PLoS ONE: Molekylær karakterisering af en Intakt p53 Pathway Undertype i High-Grade serøs kræft i æggestokkene

Abstrakt

High-grade serøs kræft i æggestokkene (HGSOC) er den mest aggressive histologiske type epitelial kræft i æggestokkene, som er karakteriseret ved en høj frekvens af somatiske

TP53

mutationer. Vi udførte exome analyser af tumorer og matchede normale væv fra 34 japanske patienter med HGSOC og observeret et betydeligt antal patienter uden

TP53

mutation (24%, 8/34). Kombineret med resultaterne af kopiantal variation analyser, vi inddelt de 34 patienter med HGSOC i subtyper udpegede ST1 og ST2. ST1 viste intakt p53 pathway og var præget af færre somatiske mutationer og kopi nummer ændringer. I modsætning hertil blev p53 pathway hæmmede i ST2, som er karakteriseret ved rigelige somatiske mutationer og kopi nummer ændringer. Genekspressionsprofiler kombineret med beregninger med den Gene Ontologi ressource indikerer inddragelse af specifikke biologiske processer (mitose og DNA helicase), som er relevante for genomisk stabilitet og kræft ætiologi. Især demonstrerer vi tilstedeværelsen af ​​en ny undertype af patienter med HGSOC der er karakteriseret ved en intakt p53 vej, med begrænsede genomiske ændringer og specifikke genekspressionsprofiler

Henvisning:. Hayano T, Yokota Y, Hosomichi K, Nakaoka H, ​​Yoshihara K, Adachi S, et al. (2014) Molekylær karakterisering af en Intakt p53 Pathway Undertype i High-Grade serøs kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (12): e114491. doi: 10,1371 /journal.pone.0114491

Redaktør: Michael Baudis, University of Zürich, Schweiz Institut for Bioinformatik, Schweiz

Modtaget: Maj 16, 2014; Accepteret: November 10, 2014; Udgivet: December 2, 2014

Copyright: © 2014 Hayano et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at for godkendte årsager, nogle adgangsbegrænsninger anvendelse på de data, der ligger til grund for resultaterne. Dataene indeholder identifikationsoplysninger og kan ikke stilles til rådighed. En de-identificerede minimal datasæt er tilgængelig på Figshare: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1235612. er tilgængelige Yderligere oplysninger ved henvendelse til professor Ituro Inoue ([email protected])

Finansiering: Dette arbejde blev støttet delvist af en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (give Nej . 23791816) fra Japan Society for fremme af Science (https://www.jsps.go.jp/) (KY). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De alder justeret satser for æggestokkene og andre uterin adnexa kræftformer i 2002 var 10,6 pr 100.000, og 5,2 per 100.000 personår i USA og Japan, henholdsvis [1]. Epitelovariecancer er en heterogen enhed, der omfatter flere histologiske typer såsom high-grade serøs, lav kvalitet serøs, klar celle, endometrioide, og mucinous cancere [2], [3]. Ovariecancer er opdelt i type I- og type II tumorer [2], [4]; Type I tumorer omfatter lav kvalitet serøs, lav kvalitet endometrioide, klar-celle, og mucinous karcinomer. Disse tumorer dårligt svare platinbaseret terapi, huser en høj frekvens af mutationer i gener, der koder komponenter af Ras-signalvejen, og er relativt stabilt i genomiske struktur. Type II tumorer indbefatter high-grade serøs og ædelstål endometrioide carcinomer og er meget aggressive. En storstilet undersøgelse af høj kvalitet serøs kræft i æggestokkene (HGSOC) af The Cancer Genome Atlas (TCGA) gruppe karakteriseret HGSOC som

TP53

-mutation beriget (96%) med aberrationer af genom-dækkende somatiske gen- kopi numre. Denne undersøgelse identificeret almindeligt ændrede veje såsom RB1, PI3K /RAS, HAK, homolog rekombination, og FOXM1 veje [5]. Mutationen status

TP53

er forbundet med trin, genekspressionsmønstre, og overlevelsen af ​​patienter med serøs ovariecancer [6].

Vi har forsøgt at etablere et risikoklassificeringssystem for serøs æggestokkene kræft ved hjælp genekspressionsprofiler erhvervet ved hjælp af microarray data [7], [8]. Vi identificerede 88 gener relateret til progressionsfri overlevelse i 110 japanske patienter med fremskreden fase serøs ovariecancer [7], samt 126 gener relateret til den samlede overlevelse i 260 japanske patienter med fremskreden fase HGSOC [8]. At give en bedre forståelse for de molekylære mekanismer, der er involveret i patogenesen af ​​disse kræftformer og til at udvikle et risikoklassificeringssystem gennemførte vi profilering af de somatiske mutationer til stede i disse tumorer.

Vi kompileret genomisk information for patienter med HGSOC hjælp exome sekventering og kopi nummer variation (CNV) analyser. Ifølge profiler af somatiske enkeltnukleotid-varianter (SNVs), små insertioner og deletioner (indels) og CNVs, vi klassificeret HGSOC i subtyper udpegede ST1 og ST2 der er kendetegnet ved intakte eller disses p53 signalveje henholdsvis. Vi yderligere kendetegnet de to undertyper ved at sammenligne deres genekspressionsprofiler. Gene ontologi (GO) analyse viste, at differentielt udtrykte gener blev væsentligt beriget med mitose og DNA helicase GO grupper, der kan være involveret i genomisk ustabilitet og tumorigenese af HGSOC. Disse resultater giver ny indsigt i de molekylære egenskaber og nye biologiske processer, der bidrager til patogenesen af ​​HGSOC, især hos patienter med en intakt p53 pathway.

Materialer og metoder

Etik erklæring

de etiske udvalg af Niigata University (IRB No. 239, 428, og 455) og Statens Institut for Genetik (IRB No. 23-11) godkendt forsøgsprotokoller, og hver deltager forudsat skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyser.

Kliniske prøver

Friske frosne prøver blev opnået fra primære tumorvæv før administration af kemoterapi. To patologer vurderede de histologiske karakteristika formalinfikserede og paraffin-embedded hematoxylin og eosin sektioner. Fordi konkret histologisk karakterisering var et afgørende element i undersøgelsen, blev en central patologisk gennemgang foretaget af to uafhængige gynækologiske patologer (HT og TM) uden kendskab til patienternes kliniske status. Histologiske typer og graden af ​​histologiske differentiering blev bestemt ifølge WHO klassifikation af ovarietumorer og Silverberg klassificering henholdsvis [8]. Kliniske data (Pt- og FIGO-stadie) er vist i tabel S1. Vi bruges perifert blod som matchede normalt væv.

Exome sekventering

Genomisk DNA blev isoleret fra tumorvæv under anvendelse af en phenol-chloroform fremgangsmåden og fra perifert blod ved hjælp af QIAamp DNA Blood Maxi Kit (QIAGEN ) [8]. Genomisk DNA blev hybridiseret med SureSelect Humant Alle Exon Kits (Agilent) til fremstilling af sekventering biblioteker, og bibliotekerne blev sekventeret ved anvendelse af Illumina HiSeq 2000 (Illumina) med 90 eller 100 baseparrede endemoduler. Sekvens læser blev justeret til en reference-genom (UCSC hg19) ved hjælp af BWA [9] og SAMtools [10]. Picard (https://picard.sourceforge.net) blev anvendt til fjernelse duplikat læser. Lokal tilpasning af læser omkring kendte indels og rekalibrering af base kvalitet blev udført ved hjælp GATK [11]. Den heuristiske somatisk mutation, der ringer, VarScan 2 [12], blev brugt til somatisk mutation kald. Threshold kriterier for påvisning af somatiske mutationer var som følger: normal variant hyppighed på 0% og Fishers eksakte test p-værdi på 0,00001. Funktionel information af somatiske mutationer blev kommenteret hjælp ANNOVAR [13] og Oncotator (https://www.broadinstitute.org/oncotator/).

Forudsigelse af funktionelle konsekvenser af missense enkelt nukleotid varianter

funktionelle virkninger af de identificerede somatiske missense mutationer blev vurderet ved anvendelse MutationAssessor 2 [14], som forudsiger virkningen af ​​aminosyresubstitutioner ifølge et mønster af evolutionære konservering baseret på multiple sekvens-alignments af en proteinfamilie. Missense mutationer med en funktionel betydning score (FIS) i 2,0 blev defineret som skadelig

Påvisning af kræft driver gener

For at opdage mulige kræft driver gener baseret på de identificerede somatiske mutationer, vi. brugte OncodriveFM [15], der vurderer ophobning af mutationer med høj funktionel betydning inden for et gen, under forudsætning af, at kræft driver gener er stærkt muteret og udøve betydelige funktionelle virkninger. Men konsekvenserne af mutationer i passager gener er for det meste godartede. OncodriveFM stammer FIS fra MutationAssessor 2 for at vurdere, om muterede gener er drivere eller passagerer.

Analyser af CNV og tumor renhed

Single (SNP) array-eksperimenter med genom-Wide Menneskelig SNP 6.0 (Affymetrix) blev tidligere gennemført i 30 af 34 HGSOC prøver [8], [16]. På grund af de tekniske vanskeligheder og begrænsede DNA mængder, kunne vi ikke skaffe SNP array-data for de resterende fire prøver. Affymetrix CEL filer fra SNP-array forsøg med 30 prøver blev behandlet ved hjælp af CNV afsløring softwarepakke PennCNV [17]. CNVs blev kaldt ved anvendelse af en skjult Markov-model ifølge beregninger af log R-forhold og B-allel frekvensværdier. CNV frekvens mellem tumor og normale prøver blev evalueret for hver SNP anvendelse af Fishers eksakte test i ParseCNV algoritmen [18]. Threshold kriterier for tilbagevendende CNV regioner (CNVRs) var som følger: Fishers eksakte test p-værdi på 0,0005 og ingen overlapning med strukturelle variationer i prøver fra raske forsøgspersoner [19]. Desuden blev de CEL filer anvendt til at estimere tumor renhed. Vi brugte ASCAT (allelspecifikke Kopi nummer Analyse af tumorer) algoritme [20] i NEXUS kopi nummer software version 6.0 (BioDiscovery) [21] for at vurdere omfanget af kontaminering af normale celler i tumor prøver. De MIAME-kompatible SNP-array data blev deponeret til Gene Expression Omnibus datalager (tiltrædelse nummer GSE61237).

microarray eksperimenter og databehandling

Udvinding af RNA, Cy3 mærkning, microarray hybridisering signal scanning, og feature extraction blev udført i tidligere undersøgelser [7], [8]. Data normalisering blev udført ved hjælp af indstillingen GeneSpringGX11 (Agilent) af rå signal tærskel på 1,0 og normalisering til 75

percentil.

genanalyse

Betydningen af ​​forskelle i genekspression mellem de to undertyper blev evalueret ved hjælp af

t

-test. Efter evalueringen blev multiple test korrigeret af den falske opdagelse sats (FDR) ved hjælp af Benjamini-Hochberg procedure [FDR (BH)]. Vi sætter FDR (BH) til 0,1 som den betydelige tærskel. Disse analyser blev udført ved anvendelse af ComparativeMarkerSelection modul GenePattern [22].

GO analyse

GO analyse blev udført under anvendelse af Functional Annotation Clustering værktøj inkluderet i DAVID bioinformatik ressource [23]. Dette værktøj vurderer ligheden annotation vilkår ved hjælp af kappa statistik og tvinger grupper til at dele lignende annotation profiler ved hjælp af en fuzzy heuristisk multiple-kobling partition [24]. Indstillinger var som følger: otte annotation kategorier (OMIM_Disease, COG_Ontology, SP_PIR_Keywords, GOterm_BP_FAT, GOterm_MF_FAT, BBID, BioCarta, og KEGG_Pathway), ligheden sigt overlap af ≧ 3, kappa statistik tærskelværdi på 1, gruppe medlemskab af ≧ 3, og fuzzy multiple -binding partition grænse på 1 hhv. Berigelse scoringer blev beregnet ved hjælp af den geometriske gennemsnit af den modificerede Fishers eksakte test p-værdier (-log skala) til gen-berigelse af hvert GO sigt i hvert GO gruppe og en berigelse score på 1.3 betragtes som signifikant [23]

.

data visualisering

somatiske mutation data blev vist ved hjælp Gitools (version 1.8.4) [25]. Kopiér nummer data blev vist ved hjælp Integrativ Genomics Viewer (IGV version 2.3.25) [26]. Bee sværm og box parceller blev oprettet ved hjælp af beeswarm pakke i CRAN repository (https://cran.r-project.org/). Heat kortvisninger af genekspression data blev vist ved hjælp HeatMapViewer modul i GenePattern [22].

Resultater

Genomisk ombygning profilering

De somatiske mutationer identificeret i prøver erhvervet fra 34 japanske patienter med HGSOC blev katalogiseret efter analysen af ​​exome sekventering data. Den gennemsnitlige read dybde var 91 × og 84 × til tumor og normale prøver, hhv. Dækning af ≧ 10 × blev opnået for 89% og 88% af kodende baser af tumor og normale prøver (tabel S2). Vi identificerede 1.399 somatiske ikke-synonyme (missense og nonsens) og splejsningssted mutationer (41 mutationer per prøve) ved hjælp VarScan 2 [12] med de foruddefinerede kriterier beskrevet i Materialer og metoder sektion. Af disse somatiske varianter, blev 158 tilfældigt udvalgt og underkastet Sanger-sekventering, og 143 varianter lykkedes valideret (143/158, 91%). Alle

TP53

somatiske ikke-synonyme og splejsningssted mutationer blev kaldt og valideret ved hjælp VarScan 2 og Sanger sekventering, hhv. For ni patienter uden

TP53

somatiske ikke-synonyme og splejsningssite mutationer, vi yderligere udført Sanger sekventering for alle de ti

TP53

kodning exons fordi falsk negativ kan forventes på grund af de eksisterende lav dybde læser . Vi har registreret en ramme-shift sletning på exon 3 for S022 (tabel S3). Somatiske SNVs og indels blev kommenteret til 1405 i 1.159 gener.

TP53

blev hyppigst muterede (76%, 26/34) (figur 1A), men mutationen frekvens var lavere end tidligere rapporter [5], [27]. Der var 24 forskellige og forskelligartede

TP53

mutationer (tabel S4). To patienter (S066 og S271) delte den samme missense variant (R273H) og de to andre patienter (S009 og S017) delte den samme nonsens variant (R196 *). Af de resterende 22

TP53

varianter, fem var frame-shift sletninger (A86fs til S020, P27fs for S022, F113fs for S119, S241fs for S006, og E286fs for S118), den ene var en nonsens-variant (Q52 * for S015), to var splejsningssite varianter (Y126splice for S188 og S261splice for S008), og de resterende 14 var missense (tabel S4). FIS for 15

TP53

missense varianter var 2,0 ifølge MutationAssessor 2 [14] analyse og blev udpeget som skadelige (tabel S4)

(A) Somatisk mutations landskab af 34 patienter. med HGSOC. Somatiske mutationer identificeret i mere end eller lig med tre patienter er vist. Patienter med mutationer af samme gen, er vist med rødt. (B) Kopi nummer ændring landskab af 30 patienter med HGSOC. Kopiér nummer (KN) ændringer er angivet som følger: CN = 0, mørkeblå; CN = 1, lyseblå; CN = 3, pink; og CN ≧ 4, rød). Blå linje i Sletning sporet og rød linje i Amplification sporet show kopi nummer ændring frekvens. Grå linjer i sletningen og Amplification spor viser de -log-transformerede Fishers eksakte test p-værdier på 0,0005.

Den anden hyppigst muterede gener var

BCLAF1

,

CLCNKA

, og

MAGEC1 Hotel (29%, 10/34 for hvert gen). Ifølge FIS bestemmes ved hjælp MutationAssessor 2, alle mutationer undtagen K911fs af

BCLAF1

blev vurderet som godartet og blev anset for personbiler mutationer. Ninety-to procent (1.063 /1.159) af generne blev muteret i én patient. For yderligere at udforske kandidat kræft driver gener muteret i mindst to patienter blev OncodriveFM påført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Kun

TP53

blev påvist som en cancer driver gen med høj akkumulering af skadelige mutationer i vores HGSOC prøver (data ikke vist).

CNV profilering i 30 af de 34 HGSOC prøver er vist i figur 1B og File S1. De genom-dækkende kopiantal på 30 HGSOC prøver blev ændret. ParseCNV identificeret ni gange slettet CNVRs (1p36.11, 4q24, 5q13.1, 5q13.2, 6q22.33-23.1, 15q24.2-24.3, 17q12, 18q21.31, og 22q12.3) og fire forstærkede CNVRs (1p34 0,1-33, 3q27.2, 6p24.2, og 10p12.31-12.2) med identificerede gener henholdsvis (tabel S5 og S6).

Udelukkelse af p53 pathway-nedsat patienter fra ikke-muteret TP53 HGSOC

TP53

mutationshyppighed var signifikant lavere i vores prøver sammenlignet med dem rapporteret i tidligere undersøgelser som følger: 26/34 vs. 301/316; Fishers eksakte test p-værdi på 0,0060 [5] og 26/34 vs. 118/126; Fishers eksakte test p-værdi på 0,0069 [27]. Blandt de otte prøver med ikke-muteret

TP53

(figur 2A), viste CNV analyse heterozygot kopi antal tab af

TP53

for prøve S004 (figur 2B). MDM2 er en E3 ubiquitin protein ligase som målretter p53 for proteasomalaktivitet nedbrydning og betragtes som en negativ effektor af p53 [28]. Der er en sammenhæng mellem forstærkning af

MDM2

og tab af p53-funktion i visse tumorer [27]. For de otte prøver med intakt

TP53

, ingen

MDM2

kopiantal amplifikation blev observeret (figur 2A). For yderligere at undersøge, om en alternativ mekanisme udgør p53 dysfunktion, vi evaluerede en liste over direkte p53 målgener (tabel S7) opnået fra Pathway Interaction Database (PID) [29]. Vi identificerede en

IRF5

(Interferon Regulatory Factor 5) splejsningsstedmutationen (W181splice) prøve S018. Samlet set vi identificeret seks p53 pathway intakte patienter fra de otte patienter med HGSOC med ikke-muteret

TP53

(figur 2A). Vi tildelt seks patienter til ST1 og de resterende til ST2.

(A) Resumé af patienter med

TP53

mutationer er vist i pink i

TP53

_mut spor.

TP53

heterozygot kopi nummer sletninger er vist med blåt i

TP53

_Del spor.

MDM2

kopiantals forstærkning vises med rødt i

MDM2

_amp spor. Mutationer i gener, som er direkte mål for p53 er vist med grønt i p53_Target_mut sporet. (B) Dot plot af log R ratio (LRR) af CHR17 for prøve S004. Blå prikker indikerer LRR værdier. Positionen for linien af ​​LRR = 0 er angivet som 0 på højre side af hver graf.

TP53

(17p13.1) er angivet med en blå stjerne på den lodrette linje.

Genomisk ændringer i ST1 og ST2

Vi har ikke opdage mutationer i gener specifikke for lav kvalitet serøs typen, såsom

BRAF

,

CTNNB1

,

KRAS

, og

PIK3CA

[27], blandt de 1159 gener muteret i de 34 HGSOC prøver (data ikke vist).

for at karakterisere forskelle i genomiske ændringer mellem ST1 og ST2 sammenlignede vi antallet af somatiske ikke-synonyme og splejsningssted mutationer og fundet antallet af somatiske ST1 mutationer var signifikant lavere sammenlignet med ST2 (Wilcoxon rank sum test p-værdi på 0,00070) (figur 3A).

(A) sammenligning af antallet af somatiske ikke-synonyme og splejsningssted mutationer. (B) Sammenligning af antallet af CNV segmenter (øvre panel) og CNV profiler (nederste panel) på kromosomerne 17 og 12 mellem ST1 og ST2. Kopiér nummer ændringer er som følger: CN = 0, mørkeblå; CN = 1, lyseblå; CN = 3, pink; og CN ≧ 4, rød). ST1 er omsluttet af grønne rektangel. (C) Tumor renheder på ST1 og ST2.

Derudover har vi sammenlignet ST1 og ST2 med hensyn til antallet af CNV segmenter identificeret af PennCNV [17] i hvert autosomalt kromosom (tabel S8). Resultaterne af Wilcoxon rank sum test og korrektion multiple test i 22 autosomale kromosomer ifølge falsk opdagelse sats (FDR) [30] viste signifikant færre CNV segmenter på kromosom 17 og 12 (FDR q værdi på 0,040 og 0,047, henholdsvis) for ST1 (figur 3B). Disse resultater indikerer, at ST1 fastholdt den normale karyotype og ST2 nærede genom-dækkende kopi nummer ændringer særligt beriget med kromosomer 17 og 12 (figur 3B).

For at udelukke, at det lave antal mutationer og få CNV segmenter af ST1 var på grund af en høj grad af forurening med normale celler, blev tumoren renhed evalueret som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. De gennemsnitlige tumor renheder var 79% og 73% for ST1 og ST2 henholdsvis og der var ingen signifikant forskel i tumor renhed mellem undertyper (Wilcoxon rank sum test p-værdi på 0,48) (figur 3C og tabel S9).

genekspressionsanalyse til funktionelt karakterisere ST1 og ST2

genekspressionen profiler af ST1 og ST2 blev bestemt under anvendelse af et mRNA microarray [7], [8]. Firs-ni sonder, der repræsenterer 70 gener afslørede forskelle i udtryk niveauer mellem ST1 og ST2 på en FDR (BH) i 0,1 (tabel S10 og S11). Ekspressionsniveauerne af 33 og 37 gener var højere (tabel S10) og nedre (tabel S11), henholdsvis for ST1 sammenlignet med den for ST2. De 70 gener viste relativt homogene og heterogene udtryk i ST1 og ST2 henholdsvis (Figur 4)

Halvfjerds gener (89 prober) viser forskelle på FDR (BH) af. 0,1 vises. ST1 er omsluttet af grønne rektangel. Høj og lav angiver ekspressionsniveauer af ST1 sammenlignet med ST2.

For at evaluere de biologiske og funktionelle konsekvenser af ekspressionen af ​​disse 70 gener, GO analyse blev anvendt ved hjælp af DAVID. Tredive-fem gener blev klassificeret i 18 GO grupper deler lignende GO vilkår (tabel S12). To af de 18 GO grupper (mitose og DNA helicase) viste signifikant berigelse af gener (Berigelse score på 1.3) (figur 5 og tabel S12).

NEK1

og

NEK9

i mitosen gruppe blev opreguleret og

ASPM

,

BIRC5

,

CDCA2

, og

SKA3

blev nedreguleret i ST1 sammenlignet med i ST2.

BLM

,

PIF1

, og

RECQL4

, der koder for DNA helicaser, blev udtrykt ved relativt lave niveauer i ST1. Forskelle i ekspressionen af ​​disse mitose og DNA helicase gener blev evalueret ved brug af Kolmogorov-Smirnov test, F-test, og

t

-test med R-version 3.0.2 (figur 6 og tabel S13).

Heat-kortvisning af gen ontologi (GO) grupper. To GO grupper (mitose og DNA helicase) med betydelig gen berigelse er angivet som GO gruppe 1 og 2, hhv. ST1 er omsluttet af den grønne firkant.

Bee swarm og box plots vise genekspression mønster af ST1 og ST2 patienter. Y-aksen angiver normaliserede gen ekspressionssignaler behandles af GeneSpring. Stjerner (*) eller plustegn (+) angiver

t

-Test p-værdier som følger: * p 0,05, ** p 0,01, og ***

(+++) p 0,001.

diskussion

analyserne af somatiske mutationer af HGSOC viste berigelse af

TP53

mutationer (figur 1A). CNV analyse viste en ændret profil af hele genomet kopiantal (Figur 1B). Disse resultater er i overensstemmelse med dem, der af en tidligere undersøgelse [5]. Men vi registreret en signifikant forskel i hyppigheden af ​​

TP53

mutationer sammenlignet med det rapporterede i tidligere rapporter [5], [27]. Konkret har otte HGSOC prøver ikke harbor

TP53

mutationer, og mutation af en p53 målgen

IRF5

blev identificeret i en prøve. Endvidere, en havde

TP53

kopi nummer sletning. Tilsammen vi tildelt seks HGSOC prøver som ST1, og de resterende 28 prøver som ST2.

Alle patienterne med HGSOC i denne undersøgelse var japansk, mens patienterne i de tidligere undersøgelser [5], [27] var hovedsageligt kommer fra EU-descenderende befolkninger. Forskellen på

TP53

mutation frekvenser kan komme fra befolkningsundersøgelser forskelle som observeret i tilfældet med epidermal vækstfaktor receptor (

EGFR

) mutationer for ikke-småcellet lungekræft [31], [ ,,,0],32].

EGFR

mutationsrater var som følger: 11% og 32% i West-europæisk og øst-asiatiske patienterne [31], og 2% og 26% af patienterne i USA og Japan, henholdsvis [32] . De lave antal patienter i den aktuelle undersøgelse i forhold til de TCGA datasæt [5], kan ikke nok til at give solid afslutning af

TP53

mutation frekvens. Åbenbart er der behov for langt større undersøgelse skala, herunder japanske og andre asiatiske patienter med HGSOC. Den anden mulighed er, at der findes lille brøkdel af

TP53

muteret tumorceller på grund af tumor heterogenitet i

TP53

ikke-muteret patienter. Det er almindeligt accepteret, at somatiske driver mutationer såsom mutationer af

TP53

opstår på et tidligt tilfælde af kræft, så skal observeres relativt høj frekvens af mutationen. I den aktuelle undersøgelse, vi faktisk observeret mindst 20% af tumor variant frekvenser til

TP53

. Derfor har vi formentlig ikke overse driver mutationer af

TP53

af exome sekventering (figur 1).

De lave antal somatiske mutationer og CNV segmenter observeret i ST1 sandsynligvis afspejler en funktionelt intakt p53 pathway. ST2 blev beriget for

TP53

mutationer, og genom-dækkende kopiantal profiler svarede til dem af type II tumorer. I modsætning hertil

TP53

blev muteret i ST1 og udviste en normal karyotype svarende til den i type I tumorer som foreslået i en tidligere undersøgelse [2]. Men vi ikke registrere mutationer i gener, der koder komponenter af RAS signalvejen i ST1 (data ikke vist). I den største datasæt fra TCGA [5], 15 af 316 prøver fra patienter med HGSOC nærede ikke-muteret

TP53

. Når vi søgt efter

TP53

sletninger,

MDM2

forstærkning, eller p53 target-genmutationer i de 15 prøver, kun én (TCGA-25-1328) blev klassificeret som ST1 (figur S1) . Hierarkisk klyngedannelse bruger 45 overlappende gener blandt de 70 differentielt udtrykte gener tildelt TCGA-25-1328 til ST1 (figur S1, nederst). Disse resultater indebærer, at ST1 er en roman HGSOC undertype baseret på mutation og CNV-profiler.

For yderligere at karakterisere de funktionelle egenskaber ST1 og ST2, vi sammenlignede deres genekspressionsprofiler (Figur 4). Ved hjælp af en signifikans tærskel [FDR (BH) 0,1] identificerede vi 70 gener, der blev homogent udtryk i ST1 microarray og uensartet udtryk i ST2 microarray (figur 4). Den heterogene genekspression af ST2 kan indikere diversificering af molekylære undertyper som sekundære begivenheder som foreslået i revisionen ovenfor [2] citeret, og homogen genekspression af ST1 kan afspejle en tidlig begivenhed af onkogenese før kromatin ustabilitet forekommer.

GO analyse identificeret 18 GO grupper, som deler meget lignende biologisk set og to grupper var signifikant beriget for gener involveret i mitose, og dem, der koder for DNA-helicaser (figur 5 og 6). Defekter i mitose føre til unormale kromosom numre, der er forbundet med onkogenese [33]. To mitotiske gener, der koder kinaserne NEK1 og NEK9 blev højt udtrykt i ST1, og opregulering af disse kinaser er associeret med genomisk stabilitet og tumorigenese [34] – [37]. Desuden andre mitotiske gener (

ASPM

,

BIRC5

,

CDCA2

, og

SKA3

) var stærkt udtrykt i ST2, og afvigende aktivering af ekspression af disse gener er forbundet med onkogenese [5], [38] – [42]

DNA helicaser opretholde genom stabilitet gennem DNA-reparation, rekombination, og replikation.. DNA helicaser, BML og RECQL4, inaktiveres i cancerpatienter tilbøjelige genetiske lidelser såsom Bloom og Rothmund-Thomson syndromer [43], [44]. Opregulering af DNA helicase ekspression almindeligvis opstår i flere kræftformer (fx hæmatopoietiske, prostata, og hepatocellulære) [43] – [48]. Forhøjet ekspression af DNA helicase generne

BLM

,

PIF1

, og

RECQL4

som generelt observeret i kræftformer kan forklare et opsving funktion fra kromatin ustabilitet i ST2. I modsætning hertil nedsat ekspression af gener kodende DNA helicaser, der prægede ST1 angiver, at kromatin ustabilitet ikke forekommer i ST1. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afklare forholdet mellem ekspressionen af ​​disse gener og patogenesen af ​​HGSOC.

Vi har ikke påvise forskelle i den samlede eller progressionsfri overlevelse af patienter, der er klassificeret som enten ST1 eller ST2 (Figur S2). Alle prøver blev diagnosticeret som high-grade kræft ved patologer, og prøverne er klassificeret som ST1 blev retrospektivt undersøgt; men de manglede unikke patologiske træk. ST1 var præget af en intakt p53 vej; men der var ingen forskel i patienternes patologiske fund eller kliniske konsekvenser. Disse resultater antyder tilstedeværelsen af ​​uidentificerede biologiske processer involveret i ST1 fænotype, hvilket indikerer, at der skal udvikles en mere effektiv behandling af disse patienter.

Sammenfattende beskriver vi identificering af en hidtil ukendt intakt p53 pathway subtype in Japanese patienter med HGSOC. Vores resultater lover at forbedre vores forståelse af de molekylære mekanismer i onkogenese og bør lette udviklingen af ​​terapeutiske strategier, der er målrettet ikke-muteret

TP53

patienter med HGSOC.

Støtte Information

Figur S1.

ST1 i TCGA data. (Øverste panel) Resumé af mutationer til

TP53

og p53 pathway gener for 15

TP53

ikke-muteret patienter med HGSOC i TCGA data.

TP53

homozygot sletning vises i mørkeblå og heterozygote kopi nummer sletninger er vist i lyseblå i

TP53

_Del spor.

MDM2

kopiantals forstærkning vises med rødt i

MDM2

_amp spor. Mutationer i gener, som er direkte mål for p53 er vist med grønt i p53_Target_mut sporet. (Bundpanel) Hierarkisk klyngedannelse af TCGA-25-1328 og 33 HGSOC hjælp 45 overlappende gener blandt de 70 differentielt udtrykte gener

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s001

(PDF)

figur S2.

Survival analyse. (Venstre panel) samlet overlevelse kurver for ST1 og ST2. (Højre panel) progressionsfri overlevelse kurver for ST1 og ST2. Disse overlevelseskurverne blev afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. p-værdier svarer til Logrank test sammenligner overlevelseskurverne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s002

(PDF)

tabel S1. Salg Kliniske data. Pt- og Figo-etaper. To undertyper (ST1 og ST2) er vist i Undertype kolonne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s003

(XLSX)

tabel S2.

dybde og dækning af exome sekventering. Dybde og dækning blev beregnet ved hjælp af DepthOfCoverage modul GATK

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s004

(XLS)

tabel S3.

Dybde af kodning exons af

TP53

Dybde af ti kodende exoner af

TP53

(NM_001126112.2) blev beregnet ved hjælp af SAMtools

doi:.. 10,1371 /journal.pone. 0114491.s005

(XLSX-)

tabel S4.

Somatic

TP53

mutationer. Funktionelle virkninger af missense enkelt nukleotid varianter, der blev evalueret ved hjælp MutationAssessor 2 er vist i FIS kolonnen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s006

(XLS)

tabel S5.

Kopier nummer slettet regioner. Tilbagevendende kopiantal deleterede regioner er vist i CNVR (hg18) søjle. Gene kolonne viser gener, der er placeret i disse CNVRs

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s007

(PDF)

tabel S6.

Kopier nummer forstærkes regioner. Tilbagevendende kopiantal amplificerede regioner er vist i CNVR (hg18) søjle. Gene kolonne viser gener, der er placeret i disse CNVRs

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s008

(PDF)

tabel S7.

Liste over p53 direkte målgener. En liste med p53 direkte target gener blev afledt af Pathway Interaction Database (PID)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s009

(XLSX)

tabel S8.