist sig lovende til at forbedre tidlig diagnose, prognosticering og overvågning sygdom. Det overordnede mål med at udnytte celle fri DNA som biomarkør indebærer lægepraksis optimering, personaliseret medicin udvikling og livskvalitet forbedres på grund af den minimale invasiv af blod test. Men autentificering af faktiske kliniske gyldighed forskellige celle-frit DNA (cfDNA) ændringer som formodede kræft biomarkører i klinisk praksis er fortsat udfordrende [1]. Den førende Spørgsmålet er i dag repræsenteret ved den omstændighed, at cirkulerende DNA fragmenter, som bærer tumor specifikke ændringer udgøre en variabel og generelt lille del af den samlede cirkulerende DNA, hvorved der genereres en høj variabilitet i konkordansen på mellem alteration mønstre detekteres i væv af primære tumorer og tilsvarende plasma.

faktorer, der påvirker kvantitative såvel som kvalitative ændringer i cfDNA med hensyn til væv af kræftpatienter er mange og endnu ikke fuldt udforsket hidtil. Imidlertid har indsatsen i det sidste årti har ført til vigtige fremskridt.

Ved at evaluere methylering mønster af

PCDH10

gen i væv og plasma af patienter med kolorektal cancer (CRC) har vi for nylig demonstreret at methylering sats påvist i plasma øges med øget methylering sats i tumorvæv kun i den tidlige fase kræftformer, mens denne sammenhæng tilsyneladende gik tabt i fremskredne kræftformer. Desuden viste vi, at graden af ​​cfDNA methylering var associeret med nogle karakteristika af cfDNA, såsom dens koncentration og integritet, og at disse korrelationer varierede i styrke og retning parallelt med tumor stadium [2].

i de sidste to år viste to uafhængige forskergrupper, at muligheden for at detektere tumorspecifikt cfDNA i plasma fra CRC patienter vid udstrækning afhænger af følsomheden af ​​PCR-metode til korte muterede sekvenser [3-5], hvilket understreger vigtigheden af ​​at minimere analysen længde, når man analyserer meget fragmenteret cfDNA, såsom i fastsættelsen af ​​kræftpatienter.

intratumoral heterogenitet og klonal evolution under progression er yderligere spørgsmål komplicerer brugen af ​​cfDNA som flydende biopsi for kræft, da begge faktorer generere bemærkelsesværdige forskelle i andelen og mønster af afvigelser påviselige i primær tumor og cirkulerende DNA [6,7].

Ifølge denne beviser, forskellige tekniske og biologiske aspekter bør overvejes, når man analyserer den variable overensstemmelse mellem væv og plasma ændringer hos kræftpatienter, ikke mindst karakteren af ​​de underliggende ændringer.

Både epigenetiske og genetiske ændringer er velkendte aberrationer involveret i kolorektal carcinogenese. På grund af deres enorme potentiale som biomarkører i CRC diagnose, iscenesættelse, prognose og respons på behandling, er de blevet grundigt undersøgt i det sidste årti. Men en kritisk sammenligning af deres status i væv og cfDNA mangler. Derfor blev denne undersøgelse havde til formål at analysere status for de to bedste karakteriserede genetiske og epigenetiske ændringer af CRC (dvs.

KRAS

mutation og

SEPT9

promotor methylering) i en kohorte af CRC patienter, med henblik på at forbedre vores forståelse af de biologiske aspekter modulerer overensstemmelse mellem væv og plasma methylering og mutation profiler. Derefter sammenlignede vi også, i hvilken grad den genetiske og epigenetiske mønstre flytter fra væv til plasma.

Materiale og metoder

Patienter og prøver

Undersøgelsen kohorte omfattede 85 konsekutive patienter, der gennemgår operation for CRC på University Hospital i Verona (Italien) mellem januar 2010 og december 2010. Blodprøver blev udtaget før kirurgisk resektion. Tumorprøver blev opnået under kirurgi, straks frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Histologisk diagnose og tumor fase blev vurderet i henhold til 2000 World Health Organization (WHO) systemet klassificeringen for tumorer i fordøjelsessystemet og det fælles udvalg amerikanske on Cancer (AJCC) iscenesættelse systemet henholdsvis [8]. Kun patienter med primære colorektale adenokarcinomer ubehandlede med neoadjuverende radio-kemoterapi blev inkluderet i undersøgelsen. Alle emner gav et skriftligt samtykke til at blive indskrevet i denne undersøgelse. Undersøgelsen blev godkendt af den lokale etiske komité (Department of Life og Reproduktion Sciences, University of Verona) og udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen af ​​1975. Klinisk oplysninger blev indhentet fra medicinske journaler.

DNA isolation fra plasma og vævsprøver Salg

Blodprøver blev opsamlet i 7 ml EDTA-rør og behandlet inden for 1 time efter indsamlingen. Efter dobbelt centrifugering (800g i 10 min centrifugering, efterfulgt af separation og en anden 1600 g i 10 min centrifugering), blev plasma separeret, opbevaret i portioner og frosset ved -80 ° C indtil bearbejdning. DNA blev ekstraheret fra plasma og friske frosne vævssnit ved hjælp af QIAamp DNA Blood midi kit og Gentra Purgene Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), henholdsvis.

cfDNA koncentration og Integritet indeks

cfDNA fragmentering blev vurderet ved at beregne DNA integritet indekset som tidligere beskrevet [2]. I korte træk blev det bestemt ved at beregne forholdet mellem større (247 bp) versus kortere (115 bp) mål af konsensussekvensen af ​​humane ALU gentager. ALU-qPCR resultatet opnået med ALU115 primere blev også anvendt til at kvantificere totale DNA.

Methylering specifik PCR (MSP)

Oprenset genomisk DNA ekstraheret fra væv og plasma blev underkastet bisulfitbehandling og DNA oprensning ved hjælp af Epitect Bisulfite (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. En detaljeret protokol er tidligere blevet rapporteret andetsteds [2].

Bisulfite-modificeret DNA blev brugt som skabelon for Real-Time PCR ved hjælp af en Sybr grøn-baserede kvantitativ MFP. Primere til MSP blev designet til specifikt at amplificere enten et bisulfit-følsom, ikke-methyleret streng eller et bisulfit-resistente, methyleret Strand på

SEPT9

genpromotorregion. Den web-baserede software MethPrimer (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) blev anvendt til at vælge en bestemt CpG ø, som for nylig blev fundet som den mest sårbare over for methylering ændringer i adenom-carcinom sekvens [9] .

sekvenserne af primer sæt var som følger:

M-Fo: TTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAAC

M-Rev: AAAATCCTCTCCAACACGTCCG

U Fo: TAGTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATG

U Re: CAAAATCCTCTCCAACACATCCAC (M: methylerede, U: methylerede).

CpGenome Universal methyleret DNA (Chemicon, Millipore Billerica, MA, USA) blev anvendt som 100% methylerede (positiv ) kontrol, hvorimod DNA ekstraheret fra perifere blod-mononukleære celler fra normale individer blev anvendt som ikke-methyleret (negativ) kontrol

PCR-reaktionsblandingen blev fremstillet i et slutvolumen på 20 pi, der består af følgende koncentrationer:. 0,375 uM fremad og reverse primere, 250 pM af hver dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1 × HotStart Buffer (Qiagen), 2,5 mM MgCl2, 1,5 enheder HotStart polymerase (Qiagen), 2 uM SYTO 9 (Invitrogen, Life teknologier, Carlsbad, CA), og 1 × ROX henvisning farvestof (Invitrogen), 3 pi af bisulfit-modificeret DNA.

PCR-amplifikation blev udført med precycling varmeaktivering af DNA-polymerase ved 95 ° C i 10 min efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 sek, annealing ved 64 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek. En ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems-Foster City, CA, USA) blev anvendt.

PCR-produktet blev kørt på 2% agarosegel for at bekræfte produktets størrelse og specificitet PCR, og derefter visualiseret under UV-lys. Et band på 110 bp blev betragtet som diagnostisk af methylering status, mens et bånd på 114 bp blev betragtet som diagnostisk af unmethylation status.

KRAS mutation analyse

DNA ekstraheret fra vævs- og plasmaprøver blev udsat for en allel ildfast mutation systemet qPCR (ARMS-qPCR) til påvisning af seks af de mest almindelige mutationer i codon 12 og 13 i

KRAS

gen (G12A, G12D, G12V, G12S, G12C, og G13A ). DNA blev amplificeret i en reaktionsblanding 25 pi indeholdende 0,25 uM af hver amplifikationsprimer, 200 uM af hver dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1 × HotStart Buffer (Qiagen, Hilden, Tyskland), 2 mM MgCl

2, 2 enheder HotStart polymerase (Qiagen, Hilden, Tyskland), 2 uM SYTO 9 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), 1 × ROX henvisning farvestof (Invitrogen) og 25 ng DNA. Primersekvenserne er tidligere blevet beskrevet andetsteds [10], med undtagelse af den fælles revers primer, som er blevet re-designet for at afkorte de amplikoner af både kodon 12 (90 bp) og kodon 13 (85 bp) (oprindeligt af 149 og 144 bp i længde). Den resulterende sekvens var som følger:. TGTTGGATCATATTCGTCCACA

PCR-amplifikation blev udført med precycling varmeaktivering af DNA-polymerase ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 sek, annealing ved 64 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek, i en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems-Foster City, CA, USA). PCR-produktet af muterede prøver blev kørt på 2% agarosegel for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​de specifikke bånd.

Kvantitativ analyse og analytiske ydeevne

Threshold cyklusser (CT) blev anvendt til at beregne methylering sats og mutation belastning i hver prøve, i henhold til følgende formel:% = 100 /[1 + 2 {Ct

mødte /mut-Ct

udækket /WT}] [2,11]. Ctmet og Ctunmet betegne tærskel cyklusser specifikke for methylerede og umethylerede stater, mens Mut og WT henviser til muterede og vildtype alleler, hhv. Proportionerne (%) for methylering sats eller mutation belastning påvist i plasma sammenlignet med dem detekteret i væv blev udtrykt som plasma /væv-forhold (P /T-forhold).

Medianen af ​​mindst to gentagne målinger blev beregnet for hver prøve, og derefter bruges til statistisk analyse. kriterier foruddefineret kvalitet blev indstillet, således at målinger med Ct-værdier større end 38 cyklusser blev udelukket.

Da det er blevet observeret, at følsomheden af ​​cfDNA assays kan forøges ved at forkorte størrelsen af ​​amplikoner [5,6] , primere for begge analyser blev designet til at tillade amplifikation af produkter mindre end 120 bp. Intra-assay unøjagtighed for methylering test var 9%. Den nedre grænse for detektion af methyleret DNA for MSP-assays (vurderet ved hjælp serielle fortyndinger af Universal Methyleret DNA) var 1,5%.

Intra-assay unøjagtighed for

KRAS

analyser varierede mellem 2% og 8%, afhængigt af typen af ​​mutation. Cellelinje-DNA blandinger indeholdende mutationen af ​​interesse i en normal DNA baggrund blev anvendt til at evaluere detektionsgrænsen og amplificeret med samme instrument løber at fungere som positive kontroller. Den analytiske sensitivitet ARMS-qPCR var under 2%, som tidligere rapporteret [12].

Statistisk analyse

Normalitet fordeling blev kontrolleret med Shapiro-Wilk test og kontinuerlige variabler blev rapporteret som median (interval) eller gennemsnit ± SD, når det er hensigtsmæssigt. Statistiske analyser og plotning af data blev udført under anvendelse af GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Den diagnostiske ydeevne cfDNA analyse blev sammenlignet med tumor-væv analyse (den nuværende guldstandarden) for sin sensitivitet og specificitet at skelne mellem muterede /hypermethyleret og ikke-muteret /ikke-denatureret individer. De prædiktive positive og negative prædiktive værdier blev også beregnet med Fishers eksakte test. Satsen for overensstemmelse mellem væv og plasma-profiler blev bestemt med aftale test (og værdier præsenteret som vægtet kappa (k) ± standardafvigelse). Forskelle mellem kontinuerlige variabler blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney U test. Korrelationer blev testet med Spearman korrelation. Værdier af p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Fifty seks af 85 patienter oprindeligt evalueret for deres potentielle inddragelse i undersøgelsen var mænd, de resterende kvinder (gennemsnitsalder 69 ± 14 år. ). Fordelingen tumor etape var som følger: 15 patienter var på trin I (17,6%), 35 på trin II (41%), 24 på trin III (28,2%), og de resterende 11 på trin IV (12,9%). Tyve ni ud af 85 tumor- vævsprøver (34%) var positive for en af ​​de seks

KRAS

mutationer, vi har testet. Af disse viste 22 tumorvæv matchede mutationer i plasmaprøver. Samlet set viste cfDNA analyse 89,4% (76/85) konkordans for

KRAS

detektion med tumor-væv analyse (k = 0,753 ± 0,077, p 0,0001). Der var ni uoverensstemmende resultater blandt de 85 undersøgte prøver. Fem resultater viste en WT genotype for

KRAS

-tested mutationer ved cfDNA analyse, mens tumor-væv analyse viste en

KRAS

G13D mutation (n = 2), en

KRAS

G12D mutation (n = 2) eller en

KRAS

G12V mutation (n = 1). To patienter (både på trin II) viste en

KRAS

G12S og en G12A mutation af plasma-analyse, men blev bestemt som WT ved tumor-væv test. Endelig to patienter (begge med fremskreden metastatisk CRC) udstillet umatchede mutationer mellem væv og plasma.

SEPT9

promotor methylering var til stede i 82,3% (70/85) af primær tumor vævsprøver . Analysen viste 86% (73/85) af overensstemmelse med cfDNA analyse (k = 0,630 ± 0,092, p 0,0001). Uoverensstemmende resultater kun vedrørte patienter med afvigende methylering af

SEPT9

i vævsprøver og umethylerede plasmaprøver (n = 12).

Fordelingen af ​​positive og negative prøver i væv og plasma er vist i tabel 1, sammen med den analytiske ydeevne cfDNA analyser.

Efter udelukkelsen af ​​to patienter med forskellige

KRAS

genotype i væv og plasma, de 27 patienter (81,5% mænd) viser både genetiske og epigenetiske ændringer i vævsprøver (31,8%, 27/85) blev anset for yderligere kvantitative analyser. Hos disse patienter var graden af ​​overensstemmelse mellem væv og plasma 93% (25/27) for den epigenetiske ændringer og 81% (22/27) til

KRAS

mutation analyse (dvs. to cfDNA prøver var negative for methylering af

SEPT9

og fem var negative for forekomst af

KRAS

mutationer). Blandt de forskellige KRAS mutationer, som vi har testet, var den G12V substitutionen mest repræsenteret (n = 11), efterfulgt af G12D (n = 7) og G13D (n = 7). Endelig en prøve udstillede G12A mutationen, mens G12S blev fundet i en anden. Samlet set blev 74% og 26% af mutation sites placeret i codon 12 og 13, henholdsvis.

Den mediane

SEPT9

methylering satser i tumorvæv og plasmaprøver var 64,5% (12,2-99,9 %) og 14,5% (0-45,5%), henholdsvis. Medianen

KRAS

mutation belastning var 33,6% (1,8-86,3%) i væv og 2,9% (0-17,3%) i plasmaprøver. Kvantitative data for både genetiske og epigenetiske ændringer efter forskellige kliniske patologiske karakteristika er sammenfattet i tabel 2. Ingen signifikante associationer blev fundet med køn, primær tumor og differentiering status i både tumorvæv og plasmaprøver. Med hensyn til klassificering patologisk stadium, medianen methylering på

SEPT9

var signifikant højere i avanceret stadier kræft væv end i fase væv tidlige. En statistisk signifikant korrelation blev fundet mellem væv og plasma

SEPT9

methylering rate (r = 0,407, p = 0,035), mens fandtes ingen sammenhæng mellem væv og plasma

KRAS

mutation belastning (r = 0,092, p = 0,651).

Yderligere analyser blev udført på p /t-forhold på

KRAS

mutation belastning og

SEPT9

methylering sats, for at identificere potentielle forskelle mellem genetiske og epigenetiske grad af overgangen fra væv til plasma. Den p /t-forhold på

SEPT9

methylering var signifikant højere end p /t-forhold på

KRAS

mutation belastning (24,2% vs. 7,9%, p = 0,0228), begge parametre, der viser en bredt spektrum af værdier (interval fra 0 til 72,9% for

SEPT9

p /t-forholdet og 0-62,6% for

KRAS

p /t-forhold). Dette fund var næsten udelukkende tilskrives den store forskel mellem genetiske og epigenetiske p /t nøgletal påviselige i fase kræftformer tidligt (p = 0,0108), da forskellen i fremskredne stadie kræft ikke længere var signifikant (p = 0,6806) (figur 1). Koncentrationen af ​​cfDNA i tidlige stadier CRC patienter (median 30,6 ng /ml, 4,6 til 66,8) var lavere end i fase patienter fremskredne (80,2 ng /mL, 31,0 til 195,0; p = 0,0001). Den cfDNA viste sig også at være mere fragmenteret (integritet index: 0,36, 0.0.7-0.85 vs 0,63, 0,33 til 0,95; p = 0,0163). Ingen signifikante associationer blev fundet mellem cfDNA parametre og genetiske eller epigenetiske ændringer, bortset fra en svag sammenhæng mellem cfDNA integritet indeks og

KRAS

mutation belastning i fremskredne kræftformer (r = 0,572, p = 0,040).

diskussion

Selv om brugen af ​​cfDNA som potentiel surrogat for kræft genom er blevet oprindeligt foreslået mere end 30 år siden [13], og den rolle, flydende biopsi er blevet evalueret for sin prædiktive og prognostiske værdi i en række indstillinger med lovende resultater, har cfDNA-baserede kræft tests ikke udviklet til klinisk brug hidtil.

den høje grad af fragmentering kombineret med koncentrationen lavt blod gør cfDNA en udfordrende analyt under en teknisk perspektiv. Desuden er de stadig usikre kinetik for tumor-relaterede cfDNA frigivelse i blodbanen, og de genetiske ændringer sammensætningen under progression både bidrage til at gøre cfDNA en “svær at læse” analyt, selv under et biologisk perspektiv.

Resultaterne af vores undersøgelse, bortset bekræfter, at flydende biopsi forudsiger ændringer i tumorvæv, er i overensstemmelse med den hypotese, at der kan være nogle forskelle blandt den hastighed, hvormed genetiske og epigenetiske ændringer flytte fra væv til plasma.

for at gøre resultater mindre sårbare over for teknisk interferens og gør genetiske og epigenetiske data pålidelige og direkte sammenlignelige, vedtog vi en række metodiske udveje tilpasset fra de seneste udgivelser. Først blev analyse udført i plasma, da denne biologiske matrix repræsenterer en bedre kilde til cfDNA end serum [1, 6]. Derefter anvendte vi relativt korte amplikoner for begge bestemmelser, og dette skyldtes det faktum, at længden af ​​fragmentet kan påvirke følsomheden af ​​detektion mutation og methylering [5, 14, 15]. Vi har også sikret en høj grad af følsomhed af epigenetiske assay ved at målrette en specifik CpG ø, som for nylig har vist sig at vise den højeste modtagelighed for methylering ændringer i adenom-carcinom-sekvensen [9]. Endelig, i henhold til American Society of Clinical Oncology og National Comprehensive Cancer Network (NCCN), der er opnået en høj grad af opdagelse sats for

KRAS

mutation analyse ved at målrette hotspots i codon 12 og 13, som er kendt at udgøre ca. 95% af alle mutationer [16].

i den foreliggende undersøgelse, en methylering specifik qPCR og en ARMS-qPCR baserede metoder blev anvendt til

SEPT9

methylering og

KRAS

mutation analyser, hhv. På grund af vigtige teknologiske fremskridt, nye metoder såsom digital PCR [17], Inteplex qPCR [14] straalende teknologi [18], MethyLight kvantitativ eller MethyLight digital PCR [19] og nye dybe sekvenser tilgange [20] er nu tilgængelige, således at absolut kvantificering af mutant eller methylerede alleler ved meget lave frekvenser, og med lavere unøjagtighed end dem rapporteret her. Men de assays, vi anvendt i denne undersøgelse, er mere udbredt i kliniske laboratorier, og er også karakteriseret ved en optimal følsomhed, at kunne detektere mindst 2% ændring i en normal baggrund [21]. Endnu vigtigere, den analytiske ydeevne af genetiske og epigenetiske analyser var meget ens med hensyn til følsomhed og præcision, således at direkte sammenligning af data fra forskellige ændringer.

Den første del af undersøgelsen, foretaget på hele kohorten 85 CRC patienter, bekræftede væsentligt tidligere beviser for, at en analyse af

KRAS

SEPT9

i plasma kan ses som et pålideligt alternativ til vævet. Status for

KRAS

er generelt bruges som prædiktiv markør for respons på etablerede epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) hæmmere på grund af det faktum, at mutant

KRAS

er associeret med resistens over for anti-EGFR monoklonalt antistof immunterapi med midler, såsom centuximab eller panitumumab [22,23]. Omvendt afvigende methylering i promotorregionen af ​​

SEPT9

gen er blevet overbevisende foreslået som sensitiv og specifik biomarkør til tidlig ikke-invasiv diagnose af CRC [24].

Ved at følge de forslag nylig foreslået af Wasserkort og medforfattere [9], og dermed rettet mod en specifik CpG ø på promotoren for

SEPT9

gen, fandt vi et meget højt antal hypermetylated væv prøver (82%), i højere grad end tidligere rapporteret i litteraturen (sædvanligvis i området mellem 78 og 81%) [25]. De opnåede i matchede plasmaprøver Resultaterne viste høje globale konkordans (86%) og specificitet (100%) i forhold til tumor-væv analyse. I den samme prøve, en

KRAS

mutation blev påvist i 34% af patienterne i overensstemmelse med data fra andre grupper af ikke-valgte CRC patienter [10,26]. Den tilsvarende analyse af plasmaprøver viste også en høj grad af overensstemmelse (89,4%) og specificitet (93%) sammenlignet med vævet. De fleste af de undersøgelser, der sammenligner resultaterne fra en cfDNA assay med tumor-væv analyse rapporteret en meget lavere diagnostisk ydeevne, med værdier for specificitet konstant lavere end 80% [27-29]. Som en undtagelse, rapporterede kun to nylige undersøgelser værdier af specificitet på mellem 95,3% [30] og 98% [14].

I den anden del af undersøgelsen analyserede vi hastigheden af ​​overensstemmelse mellem væv og plasma mutation belastning og methylering sats, og resultaterne opnået med de to assays blev derefter sammenlignet. I undergruppen af ​​27 patienter huser væv genetiske og epigenetiske ændringer,

KRAS

mutation belastning varierede fra 1,8% til 86,3% (næsten 48 gange), hvilket viser en højere interindividuel heterogenitet end

SEPT9

methylering sats, som varierede fra 12,2% til 99,9% (dvs. ca. 8 gange). I overgangen fra væv til plasma, fem prøver blev WT for mutationen status og to blev ikke længere hypermethyleret. Graden af ​​methylering flytter fra væv til plasma var næsten 3 gange højere end satsen for mutation belastning som følge af sammenligning af de to p /t-forhold (24,2% vs. 7,9% for p /t-forhold på

SEPT9

methylering sats og

KRAS

mutation belastning, henholdsvis). Efter aftale med de seneste rapporter, kan dette resultat forklares ved intratumoral heterogenitet af den primære tumor, som fortrinsvis svækker genetisk snarere end epigenetisk analyse [7, 31]. Men da den konstaterede forskel mellem de to p /t-forhold er udelukkende henføres til data opnået i fase kræft tidligt mens klonal evolution normalt opstår, når metastaser udvikler, tumor klonalitet vil kun delvis forklare vores resultater [32].

i

KRAS

analyse, sammenlignelige værdier af mutation belastning blev opnået mellem tidlige og fremskredne kræftformer i både væv (26,9% vs. 34,7%) og plasmaprøver (1,9% vs. 4%), således at p /t analyse viste ikke signifikant forskel i henhold til tumor etaper (8,6% versus 7,3%). Omvendt blev en statistisk signifikant forskel fundet for

SEPT9

methylering analyse mellem p /t-forholdet i tidlige og fremskredne kræftformer (33,8% vs. 19,0%, p = 0,0108). Denne varians var udelukkende kan tilskrives en uoverensstemmelse i methylering sats påvist i væv (57,2% vs. 80,8%, p = 0,0009), da der ingen forskelle blev fundet i plasmaprøver (15,8% vs. 12,9% for tidligt vs fremskredne stadier). Således overgang af DNA huser epigenetiske ændringer i cirkulationen i fase kræft tidligt er tilsyneladende mere konsekvent end overgangen af ​​DNA huser en

KRAS

mutation. Ifølge med de seneste data fra litteraturen, kan dette bevismateriale fortolkes som følge af forskelle i væv typer involvering tidligere observeret for CRC genetiske og epigenetiske signaturer [33]. Især mens

SEPT9

afvigende methylering stammer epitelceller og derefter hurtigt overført til stromaceller [9],

KRAS

mutationer nærede af epitelial rum deles ikke af stromale celler [ ,,,0],34]. Derfor den molekylære cross-talk mellem tumor epitel og stroma forekommer for

SEPT9

epigenetiske ændringer kan lette overgangen for afvigende DNA fra primær tumor til kredsløbet.

Desuden samlede lavere grad af mutation belastning i forhold til methylering sats detekteret i CRC væv (26,9% vs. 57,2% i fase kræftformer tidligt) kan have bidraget til at forbedre udvandingseffekt af vild type-

KRAS

DNA i kredsløbet .

som konklusion, at resultaterne af den foreliggende undersøgelse bekræfter, at cfDNA analyse er en egnet strategi for omfattende analyse af tumor genetiske og epigenetiske profiler, selv ved brug af rutinemæssige metoder. Vigtigst, vi forudsat første tegn på, at den kurs, som tumor afledt cfDNA kan påvises i kredsløbet ikke kun afhænger af følsomheden af ​​anvendte metoder og kompleksitet frigivelseskinetikken, men også af arten af ​​den enkelte ændring. I en tid præget af stigende brug af omfattende genekspression undersøgelser af solide tumorer at belyse kompleksiteten af ​​tumorvæv og heterogenitet celle fænotyper, vores undersøgelse understreger behovet for bedre at karakterisere kræft-specifikke genetiske og epigenetiske signaturer efter forskellige tumor rum, så at betydningen og klinisk værdi cfDNA vurdering kan i sidste ende forbedres.

Yderligere bekræftende undersøgelser kan støtte hypotesen allerede foreslået af nogle forfattere, hvorefter analyse af cfDNA repræsenterer et værdifuldt alternativ til væv analyse, men kan også blive det første valg for både genetiske og epigenetiske tumor karakterisering ved at give et bedre samlet portræt af maligne sygdomme [5, 14, 29, 30].