PLoS ONE: Short-Term Resveratrol Eksponering Årsager in vitro og in vivo vækst hæmning og apoptose af blærekræft Cells

Abstrakt

Konventionelle adjuverende kemoterapi for blære overgangsordning celle karcinomer (TCCs) kan forårsage stærk systemisk toksicitet og lokal irritation. Ikke-giftige resveratrol hæmmer TCC cellevækst men dets gennemførlighed i kliniske behandling af TCCs forbliver uklar. Denne undersøgelse har til formål at evaluere sikkerheden og anti-TCC effekt af resveratrol, under anvendelse af de eksperimentelle modeller tættere på den kliniske behandling tilstand. Humane TCC EJ celler blev udsat for 100 pM, 150 pM og 200 pM resveratrol henholdsvis i 1 time og 2 timer for at efterligne intravesikal instillation lægemiddel og cellereaktioner blev analyseret ved flere eksperimentelle tilgange. En ortotopisk TCC nøgen musemodel blev etableret ved at injicere EJ celler i sub-urotelial lag og anvendt til kortvarig intravesikal resveratrol instillation. Sikkerheden af ​​resveratrol inddrypning blev evalueret og sammenlignet med den af ​​MCC. Resultaterne viste, at 2 timer 150 uM eller 200 uM resveratrol behandling blyholdig til bemærkelsesværdige S-fasen og apoptose ved 72 h time-point, ledsaget med svækket phosphorylering, nuklear translokation og transkription af STAT3, nedregulering af STAT3 nedstrøms gener (survivin, cyclinD1, c-myc og VEGF) og nukleare omplantninger af SIRT1 og p53. Betydningen af ​​STAT3 signalering i cellevækst blev bekræftet ved behandling EJ celler med JAK2 inhibitor tyrphostin AG490. Effekt og sikkerhed af resveratrol instillation blev bevist ved resultaterne fra nøgen mus ortotopisk xenograftmodeller, fordi denne behandling forårsagede væksthæmning, særprægede apoptose og STAT3 inaktivering af de transplanterede tumorer uden at påvirke normal urothelium. Vores resultater tyder således for første gang de praktiske værdier af resveratrol som en sikker og effektiv middel i den post-operative behandling af TCCs

Henvisning:. Wu ML, Li H, Yu LJ, Chen XY, Kong QY , Song X, et al. (2014) Short-Term Resveratrol Eksponering Årsager

In vitro

In vivo

Vækst hæmning og apoptose for blærekræft Cells. PLoS ONE 9 (2): e89806. doi: 10,1371 /journal.pone.0089806

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA

Modtaget: 26 august, 2013; Accepteret: 24 Jan 2014; Publiceret: 25 feb 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81.272.786, 30.971.038, 81.071.971 og 81.072.063) og forskning Fond for ph.d.-vejledere fra National Education Department of China (20122105110005). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den hyppigste malignitet i urinvejene, hvoraf 90% er overgangs- cellecarcinom (TCC). Transuretral resektion efterfulgt af intravesikal kemoterapi er den standard pleje af TCC patienter [1]. Gentagelse er den førende risiko for TCC patienter på grund af vanskeligheden radikalt fjerne aggressive tumorer [2]. Følgelig adjuvans-intravesikale kemoterapier bliver de store modeller til forebyggelse TCC tilbagefald. Bacillus Calmette-Guerin, interferon-α, cisplatin, mitomycin C (MMC) og deres kombinationer anvendes konventionelt i klinisk praksis, mens deres effektiviteter er variable [3], [4] og forårsager sædvanligvis stærk systemisk toksicitet og lokale komplikationer såsom hæmorrhagisk cystitis [2]. Det er derfor et presserende behov for at udforske mindre giftige og mere effektiv tilgang til bedre forvaltning af TCCs.

Resveratrol er blevet betragtet som en ikke-giftig polyphenolisk stof, der findes i druer, bær, jordnødder og rødvin [5 ]. En række beviser viser, at resveratrol er i stand til at hæmme væksten af ​​mange cancere, såsom leukæmi, brystcancer og primære hjernetumorer [6] – [8]. I tilfælde af blære kræft, resveratrol effektivt nedsætter cellernes levedygtighed og inducerer apoptose af humane og murine blære cancerceller [9] – [12]. Ikke desto mindre har den praktiske værdi af resveratrol i anti-TCC behandling ikke blevet behandlet af brug af mere klinisk relevant eksperimentel model (r), og i vejen for den lokale administration narkotika. I den aktuelle undersøgelse, human TCC cellelinie EJ [13], blev behandlet på kort sigt af resveratrol til at efterligne den kliniske lægemiddel instillation [14]. De cellulære og molekylære reaktioner af EJ celler til behandling blev analyseret ved flere fremgangsmåder. I mellemtiden blev en orthotopisk TCC nøgen musemodel etableret ved at injicere EJ celler i sub-urotelial lag og behandles ved resveratrol i lignende måde med intravesikal instillation lægemiddel [15]. De cellulære og molekylære reaktioner på disse behandlinger blev evalueret derefter.

Materialer og metoder

Cell Kultur og Behandlinger

Menneskelig TCC EJ celler [13] blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles essential medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco Life Science, Grand Island, NY, USA) under 37 ° C og 5% CO

2 betingelser. Cellerne (5 x 10

4 /ml) blev udpladet på dyrkningsskåle (Nunc, Danmark) og inkuberet i 24 timer før forsøgene

Resveratrol (Res;. Sigma Chemical, Inc, St. Louis , MO) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma) og fortyndet med dyrkningsmedium til de arbejdende koncentrationer umiddelbart før brug. Cellerne under normal kultur tilstand, behandlet med 0,2% DMSO og udsat for 100 um Res i 48 timer blev brugt som kontrol normalt, baggrund og effekt hhv. Som vist i diagrammet (figur 1A) blev EJ celler behandlet med 100 uM, 150 uM eller 200 uM Res i 1 time, 1,5 time eller 2 timer i 24 timers intervaller. Efter 1 time og 2 timers behandlinger, blev Res indeholdende medier erstattes med normalt medium på 3 vaske. Derfor blev EJ celler udsat for forskellige koncentrationer af Res til 3 gange (en gang om dagen) i løbet af 72 timer eksperimentet (figur 1A). Celleantal og levedygtighed blev kontrolleret 12 timers intervaller. De celle-bærende dækglas blev fikseret i kold acetone eller 4% paraformaldehyd (pH 7,4) i morfologiske og immuncytokemiske undersøgelser. De eksperimentelle grupper blev sat i tre eksemplarer og forsøgene blev gentaget tre gange for at etablere fortrolige konklusion.

A. Skematisk diagram af kortvarig in vitro resveratrol behandling. B. MTT-assay udført ved 72 timer efter behandlingerne viste, at kortvarig resveratrol eksponering faldt cellelevedygtighed og undertrykt EJ cellevækst i dosis- og tidsafhængig måde. * Sammenlignet med N-gruppe,

P

0,01; ** Sammenlignet blandt 100 uM, 150 uM og 200 uM Res-behandlede grupper på 1,5 time og 2,0 h,

P

0,01; #, Sammenlignet med 1 time 150 pM Res behandling,

P

0,05; $, Sammenlignet med 1 time 200 uM Res behandling,

P

0,05; ##, Sammenlignet med 1 time 100 uM Res behandling,

P

0,05.

∧, sammenlignet blandt 1,0 h, 1,5 time eller 2,0 h 100 um Res-behandlede grupper,

P

0,01; , sammenlignet blandt 1,0 h, 1,5 time eller 2,0 h 150 um Res-behandlede grupper,

P

0,01;

∧∧ sammenlignet blandt 1,0 h, 1,5 time eller 2,0 h 200 uM Res-behandlede grupper,

P

0,01. C. H ++), når mærkningen var stærkere eller tydeligt stærkere end (++). For immunfluorescensfarvning (IF), blev den celle, der bærer dækglas skyllet med phosphatpufret opløsning (PBS; pH 7,4) i 3 gange, blokeret med 10% gedeserum i PBS (pH 7,4) i 20 minutter, inkuberet natten over med primært antistof mod målprotein og endelig co-inkuberet med fluorescensmærket gede-anti-kanin eller kanin anti-mus IgG (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Inc) ved 37 ° C i 60 minutter i mørke. Kernerne blev mærket ved DAPI (blå fluorescens). De dækglas blev observeret og fotograferet under et fluorescens mikroskop (BX53F, Olympus, Japan).

Protein Forberedelse og vestlige Blotting

I alt cellulære proteiner blev fremstillet af cellerne under forskellige dyrkningsbetingelser [20] . Prøven proteiner (50 ug /brønd) blev adskilt i 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidendifluorid-membran (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membranen blev blokeret med 5% skummetmælk i TBS-T (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCI og 0,5% Tween 20) ved 4 ° C, skyllet 10 minutter til tre gange med TBS-T, efterfulgt med 3 timers inkubation ved stuetemperatur med det første antistof og derefter 1 times inkubering med HRP-konjugeret anti-muse eller anti-kanin IgG (Zymed Lab, Inc). Det bundne antistof blev påvist under anvendelse af forøget kemiluminescens-systemet (Roche GmbH, Mannheim, Tyskland). Efter fjernelse af signalet mærkning ved inkubation med stripning buffer [8], blev membranen genprobet med andre antistoffer én efter én, indtil alle parametre blev undersøgt.

hæmning af STAT3 Aktivering med AG490

JAK2-specifik inhibitor AG490 (Sigma) [21] blev opløst i DMSO og fortyndet til de endelige koncentrationer på 50 uM og 80 uM med dyrkningsmedium. Fire forsøgsgrupper blev fastsat som følger: Group1, normal kultur; Gruppe 2, behandling med 1,2 ‰ DMSO som baggrund kontrol; Gruppe 3 og 4, behandling med 50 pM eller 80 pM AG490. Virkningerne af AG490 på celleproliferation blev bestemt ved MTT, flowcytometri og dækglas-baserede morfologisk og ICC farvning for STAT3, p-STAT3, cyclinD1, survivin, c-Myc og VEGF. RNA og protein blev fremstillet fra alle grupper til RT-PCR og Western blot-analyser.

Etik Statement

Forud for dyreforsøg, blev forskningsprotokoller revideret og godkendt af Animal Care og brug Udvalg af Dalian Medical University. Alt arbejde, der involverer forsøgsdyr blev udført i fuld overensstemmelse med NIH (National Institutes of Health) Retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle forsøg blev udført under chloralhydrat anæstesi og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

ortotopisk TCC Model og Intravesikal Behandling

BALB /c-nøgne mus (4 uger, 14-16 g kropsvægt) blevet rejst under SPF (SPF) betingelser. For etablering ortotopisk blærekræft model [22], blev mus bedøvet intraperitonealt med 3,5% chloralhydrat (0,1 ml /10 g mus legemsvægt) [23]. Tilstanden af ​​anæstesi blev evalueret ved tab af balancerefleks (LORR), og tid til at inducere LORR var normalt mellem 5-10 minutter. I germfree isolator blev musene urinblærer eksponeret gennem en lav midtlinjeincision; 20 pi EJ cellesuspension (1 x 10

6 celler) blev injiceret i sin sub-epitellaget og fremkomsten af ​​”semitransparente bobler” angivet vellykket inokulering. Tre dage senere blev musene tilfældigt inddelt i to grupper (10 mus /gruppe) og behandlet med 50 pi 200 pM resveratrol eller 50 pi 0,9% NaCl i to-dages intervaller. Efter urin evakuering blev en 24-gauge Teflon-belagt kateter indføres i lumen af ​​blæren. For at undgå flydende lækage, blev kateteret fastgjort med sprøjten holdes på plads i 40 minutter. Alle musene blev bedøvet sikkert og sædvanligvis udvundet fra anæstesi efter 2 timer. Ved udgangen af ​​28 dage eksperimentet blev de hele blærer høstet, vejet og derefter udsat for histologisk og immunohistokemiske (IHC) undersøgelser. Apoptose blev registreret af TUNEL-analysen og dens indekser blev opnået ved at tælle TUNEL-positive celler versus over 1000 observerede celler i tumor sektioner [24].

Evaluering af lokal irritation og systemisk toksicitet

5 uger gamle ICR hunmus (5 mus /gruppe) blev intravesikalt behandlet med 50 ul 200 uM resveratrol. Behandlingen blev udført i 6 gange i 2 dages intervaller. Musene behandlet med 50 pi 2 mg /ml MMC (Sigma-Aldrich, opløst i 0,9% NaCl) [25] i den samme administration måde blev nævnt som kontrol. Ved udgangen af ​​behandlingerne blev legemsvægt talt og svaret (s) af blære væv til behandlingerne blev undersøgt i form af slimhinde integritet, kapillær overbelastning og blødning.

Statistisk analyse

forskellene i kontinuerlige variabler blev vurderet ved Student

t

test eller envejs ANOVA. Statistisk signifikans blev defineret som

P

. 0,05

Resultater

Kortfristet Resveratrol Behandling Fortrængte TCC Cell Growth

MTT assay viste, at EJ celle væksten blev undertrykt af kortsigtede resveratrol behandlinger i dosis- og tid-relaterede mode (Figur 1B). H /E-farvning og TUNEL assay viste hyppige apoptotisk død i 2 timer 150 uM og 200 uM Res-behandlede grupper (figur 1C). Flowcytometri viste, at 2 timer 150 um og 200 um Res behandlinger forårsaget af S-fasen og apoptose i EJ cellepopulationer. Som vist i figur 1D, G1 og S fraktioner af EJ-celler var 62,6% og 33% i normalt dyrkede celler, som ændret til 23,9% og 76,1% i 2 timer 150 uM Res behandlet og 17,7% og 82,3% i 2 timer 200 pM Res behandlede populationer, hhv. Procentdelen af ​​apoptose i normalt dyrkes, 2 timer 150 uM restaurationsvirksomhed og 200 uM Res-behandlede grupper var 0,394%, 4,98% og 11,4% på 72 timer tidspunkt (Figur 1D). Væksten af ​​EJ celler blev effektivt hæmmet af den konstante behandling af 100 uM resveratrol.

Resveratrol Hæmmet STAT3 Transskription og aktivering

På grund af de kritiske roller aktiveret STAT3 signalering i blæren TCC celler [26 ], blev virkningen af ​​resveratrol på STAT3 signalering i EJ cellerne analyseret ved RT-PCR under anvendelse af RNA-prøver ekstraheret fra EJ celler uden og med Res behandling. Som vist i figur 2A, blev STAT3 udtrykt i normalt dyrkede EJ celler og nedreguleres efter 2 timer 200 pM Res behandling i 72 timer. ICC-farvning udført på de samme forsøgsgrupper viste stærk STAT3-farvning ( ++) i enten cytosoliske rum eller kerner af normalt dyrkede EJ-celler, som tilsyneladende svækket (+) efter 72 timers 2 timer 200 pM Res behandling (figur 2B; tabel 2). Det blev også fundet, at p-STAT3 hovedsagelig blev lokaliseret i kernerne i EJ celler og blev formindsket efter 2 timer 200 pM Res behandling i 72 timer (figur 2B; tabel 2). I overensstemmelse med resultaterne af RT-PCR og ICC, udviste Western blotting, at 2 timer 200 pM Res behandling forårsagede tydelig STAT3 og p-STAT3 reduktion (figur 2C). For yderligere at belyse effekten af ​​2 h Res behandling på STAT3 signalering, niveauerne af STAT3 nedstrøms gener (c-myc, survivin, cyclinD1 og VEGF) i normalt dyrket og 2 h 200 um Res behandlede EJ celler blev undersøgt ved de ovenfor beskrevne metoder . Som vist i figur 2 blev ekspressionen af ​​c-Myc, survivin, cyclinD1 og VEGF undertrykt i 2 timer 200 uM Res-behandlede EJ celler (tabel 2). Lignende resultater kunne også påvises i EJ celler konstant behandlet med 100 uM resveratrol i 48 timer.

inhibitoriske virkninger af AG490 på EJ Celler

For at bestemme betydningen af ​​resveratrol -forårsaget STAT3 inhibering, AG490, en selektiv inhibitor af STAT3 phosphorylering, blev anvendt til behandling EJ celler [21]. Immuncytokemisk farvning viste, at STAT3 fosforylering blev hæmmet i AG490-behandlede celler i form af reduktion af STAT3 og p-STAT3 nuklear mærkning (Figur 3; Tabel 2). Spredningen af ​​EJ celler blev undertrykt af AG490 i dosis- og tid-relaterede mode (figur 4A). Flowcytometri analyse viste, at 48 timer 50 uM og 80 uM AG490 behandlinger forårsaget af S-fasen uden at inducere særskilt apoptose. G1 og S-fraktioner var 62,6% og 33% i normalt dyrkes, 50,4% og 49,6% i 50 uM AG490 behandlede og 17,9% og 75,7% i 80 uM AG490 behandlede EJ celler (figur 4B). Disse resultater er i konsistens med de kortsigtede resveratrol behandlinger. Procentdelene af apoptose i normalt dyrkes, 50 uM AG490- og 80 uM AG490-behandlede grupper ved 48 h tidspunkt var 0,394%, 0,194% og 1,77% henholdsvis (figur 4B). I sammenligning med normalt dyrkede EJ celler, c-Myc, cyclinD1, survivin og VEGF udtryk blev nedreguleret i AG490-behandlede celler (figur 3, figur 4C og D, Tabel 2).

A . MTT celleproliferationsassay udført på normalt dyrkede EJ celler og cellerne med AG490 (50 um og 80 um) og konstante 100 uM resveratrol behandlinger. *,

P

0,01; **,

P

0,05. B. Flowcytometri bestemmelse af cellecyklusfordeling og apoptose i AG490 behandlet EJ cellepopulation. C og D. Evaluering af p-STAT3, cyclinD1, survivin, c-myc og VEGF-niveauer i EJ celler uden og med 50 uM eller 80 uM AG490 behandlinger ved RT-PCR og Western blot-analyser.

Intravesikal Resveratrol Behandling Hæmmet ortotopisk tumorvækst

H /E-farvning blev udført på de inokulerede steder og bekræftede, at den vellykkede sats af ortotopisk tumorimplantation var 100% (20/20). Det skematiske diagram af intravesikal resveratrol behandling og doseringsplan blev vist i figur 5A. Tumoren byrder blev bestemt ved at veje hele blærer høstet fra alle grupper [27], der afslørede den større gennemsnitlige blære vægt i NaCl-behandlet kontrolgruppe end i resveratrol-behandlede gruppe (0,03362 g vs 0,01625 g,

P

0,01, figur 5B og C). TUNEL-assay udført på ortotopisk tumorprøver med og uden kortsigtet resveratrol instillation demonstrerede bemærkelsesværdig apoptotisk død (apoptotisk indeks = 23,2%) i de førstnævnte tilfælde (figur 5D og E). Immunohistokemisk farvning viste, at STAT3, p-STAT3 og dens downstream gener c-myc, cyclinD1, kunne påvises survivin og VEGF i enten cytoplasmaet eller kernerne i tumorvæv i NaCl kontrolgruppen, men blev tilsyneladende reduceret i resveratrol-behandlede tumorer (Figur 6 ;. tabel 2)

A. Skematisk diagram over studiedesign og dosering. Behandlinger begyndte 3 dage efter implantation (asterisker). B. Øvre: urethrae kateterisation af nøgne mus; Nedre: størrelsen af ​​et par af tumorbærende urinblærer uden og med 2 timer 200 uM resveratrol intravesikal instillation til 13 gange. C. Sammenligning af tumor byrder mellem resveratrol instillation gruppe og den ubehandlede kontrol på dag 28 efter tumor implantering. Normal nøgne mus (de samme uger gamle) blærer fri for tumorimplantation som kontrol. * Sammenlignet med N-gruppe eller Res gruppe,

P

0,01; #, Sammenlignet med N-gruppe,

P

0,05. D. H Kontrol: blæren bærende orthotopisk transplanterede tumor uden resveratrol behandling (0,9% NaCl behandling); Res: blæren bærende orthotopisk transplanterede tumor med 200 pM resveratrol behandling i 2 timer og 13 gange. E. Evaluering af apoptotiske indekser blandt Normal, Kontrol og Res grupper

H . E og immunhistokemiske farvninger af STAT3, p-STAT3, cyclinD1, survivin, c-myc og VEGF i blære vævsprøver de behandlet med 0,9% NaCl (kontrol) eller 200 uM resveratrol (Res) i to timer og 13 gange. Mellemværker, de forstørrede billeder af tumorvæv.

Kortsigtet Resveratrol Behandling fremmet Nuclear translokation af SIRT1 og p53

Resveratrol er kendt som en aktivator af tavs parring typen information regel 2 homolog (SIRT1), der modulerer p53-aktivitet ved deacetylering [28], [29]. Derfor blev in vitro og in vivo påvirkninger af resveratrol på SIRT1 aktivitet EJ celler undersøgt ved metoderne til ICC, IHC og IF. Som vist i figur 7, blev både SIRT1 og p53 fordelt i cytosolisk rum af EJ-celler og transplanterede tumorer uden resveratrol behandling, som tilsyneladende blev translokeres ind kernerne i EJ celler efter in vitro 2 timer 200 pM Res behandling ved 72 h time-point og 2 h intravesikal resveratrol instillation til 13 gange, hvilket tyder på potentiel funktionel sammenhæng af disse to proteiner.

A. Evaluering af SIRT1 og p53 fordeling i normalt dyrkede EJ celler og celler behandlet med 2 pM resveratrol ved 72 h tid-punkt ved immuncytokemiske og immunofluorescens farvninger (indsatsene). B. SIRT1 og p53 orienteret immunhistokemisk farvning af blæren væv behandlet med 0,9% NaCl (kontrol) eller 200 uM resveratrol (Res) i to timer og 13 gange. Mellemværker, de forstørrede billeder af tumorvæv.

Ingen Indlysende lokal irritation af Resveratrol-behandlede Blære slimhinde

Intravesikal resveratrol instillation blev udført på både kvindelige tumor-fri ICR mus og den kvindelige tumorbærende nøgne mus. Ved slutningen af ​​forsøget blev de hele blærer fjernet og fikseret i 10% neutral pufret formalin for H /E-farvning-baserede cystitis undersøgelse. Som vist i figur 8A, overgangs- epiteler af urinblæren vægge var intakte, og hverken distinkt kapillar overbelastning eller inflammatorisk lymfocytinfiltrering blev observeret i sub-mucosale rum af resveratrol-behandlede cancer-fri ICR-mus. Lignende situation blev også fundet i tumoren omgivende blære væv af tumorbærende nøgne mus behandlet som intravesikal instillation resveratrol (data ikke vist). I modsætning hertil kunne alvorlig epitelbeskadigelse, kapillær overbelastning og blødning observeres i MMC-behandlede urinblærer af ICR-mus (figur 8A). Den tydelige kropsvægt tab blev fundet i MMC-behandlede gruppe (18,1 g i gennemsnit) i sammenligning med i Res-behandlede gruppe (27,2 g i gennemsnit;

P

0,01, figur 8B og 8C).

NaCl, ICR mus behandlet som intravesikal instillation af 0,9% NaCl; Res, 200 uM resveratrol; MMC, 2 mg /ml mitomycin C. Disse behandlinger blev udført til 6 gange i 2 dages intervaller. Alvorlig epitelial skade, kapillær overbelastning og blødning kunne iagttages i MMC-behandlede, men ikke i NaCl og Res-behandlede blærer. Mellemværker, høje forstørrelse billeder af pil-angivet urothelial regioner. *

P

. 0,01

Diskussion

Transitional celle karcinom i urinblæren /TCC er ansvarlig for mere end 130 000 årlige dødsfald på verdensplan [30] skyldes i høj grad til tilbagefald og metastaser [2]. Intravesikal administration af anticancer midler er blevet vedtaget at udrydde tilbageværende tumorceller [3], [4]. Imidlertid kan disse konventionelle behandlinger ikke længe på grund af systemisk toksicitet og lokal irritation [2]. Da resveratrol er ugiftig [5] og udøver hæmmende på TCC celler [9] – [12], ville det være et alternativ kandidat til forvaltningen af ​​TCCs hvis dens anti-TCC kapacitet kan yderligere bevist under de eksperimentelle betingelser tættere til de kliniske status. For at efterligne intravesikal stof instillation blev de dyrkede EJ TCC celler behandlet med 100 uM, 150 uM eller 200 uM resveratrol forbigående stedet for hele tiden. Resultaterne viste klart, at 150 pM og 200 pM resveratrol behandlinger for 1,5-time eller 2 timer var tilstrækkelig til at undertrykke vækst og inducerer apoptose af EJ-celler, hvilket antyder, at kortvarig resveratrol behandling kunne opnå lignende anti-TCC effekter som for konventionelle narkotika [14]. Dette blev yderligere understøttet af den nedregulering af STAT3 og STAT3 målgenekspression og reduktion af p-STAT3 nuklear translokation i resveratrol-behandlede EJ celler, fordi aktiveret STAT3 signalering var forbundet med TCC cellevækst og overlevelse [26]. Disse lovende in vitro resultater tilskynde os til at vidne om kortsigtede resveratrol instillation også kan føre til lignende terapeutisk konsekvens i et passende ortotopisk xenograftmodel.

Selvom anti-cancer effekter af resveratrol er blevet dokumenteret, denne agent har ikke endnu ikke anvendt på klinisk praksis i høj grad skyldes den lave intracellulære biotilgængelighed af systemisk administreret resveratrol [31], [32]. I modsætning faste tumorer i flertal af organer, TCCs vokser udad til blæren hulrum. Endvidere kan den indpodet lægemiddel let tilbageholdes i blæren og gælder udøver sine virkninger på tumoren væv /celler. Derfor er en ortotopisk xenograftmodel blev etableret i nøgne mus urinblære, som derefter blev behandlet ved resveratrol i de samme doser som for in vitro forsøg og på den måde ens med klinisk praksis [14]. Det blev konstateret, at tumorvækst bemærkelsesværdigt blev undertrykt og tumorceller gennemgik omfattende apoptose. Da forsøget blev udført på tumorerne inde i blæren, de opnåede resultater var tættere på patienternes virkelighed og ville derfor være af translationelle værdier.

En af de alvorlige bivirkninger ved intravesikal kemoterapi med konventionel lægemidler mod cancer er hæmoragisk cystitis [33]. Selv om den ikke-toksicitet af resveratrol til normale celler er blevet beskrevet i nogle organer [32], effekten (er) af resveratrol på normalt urinblære væv forbliver ukendt. Derfor blev en effektiv anti-TCC dosis af resveratrol (200 uM) indpodet i blærer af kræft-fri mus og sammenlignet med den behandlet med 2 mg /ml mitomycin C. I mellemtiden svaret (s) af transplanterede tumorer og deres omgivende slimhinde til resveratrol blev sammenlignet. Vi fandt, at både kræft-fri og tumor-omkringliggende slimhinde viste næsten intakt overgangsordning epitel uden tydelig kapillar overbelastning og inflammatorisk lymfocytinfiltration, mens alvorlig irritation og epithelskade sket med mitomycin C-behandlede slimhinde. Vores data giver således in vivo tegn på kræft-targeting egenskab af resveratrol i urinblæren og videre tyder egnethed resveratrol i klinisk behandling af humane TCCs.

Resveratrol besidder mangesidet molekylære virkninger, herunder hæmning af STAT3 signalering [20 ] og aktivering af SIRT1 deacetylering [28]. STAT3-aktivering er hyppige i TCCs og dets inhibering kan føre til vækststandsning og apoptose [26]. Vi fandt, at STAT3 signalering aktiveres også i EJ TCC celler og kort sigt in vitro og in vivo resveratrol behandlinger kan inhibere STAT3-aktivering og nedregulere ekspressionen af ​​STAT3 og dens downstream cancerassocierede gener. Disse resultater sammen med de tilsvarende resultater fra andre typer af kræft [20], [32], [34] tyder på, at STAT3 er en stor molekylære mål af resveratrol. Den undertrykte vækst i AG490-behandlede EJ celler støtter yderligere de kritiske roller aktiveret STAT3 signalering i fremme TCC celleproliferation. Manglen på apoptotisk død i AG490-behandlede EJ population viser, at resveratrol kan ændre andre celleoverlevelsestilstande machineries ud STAT3 signalering. Hidtil er fortsat uklar rolle SIRT1 i TCC dannelse og progression. I denne undersøgelse er SIRT1 nukleare translokation mundtligt med resveratrol-behandlede EJ celler, parallel med p53 nukleare translokation. Det er blevet rapporteret, at SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​SIRT1 aktivitet [35]. Desuden kan aktiveres SIRT1-p53 pathway fremkalde senescens-lignende vækst anholdelse af cancerceller [36]. Vores resultater giver således en cue til at udforske yderligere anti-TCC mekanisme resveratrol og at belyse de biologiske konsekvenser af nuklear co-translokation af SIRT1 og p53 proteiner.

I konklusionerne, sikkerhed og effekt af resveratrol i klinisk behandling af blære TCCs er blevet valideret her ved kort udsætte dyrkede humane TCC EJ celler og ortotopisk transplanterede tumorer til resveratrol. To timer 200 pM resveratrol behandling er tilstrækkelig til at undertrykke in vitro og in vivo vækst og til induktion distinkt apoptose af EJ-celler, antagelig ved hæmning af STAT3-aktivering og induktion af SIRT1 og p53 nuklear translokation. Desuden resveratrol hverken udøver skadelige virkninger på normale urothelial celler heller forårsager blære hæmoragisk cystitis og krop vægttab.