PLoS ONE: Cirkulerende Plasma MIR-141 er en ny biomarkør for metastatisk tyktarmskræft og Forudsiger Poor Prognosis

Abstrakt

Baggrund

Kolorektal cancer (CRC) er fortsat en af ​​de store typer kræft og cancer dødsfald på verdensplan. Følsomme, non-invasive biomarkører, der kan lette afsløring sygdom, iscenesættelse og forudsigelse af terapeutisk resultat er særdeles ønskeligt at forbedre overlevelsesraten og hjælpe med til at bestemme optimeret behandling for CRC. De små ikke-kodende RNA’er, microRNA (miRNA), er for nylig blevet identificeret som kritiske regulatorer til forskellige sygdomme, herunder cancer og kan repræsentere en ny klasse af kræft biomarkører. Formålet med denne undersøgelse var at identificere og validere cirkulerende microRNA i humant plasma til brug som sådanne biomarkører i tyktarmskræft.

Metode /Principal Fund

Ved at bruge kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion, vi fandt, at cirkulerende mIR-141 var signifikant associeret med stadie IV tyktarmskræft i en kohorte af 102 plasmaprøver. Receiver operating characteristic (ROC) analyse blev anvendt til at evaluere følsomheden og specificiteten af ​​kandidat plasma microRNA markører. Vi observerede, kombination af MIR-141 og carcinoembryonisk antigen (CEA), et meget anvendt markør for CRC, yderligere forbedret nøjagtighed detektion. Disse resultater blev valideret i en uafhængig kohorte af 156 plasmaprøver indsamlet på Tianjin, Kina. Desuden viste, at høje niveauer af plasma miR-141 forudsagde dårlig overlevelse i begge kohorter, og at miR-141 var en uafhængig prognostisk faktor for fremskreden tyktarmskræft., Vores analyse

Konklusioner /Betydning

Vi foreslå, at plasma miR-141 kan repræsentere en roman biomarkør, der supplerer CEA at opdage tyktarmskræft med fjernmetastaser, og at høje niveauer af miR-141 i plasma var forbundet med dårlig prognose

Henvisning:. Cheng H, Zhang L , Cogdell DE, Zheng H, Schetter AJ, Nykter M, et al. (2011) cirkulerende plasma MIR-141 er en ny biomarkør for metastatisk tyktarmskræft og Forudsiger dårlig prognose. PLoS ONE 6 (3): e17745. doi: 10,1371 /journal.pone.0017745

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: 15 oktober, 2010; Accepteret: 11 Februar 2011; Udgivet: 17 marts 2011

Copyright: © 2011 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af en bevilling fra National Foundation for Cancer Research (WZ og SRH) og Tianjin Cancer Institute og Hospital (KC). Hanyin Cheng blev understøttet af en Pharmacoinformatic Training Grant stipendium fra NIH (NIH Grant No. R90 DK071505-05). Data og prøvetagning blev støttet af M. D. Anderson University Cancer Fund, Center for Klinisk og translationel Sciences fra University of Texas Health Science Center på Houston, og NIH Cancer Center Support Grant CA16672. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er et verdensomspændende sundhedsproblem med 655.000 dødsfald om året [1]. I USA, CRC er den tredje mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald [2], med en anslået 51,370 dødsfald i 2010 ifølge National Cancer Institute. I Kina, CRC forbliver den femte mest almindelige cancer type og den fjerde mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald [3]. Trods tidlig screening og udvikling af nye kemoterapeutiske strategier, CRC overlevelsesrater i løbet af de sidste 20 år er ikke væsentligt forbedret. Desuden er forekomsten af ​​CRC hastigt stigende i de senere år i Kina [4]. Nye biomarkører, der er af den kliniske værdi er således et presserende behov for at forbedre compliance satser. Carcinoembryonisk antigen (CEA) er blevet anvendt som et serum markør for CRC, selv om dens følsomhed har varieret i forskellige undersøgelser [5], [6]. For nylig, en familie af små regulatoriske RNA, microRNA, har vist sig som mulige plasma markører for humane sygdomme, herunder kræft på grund af deres relative stabilitet i omløb [7].

MikroRNA’er er små ikke-kodende RNA (18- 22 nt i længde), som regulerer ekspressionen af ​​målgener ved at interferere med transskription eller inhibering translation [8]. Undersøgelser har vist, at microRNA spiller en afgørende rolle i næsten alle cellulære biologiske processer, herunder metabolisme, overlevelse, differentiering og apoptose. Deregulering af specifikke microRNA bidrager til en række sygdomme, især udviklingen og progressionen af ​​cancer, herunder CRC. Specifikt microRNA ekspression profilering i CRC viste, at en række microRNA, herunder MIR-21, MIR-20a og miR155 blev opreguleret i tumorvæv, og at højere MIR-21 blev forbundet med dårlig terapeutisk resultat [9], [10]. Potentialet i cirkulerende miRNA i plasma som kræft biomarkører er også blevet evalueret i et par studier. For CRC, en nylig undersøgelse rapporteret, at MIR-92 niveauer signifikant højere i plasmaprøver fra patienter end hos raske kontroller og kan være en potentiel markør for CRC detektion [11]. En undersøgelse af plasmaprøver fra prostatacancerpatienter rapporterede, at plasma MIR-141 niveauer kan anvendes til screening for metastatisk prostatacancer med høj følsomhed [12].

I denne proof-of-principle undersøgelse for at identificere potentielle biomarkører for CRC, vi undersøgt, om udvalgte kandidat microRNA’er kunne tjene som non-invasive, blod-baserede markører til CRC ved at analysere de relative niveauer af tre microRNA (MIR-21, mir-92, og MIR-141) i en kohorte af 102 plasma prøver fra raske individer og CRC patienter opnået fra TexGen, et samarbejde mellem Texas Medical center institutioner. Vores indledende data viste, at blandt disse tre microRNA’er blev plasma miR-141 niveauer signifikant forhøjet i plasma af patienter tyktarmskræft med Stage IV sygdom og kunne let skelne fjernmetastaser sager fra normale kontroller og patienter med andre faser. Kombination af miR-141 med CEA var komplementære og kunne øge afsløring nøjagtigheden af ​​fjernmetastaser i tyktarmskræft. Disse resultater blev valideret i en uafhængig kohorte af 156 plasmaprøver opnået fra Tianjin, Kina. Vores yderligere analyser forudsat dokumentation, at plasma miR-141 var en potentiel prognostisk faktor, der forudsagde for dårlig overlevelse hos patienter med tyktarmskræft. Interessant modsætning i plasma, MIR-141 blev ikke differentielt udtrykt i tumorvæv mellem trin IV og trin I-II kolon kræftpatienter eller mellem tumorvæv og tilstødende ikke-tumorvæv i trin IV-patienter, hvilket antyder, at forhøjelse af plasma MIR-141 i trin IV patienter kan være afledt af andre systemiske reaktioner såsom inflammatoriske reaktioner i disse patienter.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Både Plasma- og vævsbaserede undersøgelser blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) på MD Anderson Cancer center og fra den etiske komité ved Tianjin Medical University Cancer Institute og Hospital. Alle deltagere gav skriftligt samtykke fra deres oplysninger, der skal lagres på hospitalet databasen og bruges til forskning.

Kliniske prøver

To uafhængige sæt plasmaprøver blev brugt. I alt 102 plasmaprøver fra alders- og køns- matchede raske personer og CRC patienter (fase I-IV) blev opnået fra TexGen mellem 2002 og 2008, et samarbejde mellem Texas Medical Center institutioner, der giver biologiske prøver samt epidemiologisk og klinisk data (TexGen prøver, se tabel S1). En uafhængig kohorte af 156 plasmaprøver fra alders- og køns- matchede raske donorer og tyktarmskræft patienter (fase I-IV) blev opnået ved Tianjin Medical University Cancer Institute og Hospital, Tianjin, Kina (TCH prøver) mellem 2007 og 2009 ( se tabel S2). Patologisk klassifikation af sygdomme hos alle patienter blev udført efter Den Internationale Union Against Cancer (UICC) og amerikanske fælles udvalg om kræft (AJCC) TNM for tyktarmskræft etableret i 2003. Blodprøver blev indsamlet fra alle patienter før operation og behandling. CEA niveauer af både TexGen og TCH plasmaprøver blev målt ved standard enzym immunoassay som en del af rutinemæssige kliniske forsøg og blev erhvervet fra den kliniske database på hvert institut. Opfølgning data fra alle de rekrutterede patienter tyktarmskræft fra både TexGen og TCH anskaffet og overlevelsestiden blev beregnet fra datoen for diagnose til dødsdagen eller sidste opfølgning i juni 2010. Alle patienter rekrutteret til dette studie havde ikke modtaget kemoterapi eller strålebehandling før blodet trækker. Den demografiske oplysninger om de to sæt prøver er opsummeret i den supplerende materiale.

For væv-baseret analyse tumorvæv fra 21 kolon kræftpatienter med fjernt metastatisk sygdom (fase IV) og 24 tyktarmskræft patienter med ikke -metastatic sygdom (fase I og II) blev indsamlet mellem 2007 og 2009 af Tianjin Medical University Cancer Institute og Hospital fra de samme patienter, hvis plasma prøver blev anvendt.

RNA isolering og kvantitativ RT-PCR

Lille RNA blev beriget fra alle plasmaprøver vha Mirvana PARIS RNA-isolering kit (Ambion, Austin, TX). Kort beskrevet blev 250 pi plasma optøs på is og centrifugeret ved 14.000 rpm i 10 minutter for at fjerne cellerester og andre cellulære organeller. Dernæst blev 150 pi supernatant lyseret med et tilsvarende volumen 2x denaturerende opløsning. For normalisering af prøve-til-prøve variation under isolation procedurer RNA, 25 fmol af syntetisk

C. elegans

miRNA cel-MIR-39 blev tilsat til hver denatureret prøve. Små RNA’er blev derefter beriget og oprenset efter producentens protokol, med den undtagelse, at berigede små RNA’er blev elueret i 45 pi forvarmet nuclease-frit vand. Standard TRIZOL metode (Invitrogen) blev anvendt til at isolere total RNA fra colonvæv.

I microRNA baserede RT-PCR-assays, blev 2,5 pi berigede små RNA’er fra plasmaprøver revers transkriberet under anvendelse af TaqMan MicroRNA Reverse Transciption Kit ( Applied Biosystems, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner i et totalt reaktionsvolumen på 7,5 pi. En fortyndet 1:20 RT-produkter blev anvendt som template for PCR fase. PCR-reaktionen blev udført i triplikater under anvendelse TaqMan 2x Universal PCR Master Mix med betingelser som tidligere [13] beskrevne. Uden template kontrol for både RT trin og PCR trin blev inkluderet for at sikre målspecifik amplifikation. De 7900 Sequence Detection System 2.3 (Applied Biosystems) software defaults blev brugt til at beregne den relative ændring i RNA udtryk ved 2

-ΔΔCt metode med 95% konfidensintervaller. Analyser for TexGen prøver blev udført ved MD Anderson og analyser for TCH prøver blev udført ved Tianjin Medical University Cancer Institute og Hospital.

microRNA analyse

MicroRNA microarray profilering blev udført med RNA isoleret fra Maryland kohorten hjælp af Ohio State microRNA microarray version 2.0 som tidligere beskrevet [9]. Microarray data (herunder rå og forarbejdede data) er deponeret i National Center for Biotechnology Informations (NCBI s) Gene Expression Omnibus (NCBIGEO GSE7828).

Statistisk analyse

Den statistiske signifikans blev bestemt ved hjælp af Wilcoxon logget rank test mellem grupper. Receiver Operating karakteristik (ROC) kurver blev genereret for at vurdere den diagnostiske nøjagtighed af hver parameter, og følsomheden og specificiteten af ​​den optimale skæringspunkt blev defineret som de værdier, der maksimerede arealet under ROC-kurven (AUC). De relative niveauer af microRNA blev kvantificeret under anvendelse af 2

-ΔΔCt metode, og data blev analyseret som log

10 af den relative mængde af målet microRNA. Den statistiske analyse blev udført med brug af software-pakker SPSS-version 16.0 (WPSS Ltd., Surrey, Det Forenede Kongerige) og grafer blev genereret ved hjælp Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., Californien). Spearman Sammenligningstabel analyse blev udført for at afsløre korrelation mellem plasma MIR-141-ekspression og CRC stadier. Alle statistiske tests var to-sidet og en

P

værdi på 0,05 blev betragtet som signifikant. Sammenhængen mellem den samlede overlevelse og plasma miR-141 blev analyseret med Kaplan-Meier-metoden og Log-rank test. Cox proportionel-risiko regressions analyse blev anvendt til at vurdere, om plasma miR-141 var en uafhængig prognostisk faktor for tyktarmskræft.

Resultater

Plasma miR-141 niveauer er korreleret med kliniske faser i tyktarmskræft

Tre mikroRNA (MIR-21, MIR-92 og MIR-141) blev valgt i vores studier for at undersøge deres potentiale til at tjene som biomarkører for tyktarmskræft. Disse kandidat miRNA blev udvalgt, fordi 1) MIR-21 har vist sig at være opreguleret i CRC tumorvæv [9], [10], [14]; 2) MIR-92 er for nylig blevet rapporteret at være et plasma markør for tyktarmskræft [11]; og 3) MIR-141 har vist sig at være en potentiel plasma markør for metastatisk prostatacancer [12]. Kvantitativ RT-PCR baseret microRNA assays på disse tre miRNA blev udført. Vi først undersøgt sammenhængen mellem disse tre miRNA og tyktarmskræft kliniske faser. Fase I og fase II-sager blev samlet i vores analyse, fordi kun begrænset Stage I tilfælde var til rådighed. Heat-map Analysen viste, at MIR-141 niveauer grupperet efter forskellige faser (figur 1, A). Spearman korrelationsanalyse viste, at plasma miR-141 niveauer blev stærkt korreleret med tyktarmskræft stadier (r = 0,605, P = 1,17 × 10

-8). I modsætning hertil MIR-21 og MIR-92 var mindre korrelerede med kliniske faser (figur 1, A).

(A) Hver række svarer til en plasma miRNA og hver kolonne svarer til hver prøve. Expression niveauer for hver miRNA er normaliseret tværs prøverne og skyggefulde i farver, således at rød betegner høj ekspression og grøn angiver lavt udtryk. Spearman korrelation viser, at miR-141 er stærkt korreleret med etaper (r = 0,605, P = 1,17 × 10

-8). (B-G) De relative niveauer af udvalgte plasma microRNA blev normaliseret til spike-in kontrol cel-miR-39 og vist som log10 af den relative mængde (RQ). Wilcoxon to-sample tests blev udført for at undersøge forskellen på udvalgte plasma microRNA mellem normale kontroller og tyktarmskræft patienter (B-D), eller mellem normale kontroller og /eller tyktarmskræft patienter med forskellige kliniske faser (E-G).

Vi analyserede næste, om disse kandidat microRNA’er kunne tjene som cirkulerende tyktarmskræft markører ved at sammenligne deres plasma niveauer mellem kræftpatienter og normale kontroller. Overraskende, i modsætning til den foregående rapport, at opregulering af plasma miR-92 var en tyktarmskræft biomarkør, Wilcoxon to stikprøver viste, at blandt disse tre microRNA’er, blev plasma miR-92 faldt betydeligt i TexGen kohorte af patienter med tyktarmskræft (

s

= 0,03) (figur 1, D). Imidlertid blev faldet i plasma MIR-92 kun observeret i trin I-II og trin III og niveauet steg til et lignende niveau som det for normale kontroller i trin IV tyktarmskræft (figur 1, g). Plasmaniveauer af MIR-21 og MIR-141, viste ikke signifikant forskel mellem kontrol og cancerpatienter (figur 1, B 0,05 betragtes som signifikant. (B) Mir-141 ekspressionsniveauer blev målt under anvendelse microRNA profilering data fra Maryland kohorte af CRC prøver. Wilcoxon matchede-par tests blev udført for at sammenligne miR-141 niveauer mellem tumorvæv og tilstødende normale væv i disse CRC patienter.

Diskussion

I denne undersøgelse, tog vi en fokuseret tilgang og undersøgt tre kandidatlande microRNA’er for deres potentielle værdi som plasma biomarkører for tyktarmskræft. Resultater fra Texas undersøgelse viste, at plasma miR-141 var en følsom markør og suppleret CEA til påvisning trin IV tyktarmskræft. Dette resultat blev uafhængigt valideret ved hjælp af en kohorte af prøver fra patienter med tyktarmskræft i Tianjin, Kina. Således er denne samarbejdende undersøgelse foretaget af to uafhængige hold af forskere på to forskellige steder på forskellige etniske patientpopulationer giver stærke beviser for, at miR-141 er en gyldig plasma markør, der komplementerer CEA ved fastsættelsen af ​​trin IV tyktarmskræft.