PLoS ONE: Screening af Drug enzymer til Ginsenoside Compound K in vitro: En effektiv anti-kræft stoffer, der hidrører fra Panax Ginseng

abstrakt

Ginsenoside forbindelse K (CK), en sjælden ginsenoside stammer fra

Panax Ginseng

, har vist sig at have unikke farmakologiske aktiviteter, der specifikt som anti-kræft. Men den rolle af cytochrom P450 (CYP’er) i metabolismen af ​​CK er uklar. I denne undersøgelse, vi screenet de CYP’er for metabolismen af ​​CK

in vitro

anvendelse af humane levermikrosomer (HLM’er) eller humane rekombinante CYP’er. Resultaterne viste, at CK inhiberede enzymaktiviteterne fra CYP2C9 og CYP3A4 i HLMS.

K

m

V

max

værdier af CK var 84.20 ± 21.92 uM og 0,28 ± 0,04 nmol /mg protein /min, henholdsvis for HLMS; 34,63 ± 10,48 uM og 0,45 ± 0,05 nmol /nmol P450 /min, henholdsvis for CYP2C9; og 27.03 ± 5,04 uM og 0,68 ± 0,04 nmol /nmol P450 /min, henholdsvis for CYP3A4.

IC

50

værdier var 16.00 uM og 9,83 uM og

K

jeg

værdier var 14.92 uM og 11,42 iM for CYP2C9 og CYP3A4, hhv. Andre humane CYP-isoformer, herunder CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 og CYP2C19 viste minimal eller ingen effekt på CK stofskifte. Resultaterne antydede, at CK var et substrat og også inhibitorer til både CYP2C9 og CYP3A4. Patienter, der anvender CK i kombination med terapeutiske lægemidler, som er substrater for CYP2C9 og CYP3A4 af forskellige årsager skal være forsigtig, selv om hæmmende styrken af ​​CK er langt fattigere end for enzym-specifikke hæmmere

Henvisning:. Xiao J, Chen D, Lin XX, Peng SF, Xiao MF, Huang WH, et al. (2016) Screening af Drug enzymer til Ginsenoside Compound K

In Vitro

: En effektiv anti-kræft stoffer, der hidrører fra

Panax Ginseng

. PLoS ONE 11 (2): e0147183. doi: 10,1371 /journal.pone.0147183

Redaktør: Olorunseun Ogunwobi, Hunter College of The City University of New York, USA

Modtaget: 23. maj 2015; Accepteret: December 30, 2015; Publiceret: 4 Februar 2016

Copyright: © 2016 Xiao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Scientific Foundation of China (Tilskud 81302850, 81.300.204, 31.400.306); Kina Postdoc Science Foundation (Tilskud 2013M531817, 2014T70793); og Videnskab og Teknologi Plan Projekter af Hunan-provinsen (Grant 2014RS4011)

Konkurrerende interesser:. Takket være Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited (Zhejiang, Kina) varetagelse af Ginsenoside sammensatte K. medicinalfirma havde ikke en rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Introduktion

Panax Ginseng

er en komplementær og alternativ medicin ( CAM), der har mange farmakologiske aktiviteter, såsom at opretholde fysisk vitalitet og øge modstanden mod stress og aldring [1].

Panax Ginseng

er meget udbredt i klinikker for forebyggelse af kræft, erektil dysfunktion, og forbedrede fysiske funktioner, blandt andre [2]. De vigtigste aktive bestanddele af

Panax Ginseng

er ginsenosides, og til dato har mere end 150 naturligt afledte ginsenosides opnået fra

Panax Ginseng

[3]. De vigtigste bestanddele omfatter mere end 80% af indholdet i

Panax Ginseng

er RB1, Rb2, Rc, RG1, og Re. Resten er kendt som sjældne ginsenosides, som udgør kun en lille del af de samlede saponiner, og de har unikke farmakologiske aktiviteter [4].

Ginsenoside forbindelse K (CK), eller 20-O-p- (D-glucopyranosyl) -20 (S) -protopanaxadiol (Den molekylære struktur er vist i figur 1), er naturligt til stede. Det tilhører den sjældne ginsenoside, som er forvandlet fra ginsenosideRb1 og Rb2 af tarmbakterier [5]. Ginsenosides absorberes dårligt fra tarmen, mens deres metabolit CK absorberes. Som den endelige form, CK spille en farmakologisk rolle har forårsaget stigende interesse. CK kan modstå alle former for tumorceller og fremme celleapoptose, såsom colorektale cancerceller, gastriske cancerceller, lungecancerceller og myelomatose [1, 6, 7]. CK forøger modstanden mod immunitet funktion at udvide transplantatet overlevelsestid i hjertetransplantation, har en anti-inflammatorisk funktion, modstår ældning af huden, og beskytter myokardiet [1, 8].

Den unikke biologiske aktivitet af CK har tiltrukket meget opmærksomhed, og derfor har den en bred anvendelse udsigten. Den nuværende anvendelse af CAM ved patienter er stigende [9]. Samtidig brug af CAM og terapeutiske lægemidler kan føre til alvorlige sikkerhedsproblemer i patienter. CAM har potentiale til at forårsage farmakokinetiske interaktioner med terapeutiske lægemidler. Det kan enten øge eller mindske plasmaniveauerne af terapeutiske lægemidler og resultere i uventede toksiciteter eller reduceret effekt [10].

De fleste farmakokinetiske CAM-lægemiddelinteraktioner involverer lægemiddelmetaboliserende cytochrom P450 (CYP) enzymer [11, 12] . De CYP’er er en stor familie af narkotikarelaterede enzymer, der spiller en afgørende rolle i fase I lægemiddelmetabolisme. Desuden er de fleste af de endogene og exogene stoffer er substraterne ifølge CYP’er. De store CYP’er involveret i metabolismen af ​​de fleste lægemidler er CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP2C19 og CYP3A4, som tegner sig for mere end 90% af metabolismen af ​​endogene og eksogene stoffer [13].

CK er en af ​​de hyppigst anvendte CAM for mange sygdomme i klinikker. Som samtidig administration ikke kan undgås, hvordan man kan forhindre CK-drug interaktioner er blevet et vigtigste spørgsmål blandt patienter. At give rationelle råd til brugen af ​​narkotika, vi undersøgte CYP-enzymer, der er ansvarlige for metabolismen af ​​CK i nærværende undersøgelse.

Metoder

Enzymer og kemikalier

Enzymerne og kemikalier ware fremstillet ifølge vores tidligere undersøgelse med visse ændringer [14]. Puljet humane levermikrosomer, rekombinante humane CYP-enzymer, og NADPH blev indkøbt fra Cypex Ltd. (UK) og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Ginsenoside sammensatte K (CK, C

36H

62O

8, MW: 622,873, assay≥99.2%, Lot: P1201-1) blev leveret af Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited (Zhejiang, Kina). Furafylline, tranylcypromin, ketoconazol, sulfaphenazol, quinidin, chlormethiazol hydrochlorid, og ticlopidinhydrochlorid blev købt fra National Institutes for Food and Drug Kontrol (Beijing, Kina). Phenacetin, coumarin, midazolam, tolbutamid, S-mephenytoin, metoprolol, chlorzoxazon, og standarderne for deres metabolitter, herunder acetaminophen, 7-hydroxyl coumarin, 1-hydroxyl midazolam, 4-hydroxyl tolbutamid, 4-hydroxyl mephenytoin, α-hydroxyl metoprolol , 6-hydroxyl chlorzoxazon, og irbesartan (intern standard), blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Shanghai, Kina). Alle andre kemikalier og opløsningsmidler var af højtydende væskekromatografi (HPLC) kvalitet.

Apparatur og driftsbetingelser

Koncentrationerne af CYP substrater og deres metabolitter blev kvantificeret i henhold til den metode, rapporteret i vores tidligere undersøgelse med visse ændringer [14]. En Waters 2695 adskillelse modul HPLC-system koblet til en Quattro micro

™ API tredobbelt kvadrupol tandem massespektrometer (Waters Corp., Milford, Massachusetts, USA) med en elektrospray ionisering kilde blev brugt. Prøverne blev separeret på en HyPURITY C

18 søjle (150 mm x 2,1 mm, 5 um, Thermo, USA). De mobile faser bestod af 20 mM ammoniumformiat og acetonitril i et forhold på 60:40. Aliquoter af 20 pi blev injiceret ved en mobil fase strømningshastighed på 0,3 ml /min. Multipel reaktion overvågning blev udført i positiv modus, undtagen CK, der blev gennemført i negativ modus (moderion m /z 621,4 til datterion m /z 160,8). De andre overgange var de samme som dem, der rapporteres i vores tidligere undersøgelse [14]. Massen spektre af de dannede metabolitter i inkubationerne var identiske med de tilsvarende autentiske standarder.

Generelt inkuberingsbetingelser

Metoden blev udført i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse med visse ændringer [14] . CYP-isoform-specifik probe anvendte reaktioner var phenacetin O-deethylering (for CYP1A2), coumarin 7-hydroxylering (for CYP2A6), tolbutamid 4-hydroxylering (for CYP2C9), metoprolol α-hydroxylering (for CYP2D6), chlorzoxazon 6-hydroxylering ( for CYP2E1), S-mephenytoin 4-hydroxylering (for CYP2C19), og midazolam 1-hydroxylering (for CYP3A4). Den kinetiske undersøgelse af CK blev udført med HLM’er. En 0,2 ml inkubationsblandingen, der bestod af CK (som et substrat), HLMS (0,5 mg /ml) eller CYP-isoformer (10 pmol), og 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,4) blev forvarmet i 5 minutter ved 37 ° C. Reaktionen blev initieret ved tilsætning af 1 mg /ml triphosphopyridine nukleotid (NADPH). Alle reagenser blev opløst i methanol, og slutkoncentration opløsningsmidlet i alle inkubationer (inklusive kontrolgruppen) var 1%. De endelige inkubationer blev udført i et rystevandbad (37 ° C) i 30 min. Reaktionerne blev stoppet ved tilsætning af 0,2 ml iskold acetonitril, som indeholder irbesartan (114,9 ng /ml) som den interne standard. Prøverne blev vortexet i 5 min. Efter centrifugering (12000 x g i 10 min) blev supernatanterne overført, og alikvoter af 20 pi blev injiceret i HPLC-MS /MS-system til analyse.

Kinetisk analyse af CK

de kinetiske parametre for metabolismen af ​​CK blev bestemt ved at inkubere stigende koncentrationer af CK (10-100 uM) ved 37 ° C med HLMS og NADPH under de inkubationsbetingelser som beskrevet detaljeret tidligere [14]. Ligningen af ​​CK reaktionshastighed (

V

) i HLM’er eller CYP-isoformer udtrykkes som

V = (C

0

C

t

) /Kreis T

/C

s

, hvor

C

0

C

t

er de indledende og afsluttende koncentrationer af CK i inkubationstiden løsning henholdsvis T er inkubationstiden (min), og

Cp

er proteinkoncentrationen (mg /ml eller nmol). Alle værdier blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Den gennemsnitlige intrinsic clearance rate (

CL

int

) for

in vitro

inkubation blev estimeret ved hjælp af

V

max

/K

m

.

specifikke CYP isoformer screenet for CK stofskifte

for at screene specifikke CYP isoform ansvarlig for CK metabolisme, bestemte vi den inhiberende virkning af specifikke inhibitorer på metabolismen af ​​CK i HLMS som beskrevet detaljeret tidligere [14]. Hæmmere, herunder furafylline (for CYP1A2), tranylcypromin (for CYP2A6), sulfaphenazol (for CYP2C9), quinidin (for CYP2D6), chlormethiazol (for CYP2E1), ticlopidin (for CYP2C19), og ketoconazol (for CYP3A4) blev separat inkuberet med CK ( 50 uM), de HLM’er, og NADPH under de samme inkuberingsbetingelser som nævnt above.The koncentrationer af hæmmere bruges var omtrent på deres respektive

IC

50

værdier i henhold til tidligere rapporter [15-18]. De inhiberende virkninger af de ovennævnte specifikke inhibitorer på den metaboliske clearance rate af CK blev vurderet separat at screene CYP-isoformer er ansvarlige for CK metabolisme. Den relative aktivitet af CYP-isoformer blev beregnet ved at dividere toparealet af CK når inkuberet med inhibitoren ved den af ​​CK fra de negative kontroller.

Inhiberingsundersøgelser på

IC

50

beslutsomhed

CK (10-100 uM) og en enkelt CYP isoform-specifikt substrat (med en koncentration svarende til den tilsvarende

K

m Drømmeholdet værdi) blev anvendt til at bestemme den inhibitoriske virkning af CK på specifikke CYP-isoformer som beskrevet detaljeret tidligere [14]. Substrater, herunder phenacetin, coumarin, tolbutamid, metoprolol, chlorzoxazon, S-mephenytoin, og midazolam blev anvendt i koncentrationer på 10, 5, 100, 7,5, 40, 100, og 5 uM. Alle inkubationsbetingelser var de samme som nævnt ovenfor. De hæmmende på CYP-isoformer blev undersøgt individuelt ved at inkubere HLM’er i fravær eller tilstedeværelse af CK. Inkubationstiden løsning med opløsningsmidlet, der blev brugt til at opløse CK blev betragtet som den negative kontrol, og opløsninger, der indeholder de specifikke inhibitorer, der er nævnt ovenfor, blev anset for de positive kontroller.

Bestemmelse af

K

i

i

IC

50

beslutsomhed eksperimenter, CK markant hæmmet CYP2C9 og CYP3A4, hvorimod dens virkning på CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 og CYP2C19 var minimal. Derfor blev Dixon plots til inhibering af CYP2C9 og CYP3A4 bestemt ved at inkubere substratet probe ved flere koncentrationer med eller uden test hæmmer med HLMS og cofaktorer. De hæmning data fra pilotforsøg de blev brugt som en guide til at generere de passende sonde substrat og test inhibitorkoncentrationer til bestemmelse af den

K

jeg

værdier for hver CYP isoform . Isoformen-specifik probe substratkoncentrationer anvendte var 25-200 pM tolbutamid for CYP2C9 og 5-50 uM midazolam for CYP3A4. De CK anvendte koncentrationer var 10-100 uM.

Bestemmelse af

K

i

‘

Ifølge Cornish-Bowden

et al

. [19], en Dixon plot er begrænset af det faktum, at det ikke skelner entydigt mellem konkurrencedygtige og blandede inhibitorer og for blandede eller ikke-konkurrencedygtige inhibitorer, det giver ingen foranstaltning af

K

i «

, dissociationskonstant af EIS-komplekset. Derfor brugte vi S /V versus [I] grunde til at bestemme

K

i ‘

værdier for hæmning af CYP2C9 og CYP3A4. Når

K

jeg

K

jeg

«, krydset var over på [I] akse i plot af S /V mod [i] og under den i Dixon plot; det modsatte var tilfældet, hvis

K

jeg

K

jeg

‘

. I det særlige tilfælde, hvor

K

i

=

Ki ‘Hotel (simpel, ikke-kompetitiv hæmning), forekom skæringspunkterne på [I] akse i både plots. De asymptotiske tilfælde af konkurrencedygtige og konkurrencedygtige hæmning kan genereres ved at indsætte de betingelser

K

i ‘

til ∞ for kompetitiv hæmning, eller

K

jeg

til ∞ for konkurrencedygtig hæmning [19].

Beregning af enzymkinetik og statistisk metode

Som beskrevet i detaljer tidligere [14], for at bestemme de store enzymer ansvarlig for CK-metabolisme i HLM’er, blev den metaboliske clearance-hastighed af inkubationen løsning uden specifik inhibitor for CK betragtes som 100%. Virkningerne af de specifikke inhibitorer på den metaboliske clearance rate af CK blev evalueret med SPSS envejs variansanalyse (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P 0,05 blev betragtet som signifikant i alle tilfælde. De tilsyneladende kinetiske parametre for CK (

K

m

V

max

) blev bestemt ved at montere Michaelis- Menten ligningen ved hjælp af GraphPad Prism Enzyme Kinetic 5 Demo software (GraphPad Co. Ltd, San Diego, CA, USA). Ligningen udtrykkes som

V = V

max

[S] /(K

m

+ [S])

, hvor

K

m

er underlaget koncentration, hvor reaktionen hastighed er 50% af

V

max

. For at bestemme inhiberingen af ​​CYP isoformer blev aktiviteten af ​​hvert CYP isoform beregnet ved hjælp af metaboliske clearance rate af dens tilsvarende probe substrat. Den metaboliske clearance-hastighed af sonden substrat blev anset 100%, når ingen specifik inhibitor og CK blev tilsat til inkubationen assay.

IC

50

s

blev bestemt ved at analysere plot af logaritmen til inhibitorkoncentrationen versus procentdelen af ​​aktivitet tilbage efter hæmning ved hjælp af SPSS-software til Windows (version 11.5, SPSS, Chicago, IL). For at beregne den

K

jeg

værdier, de hæmning data var egnet til forskellige modeller af enzym hæmning (konkurrencedygtige, ikke-kompetitive) ved ikke-lineær mindste kvadraters regressionsanalyse ved anvendelse af GraphPad Prism 5 software (GraphPad Co. Ltd.),

K

jeg

værdier blev beregnet ved anvendelse af ikke-lineær regression efter ligningen

v

= (

V

max

S

)/(

K

m

(1+

I/K

i

)+

S

) for kompetitiv hæmning og ligning

v

= (

V

max

S

)/(

K

m

+

S

)(1+

I/K

i

) for ikke-kompetitiv hæmning, hvor

jeg

er sammensat koncentration,

K

jeg

er hæmning konstant,

S

er underlaget koncentration, og

K

m

er underlaget koncentrationen ved halvdelen af ​​den maksimale hastighed (

V

max) for reaktionen [20].

K

jeg

‘værdier

blev beregnet ved hjælp af den sekundære plot af skråninger af S /V versus [I] [19].

Resultater

Kinetisk analyse af CK

fig 2A, 2B og 2C viser metabolismen af ​​CK efter inkubation med HLM’er, CYP2C9 og CYP3A4. De kinetiske parceller viste, at

K

m

V

max

værdier var 84.20 ± 21.92 uM og 0,28 ± 0,04 nmol /mg protein /min for HLM’er, 34,63 ± 10,48 uM og 0,45 ± 0,05 nmol /nmol P450 /min for CYP2C9, 27,03 ± 5,04 uM og 0,68 ± 0,04 nmol /nmol P450 /min for CYP3A4, henholdsvis.

i vitroCL

int

værdier af CK i HLM’er, CYP2C9 og CYP3A4 var 0,0033 ml /mg protein

-1 · min

-1, 0,0130 ml /nmol P450

-1 · min

-1, og 0,0252 ml /nmol P450

-1 · min

-1 henholdsvis

Bemærk:. De inkubationsforhold er beskrevet i materialer og fremgangsmåder afsnittet. Kurven blev automatisk tilpasset ved anvendelse lineær regression og Michaelis-Menten ligningen. Data blev opnået i tre eksemplarer.

Specifikke CYP isoformer for metabolismen af ​​CK

De hæmmende virkninger af CYP specifikke inhibitorer på den metaboliske clearance rate af CK i HLM’er er vist i Fig 3. koncentrationerne af furafylline, tranylcypromin, sulfaphenazol, quinidin, ticlopidin, og ketoconazol var 1 uM, undtagen for chlormethiazol ved 5 uM. Koncentrationerne blev udvalgt på baggrund af tidligere rapporterede

IC

50

eller

K

jeg

værdier for CYP-isoformer at sikre tilstrækkelig inhibitorisk selektivitet og maksimal inhiberende potens. I nærvær af sulfaphenazol og ketoconazol, den metaboliske clearance rate (MCR) af CK faldt til 73,5 ± 20,9% og 74,6 ± 28,1% af den for kontrollen, (fig 3). Men andre hæmmere havde ingen tydelige hæmmende på metabolismen af ​​CK. De screenede enzymer blev yderligere bekræftet af humane rekombinante CYP’er ved hjælp af specifikke inhibitorer. Den MCRS af CK faldt til 22,0% af den for kontrollen for CYP2C9 og til 13,2% af den for kontrollen for CYP3A4 (fig 4). Resultaterne viste, at CYP2C9 og CYP3A4 var de store enzymer, der er ansvarlige for metabolismen af ​​CK

in vitro

Bemærk:. Furafylline, tranylcypromin, sulfaphenazol, quinidin, chlormethiazol, ticlopidin, og ketoconazol blev brugt som de specifikke inhibitorer for CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1 og CYP2C19 hhv. Inkubationsbetingelserne er beskrevet i materialer og fremgangsmåder afsnittet. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser og fejlsøjler. I nærvær af sulfaphenazol (1 uM) og ketoconazol (1 uM), den metaboliske clearance CK faldt til 73,5% og 74,6% af den for kontrollen henholdsvis hvorimod de andre inhibitorer havde ingen signifikante inhibitoriske virkninger på metabolismen af CK

Bemærk:. Omkring 50 uM CK blev inkuberet med CYP rekombinanter og cofaktorer i fravær (kontrol) eller tilstedeværelse af inhibitorer ved sulfaphenazol (1 uM) og ketoconazol (1 uM), henholdsvis. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet af tredobbelte inkubationer. Den MCRS af CK var signifikant faldt sammenlignet med dem i kontrol for CYP3A4 og CYP2C9.

Estimering af

IC

50

s

de hæmmende virkninger af flere koncentrationer af CK (10-100 uM) på aktiviteten af ​​hver CYP isoform bestemt af metabolismen af ​​en enkelt koncentration af isoform-specifik probe blev testet med HLM’er (eller udtrykt CYP’er når det er nødvendigt). CK viste potent hæmning af CYP2C9 (tolbutamid 4-hydroxylering) og CYP3A4 (midazolam 1-hydroxylering) (figur 5), med

IC

50’erne

af 16.00 uM og 9,83 uM , henholdsvis. Den hæmmende effekt af CK på aktiviteten af ​​CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 og CYP2C19 var ubetydelig

Bemærk:. De inkubationsforhold er beskrevet i materialer og metoder afsnittet. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser og fejllinjer.

Estimering af

K

jeg

værdier

For CYP2C9 ,

K

jeg

værdier blev bestemt ved hjælp tolbutamid som sonden substrat.

V

max

K

m

værdier estimeres ved en ikke-lineær regressionsmodel for den konkurrencemæssige enzym hæmning af CYP2C9 -catalyzed tolbutamid 4-hydroxylering i HLM’er, de repræsentative Lineweaver-Burk plots (fig 6) og den sekundære plot af CYP2C9-aktivitet ved hjælp skråningerne af de primære Lineweaver-Burk plots versus koncentrationer af CK viser, at

K

i

af CK var 14.92 uM (fig 7) [20]. De repræsentative Dixon plots af effekten af ​​CK på tolbutamid 4-hydroxylering dannelse og S /V versus [I] plots (Fig 6) foreslået, at inhiberingsdata passer godt til en blandet type inhibering [19]. For CYP3A4,

K

jeg

værdier blev bestemt ved hjælp midazolam som sonden substrat.

V

max

K

m

værdier estimeres ved en ikke-lineær regressionsmodel for den konkurrencemæssige enzym hæmning af CYP3A4 -catalyzed midazolam 1-hydroxylering i HLM’er (fig 8). De repræsentative Lineweaver-Burk plots (Fig 8) og den sekundære plot af CYP2C9-aktivitet ved hjælp skråningerne af de primære Lineweaver-Burk plots versus koncentrationer af CK viser, at

K

jeg

af CKvalues ​​var 11,42 pM (Fig 9) [20]. De repræsentative Dixon plots af effekten af ​​CK på midazolam 1-hydroxylering dannelse og S /V versus [I] plots (Fig 8) viste, at inhiberingen data passer godt til en ikke-kompetitiv inhibering [19].

datapunkter er middelværdier af tredobbelte inkubationer. . TB, tolbutamid

Bemærk: Ikke-lineær regressionsanalyse af tolbutamid 4-hydroxylering versus substratkoncentrationen blev udført for at opnå den

K

jeg

værdier. Hvert punkt repræsenterer middelværdien af ​​tredobbelte bestemmelser

Bemærk:. Det hæmning af CYP3A4-aktivitet kan bedst beskrives som en ikke-kompetitiv hæmning af forskellige koncentrationer af CK (10-100 uM) i HLM inkubationer (0,5 mg · ml

-1 protein). Datapunkterne er middelværdierne af tredobbelte inkubationer. . MDZ, midazolam

Bemærk: Ikke-lineær regressionsanalyse af CK versus substratkoncentrationen blev udført for at opnå den

K

jeg

værdier. Hvert punkt repræsenterer middelværdien af ​​tredobbelte bestemmelser.

Diskussion

I øjeblikket er samtidig brug af CAM og terapeutiske lægemidler er populære. CAM har potentiale til at forårsage farmakokinetiske og dynamiske interaktioner med terapeutiske lægemidler. Derfor kunne det ringere eller forhøjede plasmaniveauer af disse stoffer resultere i en lavere terapeutisk virkning eller en højere risiko for toksicitet [9, 10]. Især for anti-cancer medicin, som har smalt terapeutisk vindue, kan farmakokinetiske interaktioner let føre til klinisk relevante virkninger [9]. CK er en CAM, der har en fremadrettet anvendelse til behandling af cancer [5-7]. Derfor screening narkotika-enzymer af CK kan give nyttige oplysninger for at undgå CK-drugs interaktioner.

CYP superfamilien omfatter vigtige fase Ι narkotikarelaterede enzymer der oxiderer mere end 90% af de nuværende terapeutiske stoffer. Over 90% af humant lægemiddel oxidation kan tilskrives CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1, CYP2D6 og CYP3A4 [12]. Lægemidler, der konkurrerer med den samme metaboliserende enzym kan føre til lægemiddelinteraktioner, hvilket resulterer i ændret effekt eller toksicitet i individer [13].

I den foreliggende undersøgelse, vores data antydede, at CYP2C9 og CYP3A4 var de store enzymer involveret i metabolismen af ​​CK

in vitro

, ikke de substrater af CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 og CYP2C19. Desuden vores undersøgelse viste, at CYP2C9 og CYP3A4 var følsom over for hæmning af CK, og deres

IC

50

valueswere 16.00 uM og 9,83 uM, hhv. CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 og CYP2C19 var næppe følsom for inhibering af CK (

IC

50s

var alle større end 100 uM). Disse resultater er delvist støttet af studiet af Hao et al. (2008), at ginsenosides, Rh2, CK, og alle sapogeniner udstillet moderat CYP3A4-hæmning i baculosomes. Ifølge Kong

et al

[21], kan styrken af ​​en forbindelse klassificeres efter dets

IC

50

værdier, så potent, hvis

IC

50

≤ 20 mikrogram /ml eller ≤10 pM; moderat, hvis

IC

50

20-100 pg /mL eller 10-50 uM; eller svag, hvis

IC

50

≥100 mikrogram /ml eller ≥ 50 uM. CK er klassificeret som en potent inhibitor af CYP3A4, en moderat inhibitor af CYP2C9 og en svag hæmmer af de øvrige fem testet i denne undersøgelse CYP’er.

CYP2C9 er en af ​​de mest udbredte CYP-enzymer (ca. 20% af leverens indhold samlede CYP) [22]. Det metabolizes en række vigtige kliniske lægemidler, herunder anti-cancer, antibiotika, anti-diabetisk, anti-epileptiske, anti-hypertensive, anti-koagulerende og anti-hyperlipidæmiske lægemidler [23]. Af særlig interesse er CYP2C9-medieret metabolisme af lægemidler med et snævert terapeutisk indeks, såsom warfarin og phenytoin [24]. Derfor konkurrerer med CYP2C9 metabolisme kan føre til alvorlig toksicitet. CYP3A4 er en stor cytokrom P450 i human lever, som har bred substrater [25]. CYP3A4 metaboliserer ikke kun xenobiotika, herunder de fleste lægemidler og carcinogener, men også mange endogene forbindelser, såsom cholesterol, galdesyrer, fedtsyrer, prostaglandiner, leukotriener, retinoider, og biogene aminer, og dermed mest farmakokinetiske CAM-lægemiddelinteraktioner involverer CYP3A4 [26]. Den foreliggende undersøgelse viser, at CK er en inhibitor af både CYP2C9 og CYP3A4. Derfor patienter, der anvender CK i kombination med konventionelle terapeutiske lægemidler, som er substrater for CYP2C9 og CYP3A4 af forskellige årsager bør være forsigtig.

Men i modsætning til de specifikke hæmmere af CYP2C9,

IC

50

og K

jeg

værdier af CK var 11-53 gange og 49 gange højere end sulfaphenazol i HLM’er henholdsvis [15, 16]. For CYP3A4,

IC

50

og K

jeg

værdier af CK var 41-123 gange og 761 fold højere end ketoconazol i HLM’er henholdsvis [17]. Den potente inhibering af CK var dårligere end den for enzym-specifikke inhibitorer. Formentlig den inhiberende styrke af CK er for lav til at forårsage betydelig klinisk CYP2C9 og CYP3A4 hæmning. Bemærk, at i vores anden undersøgelse udført med raske frivillige, 10 raske mandlige frivillige modtog administrationer af 800 mg ren CK tabletter (100 mg /tablet, der leveres af Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited, Kina) sluges af 150 ml vand, så serien venøse blodprøver af 5 ml blev opsamlet i EDTA-holdige rør ved 0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72 og 96 timer. Plasmaprøverne blev analyseret ved HPLC-MS /MS, peak plasmakoncentration (C

max) og tid til maksimal plasmakoncentration (T

max) var direkte indhentet fra de observerede koncentration-time data. Arealet under plasmakoncentration-tid-kurven (AUC) fra tid nul til sidste målte koncentration (AUC

(0-t)) blev beregnet efter den lineære trapezformede regel, estimatet af oral clearance (CL /F) var beregnet som CL /F = dosis /AUC

(0-t) [27]. Resultaterne viste C

max CK var 4,07 pM (95% CI: 2,89, 5,24). C

max CK af nogle frivillige viste sig at være i nærheden af ​​5 uM gennem endags-tilskud af 800 mg, hvilket er tæt på

IC

50

Ki

værdier af CK for CYP2C9 og CYP3A4 (Fig 10). Således har vi stadig advare mod CK-interaktion på trods af sin mildhed.

Indsat viser de samme data på en semilogaritmisk skala, hver værdi er middelværdien ± SD.

Tak

Tak til Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited (Zhejiang, Kina) for at give Ginsenoside sammensatte K. Dette arbejde blev støttet af National Scientific Foundation of China (Tilskud 81.302.850, 81.300.204, 31.400.306); Kina Postdoc Science Foundation (Tilskud 2013M531817, 2014T70793); og Videnskab og Teknologi Plan Projekter af Hunan-provinsen (Grant 2014RS4011). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.