PLoS ONE: PORCN moonlights i en Wnt-Uafhængig Pathway der regulerer Cancer Cell Proliferation

Abstrakt

Porcupine (PORCN) er en membran-bundet O-acyl transferase, der er nødvendig for palmitoylering af Wnt proteiner, og som er afgørende i forskellige Wnt veje for Wnt-Wntless (WLS) binding, Wnt-sekretion, og Wnt-signaleringsaktivitet. Vi testede hvis PORCN var påkrævet for proliferationen af ​​transformerede celler. Knockdown af PORCN af flere uafhængige siRNA’er resulterer i en cellevækst defekt i en delmængde af epiteliale cancercellelinier. Væksten defekt er transformation-afhængige i humane brystkirtler epitelceller (HMEC) celler. Derudover inducerbar PORCN knockdown af to uafhængige shRNAs reducerer markant væksten af ​​etablerede MDA-MB-231 cancere i ortotopisk xenotransplantater i immunsvækkede mus. Uventet spredning defekt som følge af tab af PORCN sker i en Wnt-uafhængig måde, som det reddes af re-ekspression af katalytisk inaktiv PORCN, og ses ikke efter RNAi-medieret knockdown af Wnt bærerproteinet WLS, eller efter behandling med PORCN inhibitor IWP. I overensstemmelse med en rolle i en Wnt-uafhængig vej, knockdown af PORCN regulerer et bestemt sæt af gener, der ikke er ændret af andre hæmmere af Wnt signalering. PORCN protein synes således i Moonlight i en roman signalvej, der er hastighedsbegrænsende for kræft cellevækst og tumorigenese uafhængig af sin enzymatiske funktion i Wnt biosyntese og sekretion

Henvisning:. Covey TM, Kaur S, Tan Ong T , Proffitt KD, Wu Y, Tan P, et al. (2012) PORCN moonlights i en Wnt-Uafhængig Pathway der regulerer Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 7 (4): e34532. doi: 10,1371 /journal.pone.0034532

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: 8. december 2011; Accepteret: 1 mar 2012; Udgivet: 11 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Covey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af hertugen-NUS Signature Research Program og Singapore Translationel Research (stjerne) Investigator Award (til DMV) finansieret af agenturet for videnskab, teknologi og forskning, Singapore og Sundhedsministeriet, Singapore. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Wnts udskilles acylerede glycoproteiner der kan fungere som autokrine eller kortrækkende signalmolekyler og langtrækkende morfogener. Den 19 forskellige humane Wnts regulere multiple signalveje, og deres dysregulation er impliceret i forskellige sygdomme i udvikling, stamcellebiologi, proliferation og angiogenese [1], [2]. Der er således intens interesse i manipulation af Wnt vej selvom intervention på forskellige punkter i Wnt produktion og de nedstrøms signalering kaskader. En strategi for at opnå en bred afbrydelse af Wnt signalveje er at forhindre Wnt sekretion gennem hæmning af PORCN protein.

Porcupine (PORCN) blev først opdaget som en Drosophila segment polaritet gen nødvendig for den normale fordeling af Vingeløse (Wg ), Drosophila homolog af WNT [3]. PORCN er medlem af den membranbundne O-acyl transferase (MBOAT) familie og er bevaret blandt arter [4], [5]. PORCN er en multi-pass integreret membran enzym bosiddende i det endoplasmatiske reticulum og er nødvendig for lipid modifikation af Wnt proteiner. Acylering af PORCN synes at være helt afgørende for en korrekt sekretion og aktivitet af alle hvirveldyr Wnts [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] og genetisk sletning af PORCN er embryonale dødelig [12], [13]. PORCN har ingen kendt funktion ud over sin rolle i biogenesen af ​​Wnts, og er derfor et attraktivt terapeutisk mål i sygdomme med forøget Wnt signalering. Faktisk flere småmolekyleinhibitorer af PORCN funktion er blevet for nylig rapporteret, herunder Inhibitor of Wnt Production 1 og 2 (IWP-1 og IWP-2) [14]. Der er to generelle tilgange til PORCN hæmning, farmakologiske og genetiske. Især kan disse metoder PORCN hæmning giver forskellige resultater. Dette kan skyldes forskellige tidsrum grad af inhibering, men også fordi genetiske ablation af et enzym uventet kan afsløre flere uafhængige funktioner i en enkelt genprodukt

To steder i Wnt proteiner kan acyleres:. Serin svarende til S209 of Wnt3a er palmitoleated, mens cystein svarende til Cys77 er palmitoyleret [4], [11], [15]. Ser209 acyleringen er nødvendig for WNT binding til Wntless (WLS) [16], et stærkt konserveret multipass transmembrane protein specifikt involveret i Wnt sekretion [17], [18], [19]. WLS transporterer Wnts til plasmamembranen, hvor de udsættes derefter i det ekstracellulære rum i et pH-afhængig måde. I overensstemmelse med WLS rolle i Wnt-sekretion, celler, der mangler funktionelle WLS akkumulerer Wg i Golgi [17] og mus, som mangler WLS har dødelige udviklingsmæssige fænotyper stemmer overens med en central rolle i Wnt signalering [20]. Rolle Wnt cystein acylering er mindre klar [21]. Cys77 synes at være involveret i signalering aktivitet af udskilt protein, som mutation af stedet resulterer i et udskilt protein med variabelt reduceret signaleringsaktivitet [15]. Palmitoylering på dette websted kan være nødvendig for binding til Frizzled eller andre receptorer.

Mens PORCN er klart afgørende for Wnt sekretion og funktion, det vides ikke, om det spiller yderligere roller adskiller sig fra sin enzymatiske funktion i Wnt-vejen . For eksempel kunne PORCN acylere yderligere ikke-Wnt substrater. Alternativt da PORCN er en evolutionært gammel protein til stede i de simpleste metazoans [22], kan det have co-udviklet enzym-uafhængig, “sort arbejde” fungerer så godt. Som PORCN er både kritisk i udvikling og et potentielt terapeutisk mål i human sygdom, er det vigtigt at forstå den rolle, PORCN proteinet i celler fuldt. At dissekere rolle PORCN i Wnt-afhængig versus Wnt-uafhængige veje, sammenlignede vi effekten af ​​inhibering Wnt sekretion af flere midler, herunder PORCN knockdown, WLS knockdown, og lille molekyle inhibering af PORCN. Vi finder, at PORCN funktioner i mindst to uafhængige veje, den ene, der styrer Wnt sekretion, og en anden, der ikke kræver palmitoyl transferaseaktivitet men det er hastighedsbegrænsende for vækst af transformerede epitelceller og regulerer ekspression af et bestemt sæt af gener . PORCN s Wnt-selvstændig rolle i hurtig spredning har stor betydning for både embryonale udvikling og kræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle eksperimenter udført på mus fat relevante og nødvendige videnskabelige spørgsmål. Disse blev udført ved hjælp af anbefalede anæstesi og smertestillende under procedurerne og konkluderede i tide til at forhindre unødig smerte eller byrde for mus. Alle forsøg blev udført med godkendelse af NUS Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

Celler, plasmider, og reagenser

Alle cancer cellelinjer blev opnået fra ATCC. STF og STF3A celler blev afledt fra HEK 293-celler som tidligere beskrevet [23]. HMEC forvandlet (hTERT + H-Ras-V12 + p53 knockdown) og udødeliggjort (hTERT) celler var gave Mathijs Voorhoeve, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore. Mandlige murine embryonale stamceller (ES) celler med en målrettet PORCN locus, der placerer LoxP sites opstrøms for exon 8 og nedstrøms for exon 10 blev foretaget af Ozgene. PORCN null gen-målrettede ES-celler blev udvalgt til af Davor SOLTER laboratorium (Institut for Medicinsk Biologi, Singapore). MDA-MB-231 celler, der udtrykker pTRIPZ blev fremstillet under anvendelse lentiviral transduktion (Open Biosystems). De shRNA sekvenser anvendte var P1: 5’FTT GGA TAT FTT TCC ACA GCT -3 ‘P2: 5’TAT TTA GCC AAT AAG ACA TGG T -3’, W1: 5’ACC AAG AAG CTG TGC ATT GTT – 3 ‘, W5: 5’TGG ACA TTG FTT TCA AGC TAA-3’. pMKIT-HA-mPORC-D (gave fra Tatsuhiko Kadowaki) blev klonet ind i retrovirale plasmid MSCV-puro (gave fra Mathijs Voorhoeve). Punkt og siRNA-immune mutanter blev fremstillet under anvendelse af Stratagene QuikChange steddirigeret mutagenese. MDA-MB-231 og MCF7-celler der stabilt udtrykker vildtype og mutant PORCN blev dannet ved retroviral transduktion og selektion i puromycin. Den lille molekyle PORCN hæmmere IWP-1 og IWP-2 blev generøst leveret af Dr. Lawrence Lum. siRNAs var fra Dharmacon: Kontrol /Non-targeting (# D-001810-01-05), PORCN 7 (# J-009.613-07), PORCN 8 (# J-009.613-08), WLS 5 (# J-018.728 -05), beta-catenin 11 (# J-093.415-11).

RT-PCR /qPCR.

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse Qiagen RNeasy Kit, 1 ug RNA revers transskriberet ved hjælp Bio-Rad iScript cDNA syntese kit, og qPCR blev udført med Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermix.

mus Tumor Models.

For forbigående knockdown, 100.000 MDA-MB-231 celler blev transficeret med de anførte siRNA’er (kontrollere eller P7) og derefter sprøjtet ind i 4

th position brystfedtpude af 6 uger gamle NOD-SCID-mus. For PORCN og WLS tumormodeller, blev 500.000 MDA-MB-231 celler i 50 pi DMEM injiceret orthotopisk i 4

th position brystfedtpude af 6 uger gamle BALB /c nøgne mus. En uge efter injektion blev hæfteklammer fjernet og tumorvækst blev kvantificeret ved caliper måling. For at fremkalde PORCN knockdown, drak vand suppleret med doxycyclin ved 0,5 mg /ml og opdateres hver anden dag. Ved forsøgets afslutning, blev tumorerne høstet, vejet og genekspression blev analyseret.

Proliferation Studies.

Celler blev udpladet ved 70-80% sammenflydning i 6-brønds plader og transficeret med de specificerede siRNA’er ved 100 nm ved anvendelse Dharmafect 1 efter fabrikantens protokol. 24 timer efter transfektion blev cellerne trypsiniseret og genudpladet ved en 1:40 til 1:80 fortynding i 12-brønds plader. For proliferation undersøgelser med IWP blev celler udpladet i plader med 12 brønde ved 10% konfluens. Medier indeholdende vehikel (DMSO) eller IWP-1/2 var opdateres dagligt. De 12-brønds plader blev opsamlet over en periode på 7 dage, fikseret med iskold MeOH og farvet med krystalviolet (0,5% CV i 25% MeOH). For at kvantificere celle nummer blev krystalviolet opløst i 1% natriumdeoxycholat i vand og absorbansen blev målt ved 590 nm. Parallelle eksperimenter blev udført, og cellerne blev trypsiniseret og talt med en Beckman Coulter Counter over en periode på 7 dage.

Microarray.

MDA-MB-231 celler (70-80% sammenflydende) var transficeret med 50 nM siRNA i 48 timer. RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy oprensningskit fra Qiagen. Mærket cRNA blev fremstillet og hybridiseret til Affymetrix U133_Plus_2.0 mikroarrays ifølge fabrikantens protokoller. Array data blev normaliseret ved hjælp RMA algoritme. 1482 forskellige gener opdaget af en ANOVA algoritme (False Discovery Rate (FDR) = 0,01). Hierarkisk klyngedannelse analyse identificerer væsentligt forskellige grupper af prøver fra 1482 forskellige gener. Analyse blev udført ved hjælp af Partek software.

Resultater

PORCN er nødvendig for Wnt sekretion

For at generere værktøjer til undersøgelse PORCN funktion, vi identificeret og valideret to uafhængige og ikke- overlappende siRNA’er, siP7 og siP8, der er målrettet alle splejsningsvarianter af PORCN og gav mere end 90% knockdown af PORCN mRNA (figur 1A) i HEK-293 celler. Som forventet knockdown af PORCN i nærvær af transficerede Wnt3a resulterede i et fald i β-catenin /TCF-drevet luciferase ekspression i HEK-293-celler med en integreret SuperTopFlash reporter (STF-celler) (figur 1b). Ligeledes knockdown af PORCN i STF celler med stabil integration af Wnt3a (STF3A celler) resulterede i en defekt i Wnt3a sekretion i mediet (figur 1C), i overensstemmelse med PORCN essentielle rolle i Wnt sekretion.

A. STF3A celler blev transficeret med 100 nM af den angivne siRNA og PORCN besked blev analyseret 48 timer senere ved kvantitativ realtids-PCR. Histogrammet repræsenterer relativ PORCN mRNA normaliseret til actin mRNA. NT, ikke transficeret; Sic, siRNA kontrol; siP7 og siP8, specifik PORCN siRNAs. B. PORCN Knockdown blokke Wnt /β-catenin signalering. Relativ Wnt /β-catenin signalering blev målt i STF3A celler transficeret med 100 nM Sic, siP7 eller siP8 siRNA. C. PORCN knockdown inhiberer Wnt3a sekretion. STF3A celler blev transficeret med 100 nM af den angivne siRNA. Medier blev ændret til 1% FCS media 48 timer efter transfektion, og samlet 16 timer senere. Den overflod af Wnt3a blev vurderet i 30 pi konditioneret medium (medie) og 15 ug helcellelysater (WC) ved SDS-PAGE og immunoblotting med de angivne antistoffer. Actin immunblotting viser lig belastning af helcellelysater. D. Relative antal MDA-MB-231 brystcancerceller falder efter PORCN knockdown. Celler blev transficeret med de angivne siRNAs og spredning vurderes som i eksperimentelle procedurer. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse. E. PORCN knockdown bremser væksten af ​​multiple brystcancercellelinier. Celleantal blev vurderet 4 dage efter transfektion af siP7 siRNA og plottet som% af proliferation af kontrol siRNA-transficerede celler. *, P 0,05; **, P 0,01 til forskel fra kontrol. F. PORCN knockdown bremser selektivt væksten af ​​transformerede hMECs. Virkningen af ​​PORCN knockdown på væksten af ​​hMECs udødeliggjort med hTERT eller HMEC-hTERT celler transformeret med ekspression af H-RASV12 og stabil knockdown af p53 blev bedømt 6 dage efter transfektion med kontrol eller siP7 siRNA. Transfektionseffektivitet i begge celletyper var 80% som bedømt ved GFP-ekspression. *, P 0,05 sammenlignet med kontrol siRNA. G. PORCN Knockdown ændrer ekspression af Wnt /β-catenin målgener. Relativ besked af PORCN og andre Wnt /β-catenin-målgener i MDA-MB-231-celler (øverst) og SK-BR-3-celler (nederst) blev vurderet ved QRT-PCR 72-timer efter transfektion med 100 nM af den angivne siRNA.

Tab af PORCN hæmmer brystkræft cellevækst

for at teste, om PORCN var vigtigt for brystcancercelleproliferation vi først vurderet sit udtryk i et panel af brystkræft cellelinier. PORCN mRNA var til stede i alle testede linjer, med MDA-MB-231 og sum-159 celler, som viser den mest rigelige meddelelse (fig S1A). Vi analyserede desuden disse celler til basal Wnt /β-catenin signalering men ikke se konsistent eller statistisk signifikant aktivering af TOPFlash over den negative kontrol FOPFlash reporter i nogen af ​​de testede cellelinier (data ikke vist). Selv om nogle af disse cellelinjer er blevet rapporteret at have endogen Wnt /β-catenin aktivering på grund af opregulering af Wnts og dæmpning af udskilte Wnt hæmmere [24], [25], [26], under vores dyrkningsbetingelser var der ingen tegn på en Wnt autokrin løkke.

Fordi Wnt signalering kan aktivere både β-catenin afhængig og β-catenin-uafhængige veje, vi testede, hvis PORCN knockdown påvirket spredning og overlevelse af disse menneskelige brystkræft cellelinier selv i fravær af påviselig endogen β-catenin signalering. PORCN siRNA’er siP7 og siP8 var i stand til at producere mindst 75% knockdown af PORCN mRNA i MDA-MB-231-celler (figur 1G). Uventet, dette forårsagede et markant fald i celleproliferation over tid (figur 1D). Disse resultater blev udvidet i yderligere fem brystkræft cellelinier; RNAi-medieret knockdown af PORCN forårsagede en statistisk signifikant fald i proliferation (figur 1E) i hver testet cellelinje. RNAi-medieret knockdown af PORCN er blevet rapporteret at forårsage apoptose i humane lunge cancerceller [27], selv om dette fund ikke kunne uafhængigt gengives [28]. Mens vi fundet et fald i vækst i en række brystcancercellelinier, havde PORCN knockdown ikke resultere i apoptose eller omstilling i cellecyklusfordeling i nogen af ​​cancer linjer afprøvet (figur S1B, og data ikke vist). Især betyder PORCN knockdown ikke påvirke udbredelsen af ​​alle celler. For eksempel blev mesoderm-afledte cancer linjer såsom HT-1080 fibrosarcomaceller og transformerede BJ fibroblaster ikke måleligt påvirket (data ikke vist). Også, PORCN er ikke afgørende for væksten af ​​embryonale stamceller og muse embryo fibroblaster [12], [13]. Vigtigt er det, at væksten virkning PORCN knockdown er transformation specifikt i epitelceller. Transformerede hMECs er følsomme over for PORCN knockdown mens udødeliggjort HMECs ikke påvirkes (figur 1F). I overensstemmelse med konstateringen af, at effekten af ​​PORCN knockdown på vækst er ikke afhængig af Wnt signalering, behøver transformerede hMECs ikke vise nogen tegn på Wnt /β-catenin autokrine signalering (data ikke vist).

Konsekvenserne af PORCN knockdown blev undersøgt yderligere ved at analysere endogene Wnt målgener i SK-BR-3 og MDA-MB-231-celler, som de havde den største spredning defekten efter PORCN knockdown. Disse linjer er blevet rapporteret at have autokrin Wnt signalering [24], [29], selv om vi ikke kunne påvise dette i TOPFLASH assays i vores specifikke cellelinier. PORCN knockdown i MDA-MB-231-celler førte til en beskeden, men statistisk signifikant fald i overflod af transkripter koder for Wnt målgener AXIN2, cyklin D, og ​​LEF1 (figur 1G, top panel). Et signifikant fald i både AXIN2 og LEF1 mRNA blev fundet i SK-BR-3-celler (figur 1G, nederste panel). Tilsammen PORCN knockdown faldt væksten i en række transformerede cellelinjer, og dette korrelerede ufuldkomment med knockdown af Wnt /β-catenin målgen herunder AXIN2, Cyclin D og CMYC.

Knockdown af PORCN forsinker tumor vækst i et ortotopisk musemodel

for at løse, om PORCN knockdown kan bremse væksten af ​​tumorceller i et mere komplekst miljø, hvor yderligere stroma-afledte signaler også kan stimulere proliferation, undersøgte vi hastigheden af ​​etablering af tumorer

in vivo

. MDA-MB-231-celler transficeret med siControl eller siP7 siRNA blev orthotopisk injiceret i NOD-SCID-mus og tumor take blev overvåget. MDA-MB-231 celler med transient PORCN knockdown vises en 2-ugers forsinkelse i tumoroptagelse sammenlignet med kontroller (figur S1c). Forsinkelse i tumordannelse foreslog, at PORCN gen funktion er vigtig for tumor tage og /eller progression og opfordrede os til at forfølge en stabil knockdown tilgang.

For at teste, om tab af PORCN ville påvirke væksten af ​​etablerede tumorer, vi screenede 25 MIR-30 baserede konstruktioner og identificeret to uafhængige microRNA, der leveres robust PORCN knockdown. Disse blev klonet ind i en inducerbar lentiviral vektor, pTRIPZ, der giver dobbelte ekspression af Red Fluorescent Protein (RFP) og shRNAmir i nærvær af doxycyclin. MDA-MB-231 celler blev genereret med stabilt integrerede pTRIPZ kørsel enten krypterede shRNAmir (shControl) eller en af ​​to uafhængige shRNAmirs mod alle splejsningsvarianter af PORCN (her kaldet SHP1- og SHP2). I dyrkede celler, tilsætning af doxycyclin førte til induktion af shRNAmir med -75% reduktion af PORCN budskab og høj ekspression af RFP (figur 2A). Som forventet, denne nedgang i PORCN mRNA i MDA-MB-231-celler førte til et fald i Wnt3a-aktiveret signalering fra STF reporter (figur 2B). For at teste om PORCN knockdown kunne induceres

in vivo

, celler blev injiceret orthotopisk i BALB /c nøgne mus. Når tumorerne nåede en håndgribelig størrelse (-0,2 cm), blev doxycyclin tilsat til drikkevandet. Efter 7 dage på doxycyclin blev tumorer indsamlet og analyseret for PORCN besked. Både SHP1- og SHP2 tumorer havde en reduktion i PORCN besked, der angiver, at doxycyclin er ved at nå cellerne og fremkalde PORCN knockdown

in vivo

(Figur 2C).

A. Etablering af PORCN inducerbare knockdown. MDA-MB-231 celler med stabil integration af pTRIPZ- SHC (kontrol), -shP1 eller -shP2 shRNAmir blev behandlet med 5 ng /ml doxycyclin (højre) eller vehikelkontrol (venstre). PORCN og actin mRNA blev vurderet ved RT-PCR, og RFP-ekspression blev vurderet ved fluorescensmikroskopi. B. Inducerbar knockdown af PORCN inhiberer Wnt /β-catenin signalering. De stabile MDA-MB-231-cellelinjer blev transient transficeret med Wnt3a ekspressionsvektor og SuperTOPflash og Renilla luciferase reporter plasmider, og derefter behandlet med 5 ng /mL Dox i 48 timer før vurdering af Wnt /β-catenin signalering som beskrevet. Histogrammet repræsenterer SuperTOPflash signalering forhold til Renilla luciferase-ekspression. C. Inducerbar knockdown af PORCN mRNA i ortotopisk xenotransplantater. De stabile cellelinjer blev injiceret orthotopisk i 4

th brystfedtpude af BALB /c nøgne mus. Efter etablering af palpable tumorer (15 dage), blev Dox tilsat til vandet for en 7-dages periode blev tumorer høstet og mRNA overflod blev vurderet ved QRT-PCR. Histogrammet repræsenterer relativ PORCN mRNA normaliseret til actin mRNA. D. PORCN knockdown bremser kræft vækst. Tumorer blev høstet og vejet 19 dage efter starten af ​​doxycyclin behandling. E. Cancer vækst bremset af inducerbare PORCN knockdown. Tumor volumen blev målt ved calipre på de angivne tidspunkter.

For at teste, om PORCN knockdown påvirker tumorvækst, blev de samme cellelinjer injiceres orthotopisk i BALB /c nøgne mus. Tumorer fik lov til at nå -0,2 cm i diameter (ca. 2 uger efter injektion), og derefter PORCN knockdown blev induceret ved tilsætning af doxycyclin til vandet. Efter induktion af doxycylin, var der en signifikant reduktion i væksten af ​​tumorer, der udtrykker enten SHP1- eller SHP2 (Figur 2E). Dette syntes at være dosisafhængig, som SHP1 producerede både en større knockdown af PORCN og en større reduktion i tumorvækst (figur 2C og E). Når kontrol- tumorerne nåede ~ 1 cm i diameter blev musene aflivet. Tumorer blev udskåret, vejet og målt. Tumorer var betydeligt mindre og lettere, hvis de indeholdt det inducerede SHP1- eller SHP2 shRNAmir (figur 2D). Disse resultater viser, at knockdown af PORCN mRNA i et etableret ortotopisk brystkræft resulterer i en betydelig forsinkelse i tumorvækst. , PORCN spiller således en afgørende rolle i MDA-MB-231 celledeling både i kultur, og i xenotransplantater.

Tab af PORCN påvirker kræft cellevækst i et Wnt-uafhængig måde

Ovenstående resultaterne viser, at knockdown af PORCN regulerer proliferation af flere brystcancercellelinier. Effekten på spredning skyldes ikke off-target effekter af RNAi, da vi opnåede identiske resultater med to uafhængige siRNAs og to ekstra uafhængige shRNAmirs mod i alt 4 forskellige regioner i PORCN. Vigtigt er, alle RNAi konstruktionerne var inden kodende sekvens indeholdt inden for hver af de fire humane PORCN splejsningsvarianter. Fordi virkningen af ​​PORCN knockdown ikke korrelerer stærkt med dets virkning på β-catenin-afhængige gener, såsom AXIN2, cyclin D, og ​​CMYC, overvejede vi muligheden for, at PORCN knockdown kan nedsætte cellevækst gennem en β-catenin uafhængig autokrin Wnt sløjfe eller alternativt at PORCN har nogle ekstra, Wnt-uafhængige funktioner. For at skelne mellem disse muligheder, vi hæmmede Wnt sekretion af yderligere to uafhængige tilgange.

Acylering af Wnts af PORCN er nødvendig for deres binding til transport protein, WLS, der bærer Wnts fra ER eller Golgi til plasmaet membran før sekretion [16]. Som sådan farmakologisk inhibering af acylering og tab af WLS både inhiberer Wnt sekretion beslægtet med PORCN knockdown [17], [18]. I det omfang vi kender til dato, alle pattedyr Wnts kræver både PORCN og WLS for sekretion. Som forventet siRNA knockdown af WLS og PORCN alle tilsvarende og effektivt hæmmede Wnt3a-drevet signalering (figur 3A). PORCN enzymatisk funktion kan inhiberes med lille molekyle inhibitor IWP-1 [14]. Svarende til publicerede resultater, fandt vi, at IWP-1 inhiberer Wnt-sekretion i mediet med en IC

50 af -200 nM (figur 3B). IWP-1 også effektivt inhiberer Wnt3a-drevet signalering i MDA-MB-231-celler fik lignende doser (figur 3C). Ved hjælp af disse alternative metoder, vi undersøgte konsekvensen af ​​faldet Wnt sekretion på kræft cellevækst.

A. WLS, β-catenin, og PORCN knockdown alle inhiberer Wnt /β-catenin signalering i STF3A celler. Følgende siRNA’er blev brugt ved 100 nM: for PORCN, siP7; for WLS, siW5; for β-catenin, siβC11. B. IWP-1 inhiberer Wnt3a sekretion. Konditioneret medium fra STF3A celler blev vurderet for Wnt3a som beskrevet efter cellerne blev inkuberet i 16 timer i nærværelse af den angivne koncentration af IWP-1. C. IWP-1 inhiberer Wnt3a-drevet signalering i MDA-MB-231-celler. MDA-MB-231-celler blev co-transficeret med Wnt3a og STF, og behandlet natten over med vehikel (DMSO) eller angivne doser af IWP-1. D. De angivne cellelinier blev enten transficeret med siRNA’er som ovenfor, eller behandlet med IWP-1 eller vehikelkontrol. Total celletælling på dag 6 blev vurderet som beskrevet og sammenlignet med ubehandlede celler. IWP-1 blev anvendt ved 2 uM og opdateres hver 24 timer. E. Western blot af WLS i MDA-MB-231-celler der stabilt udtrykker SHC, shW1, og shW5 shRNAs. F. WLS knockdown ikke bremse tumorvækst. MDA-MB-231-celler der stabilt udtrykker SHC, shW1, og shW5 shRNAs blev injiceret orthotopisk i nøgne Balb /c mus og tumorvækst overvåges som beskrevet. G. WLS besked niveauer i tumorer udvundet (E), vurderet ved QRT-PCR og normaliseret til actin.

overraskende, i modsætning PORCN knockdown, knockdown af WLS havde ringe eller ingen effekt på udbredelsen af enhver testet cancercellelinie, herunder MDA-MB-231, MCF7, DLD-1, SK-BR-3, T47D, og ​​HeLa-celler (figur 3D og data ikke vist). Ligeledes havde β-catenin knockdown ikke påvirke cellevækst i MDA-MB-231 eller MCF7-celler. Bekræfter effektiviteten af ​​knockdown, tab af β-catenin formindskede signifikant proliferation af DLD-1-celler, som har stabiliseret β-catenin grund af en mutation i adenomatøs polypose coli (APC) -gen (figur 3D). Den lille effekt af β-catenin knockdown på MDA-MB-231-celleproliferation i dette forsøg sås ikke i gentagne eksperimenter. Endvidere tilsætning af IWP-1 ved doser, der giver 80% reduktion af Wnt /β-catenin signalering havde ingen virkning på cellevækst eller levedygtighed MDA-MB-231, MCF7, og DLD-1 celler, linjer, der var følsomme over for både PORCN siRNA og shRNA (figur 3D). Vi har udvidet dette resultat til et panel af andre cancer cellelinjer og også fundet nogen effekter af IWP-1 eller relateret molekyle IWP-2 på cellevækst og levedygtighed (figur S2). Disse resultater viser, at blokade af Wnt sekretion med WLS knockdown eller IWP behandling ændrede ikke cancercelleproliferation og overlevelse, hvilket indebærer, at disse celler ikke er afhængige af autokrin Wnt signalering. Vigtigere er det, disse data tyder på, at tabet af PORCN derfor kan påvirke væksten i en Wnt uafhængig måde.

Tab af WLS påvirker ikke tumor tage eller vækst

På grund af den overraskende mangel på effekt af WLS knockdown i cellekultur, søgte vi at udvide dette resultat til en tumormodel. MDA-MB-231-celler blev stabilt transduceret med en af ​​to shRNA målrettet WLS (shW1 og shW5) eller en kontrol shRNA, (SHC). Begge shRNA målretning WLS gav en effektiv knockdown på mRNA ( 80%) og på proteinniveau (figur 3E). Disse celler blev injiceret orthotopisk i BALB /c nøgne mus og tumorprogression blev overvåget. Tumorer fra alle tre linjer udviste meget lignende sats (figur 3F). Når tumorerne nåede ~ 1 cm i diameter, blev de fjernet og bedømt for vedvarende WLS knockdown. Både shW1 og shW5 opretholdt en 60% knockdown af WLS i tumorer (figur 3G). , Mens WLS knockdown er effektiv, vedvarende og mindsker β-catenin signalering Det har således ingen virkning på MDA-MB-231 vækst- eller xenograft celle tumorer. Sammen med effekten af ​​PORCN knockdown på tumorvækst (Figur 2E), disse data yderligere støtter tanken om et Wnt-uafhængig rolle PORCN i kræft cellevækst

in vivo

Wild Type og mutant PORCN både redning vækst effekter

PORCN knockdown bremset kræft spredning, i modsætning til hæmning af PORCN enzymatisk aktivitet med det lille molekyle IWP-1. Dette paradoks antydede, at PORCN protein kan spille en påkrævet strukturel rolle i celler. For at bekræfte at tab af PORCN protein er ansvarlig for de observerede vækstvirkninger, søgte vi at redde denne fænotype ved anvendelse af et siRNA-immun version af muse PORCN-D. Ved anvendelse af en MSCV-3XHA-mærkede mPORCN-D-konstruktionen [4], anvendte vi steddirigeret mutagenese for at give immunitet over for siP7 siRNA. For at gøre katalytisk inaktiv PORCN, vi muterede H341, en invariant MBOAT katalytisk rest forudsagt at deltage i PORCN katalytisk aktivitet. Forsøg i flere PORCN-null cellelinier bekræftede, at mPORCN (H341A) er fuldstændig katalytisk inaktiv (figur 4E og data ikke vist). Desuden har PORCN (H341L) for nylig blevet vist at være katalytisk inaktiv i PORCN null ES-celler [13]. I transiente transfektioner blev PORCN mutant protein udtrykt på niveauer svarende til vildtype PORCN og virker i en dominant negativ måde, effektivt inhibere både Wnt sekretion og TCF-drevet luciferase ekspression i STF3A celler (figur S3, A-C). Brug af siRNA-immune versioner af disse konstruktioner, vi cotransficeret MDA-MB-231-celler med siP7 siRNA og viste det havde ingen effekt på overflod af ektopisk PORCN protein (figur 4A, øvre panel), hvilket bekræfter immunitet over for siP7 siRNA. MDA-MB-231 celler, der udtrykker vildtype mPORCN har øget Wnt3a-drevet STF aktivitet (figur 4B). Navnlig er MDA-MB-231 celler, der udtrykker H341A mPORCN reduceret Wnt3a-drevet β-catenin signaleringsaktivitet, konsistent med en dominant negativ funktion i MDA-MB-231-celler samt. Både vildtype og H341A PORCN co-lokalisere med calnexin (figur 4C), en ER markør [30], i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser PORCN lokalisering til skadestuen [4].

A. Western blot analyse af MDA-MB-231-celler transficeret med P7 immune konstruktioner af HA-mærkede WT og H341A PORCN. Den PORCN konstruktionen indeholder 2 yderligere tavse mutationer, som gør det immun over for P7 siRNA knockdown. EV, tomme vektor; WT, vildtype PORCN-HA; MT, H341A-PORCN-HA. B. Vildtype men ikke mutant PORCN stimulerer Wnt /β-catenin signalering. MDA-MB-231-celler blev co-transficeret med plasmider, der koder for WT og H341A-PORCN, Wnt3a, og SuperTOPflash reporter. H341A-PORCN har en betydelig dominant negativ effekt på Wnt /β-catenin signalering. C. Vildtype og mutant PORCN hensigtsmæssigt lokaliseret. Indirekte immunfluorescens mikroskopi blev udført med anti-HA-antistof og det endoplasmatiske reticulum markør calnexin. D. Vildtype og dominant negativ H341A PORCN er lige så effektive til at redde væksten defekt forårsaget af PORCN knockdown. MDA-MB-231 blev co-transficeret med P7 siRNA og PORCN ekspressionskonstruktioner som angivet. Celleantal blev målt som beskrevet.