PLoS ONE: klinisk-patologisk betydning og prognostiske værdi af Lactatdehydrogenase Et udtryk i Gastric kræftpatienter

Abstrakt

Introduktion

LDH-A, det enzym, der er ansvarlig for at omdanne pyruvat til laktat, har vist sig at være opreguleret i mange typer af kræft og give anledning til mere aggressiv adfærd ved at regulere proliferation og anti-apoptose. Imidlertid har sit udtryk i gastrisk cancer (GC) ikke blevet karakteriseret grundigt. Formålet med denne undersøgelse var at afklare udtryk og potentielle konsekvenser af LDH-A i GC.

Metoder

Vi undersøgte LDH-A udtryk ved immunhistokemi på GC væv microarray (TMA) og bruge Western blot af friske GC væv og cellelinier. Prognostisk værdi og korrelation med andre clinicopathologic faktorer blev evalueret. Vi transficerede siRNA ind GC celler mod LDH-A. LDH-A blev analyseret ved Western blotting og real-time RT-PCR. Cellevækst blev evalueret in vitro og in vivo. Lactat og ATP-produktion af celler blev bestemt.

Resultater Salg

Der var signifikant højere LDH-A ekspression i carcinom end i ikke-neoplastiske mucosa (NNM). Der var en positiv korrelation af LDH-A ekspression med alderen, histologisk type og lymfeknude-metastaser. Survival analyse viste, at høj ekspression af LDH-A i GC var forbundet med lavere samlet overlevelse (OS). Når stratificeret af Lauren kvalitet og histologisk klassifikation, betydning dukkede op i diffus type og udifferentieret typen GC. I multivariat analyse, LDH-A ekspression i GC var en uafhængig prognostisk risikofaktor for OS (hazard ratio = 1,829, 95% CI 1,375-2,433, P 0,0001). Specifikke siRNA mod LDH-A i GC cellelinie retarderet cellevækst både in vitro og i musemodeller. LDH-A knockdown også reduceret laktat og ATP produktion i GC celler.

Konklusioner

Vores undersøgelse viste, at onkogene rolle LDH-A i GC. LDH-A udtryk er en uafhængig prognostisk risikofaktor i GC patienterne og opreguleret udtryk for LDH-A kunne være prædiktiv for dårlige resultater i diffus type og udifferentieret typen GC. Vores resultater antydede, at LDH-A kan være en potentiel terapeutisk mål i mavekræft

Henvisning:. Sun X, Sun Z, Zhu Z, Guan H, Zhang J, Zhang Y, et al. (2014) klinisk-patologisk betydning og prognostiske værdi af Lactatdehydrogenase Et udtryk i Gastric kræftpatienter. PLoS ONE 9 (3): e91068. doi: 10,1371 /journal.pone.0091068

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: August 12, 2013; Accepteret: 7 februar 2014; Udgivet: 7 marts 2014

Copyright: © 2014 Sun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra forskningsprojekter i Liaoning-provinsen Videnskab og Teknologi Institut (nr 2007225017, No. 2009225011-2 og nr 2011415052) og videnskabelige og teknologiske projekter i Shenyang (nr F11-264-1-19). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de metaboliske egenskaber af kræftceller afviger væsentligt fra de normale celler, som kræftceller fortrinsvis udnytte glykolyse i stedet for mitokondrie oxidativ fosforylering selv ved tilstedeværelse af ilt; dette fænomen er kendt som Warburg virkning [1], [2], [3]. Den overraskende høje optage glucose og lactat produktion i tumorer i nærvær af oxygen førte Warburg at spekulere, at afvigende metabolisme kunne være årsag til mange cancertyper [2]. Men fordelen ved den metaboliske transformation bibringer cancerceller, forbliver uklar [4], [5]. For nylig har opdagelsen af ​​forbindelsen mellem onkogener og metaboliske processer ført til en genopblussen af ​​interesse i Warburg arbejde. Der er stigende tegn indikerer, at tilpasning af aerob glykolyse ved cancerceller kunne lette kræft spredning [5]. Cancer metabolisme har været under omfattende udforskning i håbet om at finde nye effektive behandlinger for cancer.

LDH-A, er et afgørende enzym, der spiller en vigtig rolle i sluttrinet af Warburg effekten ved at omdanne pyruvat til lactat . I forskellige typer af humane cancere, blev ekspressionen af ​​LDH-A opreguleret [6], [7]. I esophageal pladecellecarcinom, LDH-A var opreguleret i cancervæv og fremmet overlevelsen af ​​tumorceller [8]. Endvidere blev LDH-A rapporteret at forøge væksten og migration af gastriske cancerceller [9]. Men udtrykket status og funktion af LDH-A i gastrisk cancer (GC) stadig ukendt.

I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​LDH-A i en stor kohorte af GC prøver og korreleres dens udtryk med kliniske patologiske parametre og samlet overlevelse (OS). Vores resultater viser, at ekspressionen af ​​LDH-A var opreguleret i de kliniske gastrisk cancer prøver, og proteinekspression blev korreleret til alder og histologisk klassificering. Desuden fandt vi, at høj LDH-A ekspression blev forbundet med dårligere prognose i GC patienter. Tilsammen vores undersøgelse afslørede onkogene funktion af LDH-A i mavekræft og foreslog LDH-A som en ny potentiel prognostisk faktor og et potentielt terapeutisk mål.

Materialer og metoder

Patienter

den foreliggende undersøgelse omfattede 264 patienter med GC, der fulgte helbredende kirurgi fra januar 2006 til maj 2007 på First tilknyttede hospital i Kina Medical University. Gruppen bestod af 194 mænd og 70 kvinder med en gennemsnitsalder på 59 (spændvidde, 29-81) år. Ingen af ​​patienterne undergik kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Opfølgning oplysninger var blevet indsamlet fra alle patienter.

Etik Statement

Etisk godkendelse til denne forskning blev opnået fra Research Ethics Committee of China Medical University, Kina. Alle patienter, der leverer tumorvæv samt normale gastrisk vævsprøver underskrevet en samtykkeerklæring før kirurgisk fjernelse af gastrisk karcinom at give mulighed for denne forskning, der skal gennemføres. Alle procedurer undersøgelsens dyret var i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev udført i overensstemmelse med de institutionelle etiske retningslinjer. Disse forsøgsdyr blev købt fra Shanghai Branch Center, Institut for Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Science (også kendt som Shanghai CAS, certifikat nummer: SCXK [Hu] 2003-0003). Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr, og protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg i Kina Medical University, Shenyang, Kina. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

vævsprøver og Patologi

Alle patient-afledte paraffin indlejret mavekræft prøver (n = 264) og deres tilpassede NNM prøver (2 cm væk fra karcinom n = 209) blev indsamlet fra kirurgisk resektion og arkiveret under protokoller godkendt af Institutional Review Boards i Første tilknyttet Hospital China Medical University. Frisk gastrisk karcinom og tilstødende NNM blev opsamlet og nedfrosset i -80 ° C indtil proteinekstraktion ved homogenisering i RIPA-lysepuffer. Den histologiske diagnose og andre mikroskopiske egenskaber blev bekræftet af patologer og TNM mellemstationer for hver gastrisk karcinom blev evalueret i henhold til systemet for omfanget af tumor spredning Union International Contre le Cancer (UICC). Histologisk arkitektur af gastrisk karcinom blev udtrykt i Laurens klassificering og World Health Organization (WHO) klassifikation. Desuden blev tumorstørrelse, dybde af invasion, og lymfe bestemt.

cellelinjer og Kultur

menneskelige mavekræft cellelinier MKN28 (godt differentieret), AGS, SGC-7901 (moderat differentieret ), MGC803 (dårligt differentieret) og humant normalt gastrisk cellelinie GES-1 indkøbt fra cellen bank kinesiske videnskabsakademi. Fem cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640 (Hyclone, Logan by, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Alle cellelinjer var i et CO 5%

2 befugtet atmosfære ved 37 ° C.

Tissue Microarray (TMA) og Immunhistokemi

Repræsentative områder af solide tumorer og tilstødende NNM blev identificeret i HE-farvede sektioner af de udvalgte sager og en 1,5-mm-diameter væv kerne pr donorblok blev udstanset og overført til en modtager blok med et maksimum på 200 (10 × 20) kerner ved hjælp af en dorn diameter instrument 1,5 mm. Efter re-smeltet, blev snit (4 um tykke) fortløbende skåret fra hver væv microarray blok, farvning HE blev udført på TMA for bekræftelse af tumor og slimhinde væv. Immunhistokemisk analyse blev udført på TMA sektioner blev Trykkoger medieret antigen-genvinding udført i citratbuffer (pH 6,0) i 10 min. Snit blev inkuberet med 1:300 fortynding af LDH-A (muskel-underenhed) Kanin-monoklonalt antistof (epitomics) natten over ved 4 ° C, og derefter inkuberet med gede-anti-muse eller anti-kanin Envision System Plus-HRP (Dako Cytomation) for 30 minutter ved stuetemperatur. Efter skylning tre gange i PBS i 10 min hver, blev sektionerne inkuberet med DAB i 1 minut, modfarvet med hematoxylin mayer, dehydreret, klaret og monteret. Udeladelse af det primære antistof blev anvendt som en negativ kontrol.

Western blot-analyse

Proteiner koncentrationer af prøver ekstraheret fra vævsprøver og cellelinjer under anvendelse radioimmunaktivitet nedbør assay lysisbuffer blev bestemt ved anvendelse Bradford reagens ( Sigma) ifølge producentens instruktioner. Denatureret protein blev separeret på en natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamid gel (10% acrylamid) og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Bedford, MA), som derefter blev blokeret i 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (pH 7,5). For immunoblotting blev membranen inkuberet natten over med LDH-A (muskel-underenhed) Kanin-monoklonalt antistof (1:1500) (epitomics) ved 4 ° C. Derefter blev den skyllet med TBST og inkuberet med sekundære antistoffer i 15 minutter. Signaler blev påvist ved forøget kemiluminescens (Pierce, Rockford, IL).

Opfølgning efter kirurgi

De 264 patienter, som gennemgik gastroctomy blev udsat for at lukke klinisk observation, herunder bryst /abdominal /bækken computertomografi tomografisk (CT) scanning, CEA-niveau, og blodprøver på 2 til 3 måneders mellemrum og en årlig gastroskopi. Opfølgning var i overensstemmelse med National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Practice Guidelines i mavekræft. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som intervallet fra den indledende kirurgi til døden. Datoen ende af opfølgende undersøgelse til udførelse af analysen var 29 juni 2012.

Evaluering af immunhistokemisk farvning

Immunreaktivitet blev evalueret uafhængigt af to forskere, der var blindet for patient resultat. Evalueringen blev baseret på farvningsintensitet. Farvning intensitet for LDH-A blev scoret som 0 (negativ); 1 (svag); 2 (moderat); og 3 (stærk). Prøverne blev inddelt i to grupper efter deres resultater: 0 og 1 er lave udtryk gruppe; 2 og 3 er høj ekspression gruppe. I tilfælde af en uoverensstemmelse i scoring blev objektglassene fornyet overvejelse af begge patologer under et mikroskop.

Generation of Small forstyrrende (si) RNA Knockdown stabile cellelinier

På baggrund af LDH -A-sekvens, blev shRNA designet ved hjælp siRNA Target Finder (Ambion): nucleotidsekvensen af ​​det indsatte ShLDH-A var 5′-ATCCAGTGGATATCTTGACCTACG TGGCT-3 ‘. Cellelinien genereres ved at inficere celler med krypterede plasmid blev anvendt som kontrol. 10 ug shRNA og 25 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev blandet sammen med 1350 pi RPMI-1640 medium (uden FBS), og derefter blev blandingen blev transficeret i MGC-803 gastriske cancerceller. Blandingen blev tilsat i en 25 cm

2 dyrkningskolbe, som tidligere er belagt med 1 × 10

6 MGC-803 gastriske cancerceller. Dyrkningsmediet blev erstattet med komplet RPMI-1640 medium 6 timer efter inokulering og ved 28 timer efter transfektion blev stabile cellekloner udvælges i 2 uger med neomycin og analyseret ved immunblotting.

RNA-ekstraktion og kvantitativ reel-tid RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af TRIzol-reagens ifølge instruktionerne fra fabrikanten (Invitrogen), og 1 ug RNA blev behandlet direkte til cDNA under anvendelse af en revers transkription-kit (Promega, Madison, Wisconsin), ifølge producentens instruktioner. Amplifikationsreaktioner blev udført i en 20-pi volumen med 0,2 pi SYBR Green (Bio-Rad, Hercules, Californien). Disse reaktioner blev udført tredobbelt under anvendelse af en BioRad iCycler (Bio-Rad). p-actin blev anvendt som en intern kontrol. De anvendte primere var som følger: LDH-A, 5′-CTCCTGTGCAAAATGGCAAC-3 ‘(fremad) og 5′-CCTAGAGCTCACTAGTCACAG-5′ (revers); andβ-Actin, 5’-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 ‘(fremad) og 5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’ (revers). Specificiteten af ​​real-time kvantitativ PCR blev verificeret ved smeltekurveanalyse og agarosegelelektroforese.

MTT og kolonidannelse Assay

I cellevækst analyse, et lige antal celler blev podet i 48 Tja plader. Det samlede antal celler blev målt hver dag ved MTT-assayet ifølge producentens protokol (Roche Applied Science). For kolonidannelse analyse blev lige mange kontrolceller og celler lyddæmpningssystemer ekspressionen af ​​LDH-A podet i 60 mm dyrkningsskål i tre eksemplarer. Celler blev dyrket i 7 dage, Cellevækst blev standset efter 7 dage i kultur ved at fjerne mediet og tilsætte 0,5% krystalviolet opløsning i 20% methanol. Efter farvning i 5 min blev de fikserede celler vaskes med phosphatbufret saltvand (PBS), fotograferet, og opløst med 1% SDS. Antallet af kolonier i hver gruppe blev talt.

Tumorigenicitet Assay

MGC-803 GC celler xenografter blev produceret på 6 uger gammel kvinde athymiske nøgne mus (Vital River Laboratories, Beijing, Kina) ved injektion af 5 x 10

6 celler i 0,2 ml PBS i flanken på hver mus (6 mus /gruppe). Tumordannelse blev bedømt hver uge. Tumor volumen blev beregnet efter formlen:. V (mm

3) = a × b

2/2 (hvor a er den største overfladisk diameter og b er den mindste overfladisk diameter)

Måling af lactat Koncentration og ATP Produktion

Efter 48 timers inkubation, laktat, og ATP-niveauer i dyrkningsmedier blev målt ved hjælp af kommercielt tilgængelige assay kits (købt fra BioVision [Mountain View, Californien], og Roche Applied Science , henholdsvis). Resultater blev korrigeret for den endelige celletal nummer.

Statistical Analysis

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Samlet overlevelsesrater blev bestemt ved hjælp af Kaplan-Meier estimator, en begivenhed er defineret som død for kræft-relateret årsag. Af log-rank testen blev anvendt til at identificere forskelle mellem overlevelseskurver. I univariat analyse, tosidede χ

2 test eller to-halet t-test blev anvendt til statistiske sammenligninger. Og Cox ‘proportionale-hazard model blev brugt i univariate analyse og multivariat analyse, at identificere væsentlige faktorer korreleret med prognose. For alle analyser, kun p-værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

LDH-A Expression i Human Gastric Cancer Tissue

Vi sorterede farvede sektioner af TMA’er af GC og NNM vævskerner for deres cytoplasmatiske immunhistokemisk farvning intensitet mod LDH-A protein. De læsbare prøver omfattede 264 gastrisk karcinom og 209 matchede NNM. Den typiske diffus cytoplasmatisk farvning af proteinet kan findes i mange gastrisk carcinom og normale gastriske væv, som vist i figur 1, viste kræftvæv positive cytoplasmatisk farvning for 201 tilfælde (76,14%), mens der blandt 209 tilfælde af NNM, 131 tilfælde ( 62.68%) havde LDH-A positiv ekspression (tabel 1). For at undersøge ekspressionen mængde LDH-A i GC-prøver blev ekspressionen af ​​LDH-A undersøges ved Western blot-analyse i syv tilfældigt valgte tumorer og de parrede normale væv. blev observeret opregulering af LDH-A i GC-prøver sammenlignet med de parrede normale væv (Fig. 2A). Disse undersøgelser indikerede, at LDH-A signifikant blev opreguleret i kræft prøver sammenlignet med tilstødende ikke-kræft væv (tabel 1. p = 0,002)

LDH-A blev udtrykt i cytoplasmaet i NNM og carcinomer: a. LDH -A positivitet blev observeret i cytoplasmaet i NNM blev b LDH-a detekteres i cytoplasmaet af differentieret gastrisk karcinom, c og i dårligt differentierede gastrisk karcinom.

a proteinet niveau af LDH -A i gastrisk cancer prøver og parrede normale væv blev analyseret. b Ekspression af LDH-A i 4 gastriske cancercellelinier og GES-1 blev bestemt. Den LDH-A udtryk i GC cellelinjer MGC803 og AGS blev opreguleret i forhold til GES-1. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol.

Expression Analyse af LDH-A i Gastric cellelinier

Western blotting analyse blev udført i gastrisk cellelinjer. Den Western blot viste, at ekspressionen af ​​LDH-A var signifikant stærk i dårligt differentieret MGC803 og moderat differentieret AGS; svag i moderat differentieret SGC-7901 og godt differentierede MKN28; og fraværende i humant normalt gastrisk cellelinie GES-1 (fig. 2 b).

klinisk-patologisk variabler i 264 Tilfælde af gastrisk karcinom

Som opsummeret i tabel 2, Vi fandt, at øget ekspression af LDH-A var signifikant associeret med patienternes alder (P = 0,004) og histologisk type (P = 0,02), lymfeknudemetastase (P = 0,043), men ikke med køn (P = 0,072), tumorstørrelse (P = 0,086) , dybde invasion (P = 0,328), lymfatisk invasion (P = 0,738), lauren bedømmelse (P = 0,152) eller TNM stadie (P = 0,417).

Survival Analysis

det 5-års OS på de 264 patienter med primær gastrisk kræft var 46% (122/264), med 142 dødsfald observeret i follow-up perioden. Median opfølgning var 50 måneder (interval, 9-78 måneder). Survival analyse af Kaplan-Meier overlevelse kurve og log-rank test viste, at patienter med høj ekspression af LDH-A i tumorvæv havde en betydeligt værre samlet overlevelse end patienter med tumor lavt LDH-A udtryk (P 0,001;. Figur 3) . Med det formål at undersøge potentialet forhold mellem ekspressionen af ​​LDH-A og prognosen i forskellige typer af GC, vurderede vi overlevelsen af ​​patienter i forskellige undergrupper: Når statistisk analyse blev udført stratificeret af Lauren kvalitet og histologisk klassifikation, betydning dukkede op i diffus typen GC og udifferentieret typen GC (P 0,001, henholdsvis), men ikke i intestinal (P = 0,179) eller differentierede (P = 0,104) dem. Multivariat analyse blev udført under anvendelse af Cox proportional hazard model for alle de væsentlige variable i univariate analyse. Tabel 3 viser betydningen: Korrigeret for andre kovariater, resultaterne fra den multivariate analyse viste, at LDH-A ekspression (P 0,001), lymfatisk invasion (P = 0,046) og Lauren bedømmelse (P = 0,001), TNM stadie (P = 0,006), men ikke alder (P = 0,053), tumorstørrelse (P = 0,111), dybde invasion (P = 0,598), lymfeknudemetastase (P = 0,089), eller histologisk type (P = 0,674), var uafhængige prognostisk risikofaktorer for OS (tabel 3). Salg

Kaplan-Meier-kurver for kumulativ overlevelsesraten for patienter med GC ifølge GC væv LDH-a ekspression (a), Kaplan-Meier-kurver for kumulativ overlevelsesraten for patienter med tarm-typen GC (b) og diffus type GC (c) stratificeret af Lauren kvalitet, og Kaplan-Meier-kurver for differentieret typen GC (d) og udifferentieret typen GC (e) stratificeret efter histologisk type.

Knockdown af LDH-A ved siRNA Reducerer Angivelse af LDH-A i MGC-803

Ifølge Western blot resultater og real-time RT-PCR, udtrykket af LDH -A faldt effektivt i LDH-A-siRNA udtrykkende MGC-803 celler. Som vist i figur 4, ekspression af LDH-A protein analyseret ved western blot var næppe detekterbar, og PKM2 mRNA-niveauet blev reduceret med 74% i LDH-A-siRNA udtrykkende MGC-803 celler. LDH-A ekspression forblev uændret i begge GC-cellelinjer og de cellelinier, der udtrykker en kontrol siRNA.

I LDH-A-siRNA udtrykkende celler, ekspression af LDH-A protein analyseret ved western blot var næppe detekterbar ( en); blev påvist betydelige nedregulering af LDH-A på mRNA niveau efter siLDH-A-infektion (b).

Knockdown af LDH-A hæmmede væksten af ​​GC cellelinjer MGC-803

For at vurdere tumorcellevækst, vi brugte MTT og kolonidannelse analyser. I MTT-assayet, silencing ekspressionen af ​​LDH-A inhiberede proliferationen af ​​MGC-803 celler (fig. 5a, b). Væksten af ​​MGC-803 celler, der udtrykker LDH-A siRNA faldt med 64%, efter 168 timers inkubation sammenlignet med den for kontrolcellerne (P 0,05). Konsekvent, silencing ekspressionen af ​​LDH-A dæmpede forankringsuafhængig vækst af MGC-803-celler (fig. 5c, d). LDH-A knockdown i disse celler forhindrede kolonidannelse, hvilket indikerer, forankringsafhængige vækst blev genoprettet. Disse resultater antydede yderligere den onkogene rolle LDH-A i GC cancer.

Væksten af ​​celler, der udtrykker siRNA blev nedsat med 64%, efter 168 timers inkubation sammenlignet med den for kontrolcellerne i MTT-assayet (a og b, P 0,05). Silencing ekspressionen af ​​LDH-A svækkede kolonidannelse af MGC-803-celler (c og d). In vivo tumorigen evne MGC-803 cellelinje blev reduceret betydeligt ved siRNA knockdown af LDH-A (e og f, p 0,05).

Knockdown af IdhA inhiberede tumorgenicitet for xenograft musemodeller

i denne undersøgelse undersøgte vi tumorigene kapacitet LDH-A in vivo. Tumorigeniciteten in vivo af MGC-803 siLDH-A-celler og kontrolceller blev vurderet ved sc injektion af celler i athymiske nøgne mus. I overensstemmelse med in vitro-undersøgelser, dæmpende udtryk for LDH-A dramatisk svækket tumorigeniciteten af ​​LDH-A-celler i tumor størrelse. For alle matchede xenotransplantater, siLDH-A tumorer var betydeligt mindre end for kontrollerne (fig. 5e, f).

Knockdown af LDH-A af siRNA Reducerer laktat og ATP Produktion i Human GC cellelinier MGC- 803

Da LDH-A er nøglen enzym til at omdanne pyruvat til laktat, bør ændring af dets ekspression i GC celler påvirker laktat produktion og energiomsætning. For at teste denne hypotese, vi sammenlignet laktat og ATP produktion mellem LDH-A siRNA knockdown celler og kontrol celler efter en 48-timers inkubation. Når LDH-A blev slået af siRNA, evnen af ​​cellen producere lactat og ATP blev dramatisk reduceret med 61,5% og 63,3% efter 48 timer, (fig. 6a, b).

Efter 48 timers inkubation, LDH-a knockdown ført til væsentligt reduceret laktat (a) og ATP produktion (b) i MGC-803 celler (p 0,05).

diskussion

i 1920’erne, Warburg først vist, at kræftceller tage op højere glukose end normale celler og producere energi næsten ved aerob glykolyse for deres energi krav om at tilpasse miljøkrav såsom intermitterende hypoxi [10], [11]. Men denne metaboliske forandringer er ikke blot en tilpasning til et hypoxisk miljø, men er en aktiv cellulær strategi, der giver en betydelig fordel for spredning og malignitet. Nu Vegran

et al

. [12] har rapporteret, at laktat direkte kan modulere fænotype af endotelceller, potentielt udgør en vigtig mekanisme, hvormed tumorer kontrollere deres egen blodforsyning via vaskulær morfogenese. Fordi reaktive oxygenarter (ROS) er naturlige biprodukter af mitokondriel respiration, er det blevet foreslået, at omdannelsen af ​​glucose til lactat kunne beskytte cancerceller fra oxidativ stress [13]. For nylig resultater antyder, at genindsætte normal oxidativ phosphorylering i cancerceller, ikke kun inhiberer cellevækst og proliferation men også forringe den metastatiske kapacitet af maligne celler [14]. Derfor er betydningen af ​​konstitutivt opreguleret aerobe glycolyse nylig blevet anerkendt i tumorudvikling, men de molekylære mekanismer, der fører til denne fænotype og deres bidrag til udvikling af cancer er ikke godt forstået.

LDH-A, enzymet ansvarlig for at omdanne pyruvat til lactat, spiller en vigtig rolle i processen med glycolyse. Adskillige undersøgelser har rapporteret, at ekspressionen af ​​LDH-A kunne induceres af flere onkogener [15]. Disse rapporter støtter idéen om, at LDH-A induktion er kritisk for den onkogene aktivitet af disse onkogener i cancerceller.

onkogen aktivitet af LDH-A er blevet rapporteret i esophageal carcinoma, pancreascancer og gastrisk cancer celler [ ,,,0],8], [9], [16]. Yongjie Zhang

et al

. rapporterede, at LDH-En reduktion kan undertrykke tumorigeniciteten af ​​intestinal-type gastrisk cancer (ITGC) celler ved nedregulering Oct4 [17]. Og Zhiyu Wang

et al

. rapporterede, at LDH-A nedregulering undertrykker brystcancer tumorigenicitet gennem induktion af oxidativt stress medieret mitokondriel pathway apoptose [18]. Her undersøgte vi formalin-fikseret, paraffinindstøbt tumorvæv fra 264 patienter til ekspression af LDH-A og rapporterede karakteriseringen af ​​LDH-A udtryk i menneskelig GC, og fremlægge sin korrelation med klinisk-patologiske parametre og patienternes prognose. Først fandt vi, at ekspressionen af ​​LDH-A blev forhøjet i GC-prøver sammenlignet med de matchede normale væv. Dette resultat kan være i overensstemmelse med tidligere undersøgelse, at i forskellige typer af humane kræftformer, blev ekspressionen af ​​LDH-A opreguleret [4], [5]. I tumorvæv, viste vores undersøgelse, at LDH-A udtryk var stærkt korreleret med GC clinicopathologic karakteristika: alder, lymfeknude metastaser og histologisk klassifikation. Så vi foreslår, at opreguleret LDH-A udtryk kan bidrage til spredning og udvikling af GCS. For det andet, vi analyseret yderligere den prognostiske rolle LDH-A på den samlede overlevelse af patienter med GC. Kaplan-Meier-analyse viste en signifikant sammenhæng mellem LDH-A ekspression og samlet overlevelse af patienter, og patienter med stærkere LDH-A-farvning havde en lavere overlevelsesrate. Når statistisk analyse blev udført stratificeret af Lauren kvalitet og histologisk klassifikation, betydning dukkede op i diffus typen GC og udifferentieret typen GC, men ikke i tarm eller differentierede dem. Specifikke siRNA mod LDH-A blev udført i MGC803 celler og retarderede cellevækst både in vitro og i musemodeller. LDH-A knockdown også reduceret laktat og ATP-produktion i GC-celler. Derfor er vores resultater tyder på, at ekspressionen af ​​LDH-A var en uafhængig prognostisk faktor OS, og anført, at LDH-A kan have en onkogen rolle i tumor udvikling, især i diffus form GC eller udifferentierede typen GC-patienter. I overensstemmelse med vores undersøgelse er det blevet rapporteret, at vælte ekspressionen af ​​LDH-A i humane hepatocellulære carcinomceller kunne inducere apoptose [8], og nedregulering af LDH-A kunne øge produktionen af ​​ROS og cytosoliske Ca2 + signalering, som faldt den indre mitokondrielle membran potentiale og førte til frigivelse af cytochrom C i levercellecancer celler.

samlet set vores undersøgelse tyder på, at opreguleret udtryk for LDH-A giver gastriske kræftceller med vækst fordele. Samtidig, vores undersøgelse tyder LDH-A som et potentielt terapeutisk mål.