PLoS ONE: Nedbrydning af HIF-1alpha under Hypoxi Kombineret med Induktion af Hsp90 Polyubiquitination i cancerceller ved hypericin: en unik Cancer Therapy

Abstrakt

perihydroxylated perylen quinon hypericin er blevet rapporteret at have potente anti-metastatiske og antiangiogene aktiviteter, der genereres ved at målrette forskellige skillevejen mellem kræft-fremmende processer via unikke mekanismer. Hypericin er den eneste kendte eksogent reagens, som kan inducere tvunget poly-ubiquitinering og accelereret nedbrydning af varmechokprotein 90 (Hsp90) i cancerceller. Hsp90 klient proteiner derved destabiliseres og hurtigt nedbrydes. Hsp70 klient proteiner kan potentielt også påvirket via forhindre dannelse af hsp90-hsp70 mellemliggende komplekser. Vi viser her, at hypericin inducerer også forøget nedbrydning af hypoxi-inducerbar faktor 1α (HIF-1α) i to humane tumorcellelinier, U87-MG glioblastom og RCC-C2VHL – /- renalcellecarcinom og i den ikke-maligne ARPE19 retinal pigment epitelcellelinie. Den hypericin-accelereret omsætning af HIF-1α, den regulerende forløber for HIF-1-transkriptionsfaktor, som fremmer hypoxisk stress og angiogene responser, overvinder den fysiologiske HIF-1α protein stabilisering, som forekommer i hypoxiske celler. Den hypericin effekt eliminerer også de høje HIF-1α niveau udtrykt konstitutivt i von Hippel-Lindau-proteinet (pVHL) deficiente RCC-C2VHL – /- renalcellecarcinom cellelinie. I modsætning til den normale ubiquitinproteasomvejen-afhængig omsætning af HIF-α proteiner, som forekommer i normoxi kan hypericin-induceret HIF-1α katabolisme forekomme uafhængigt af cellulære iltindhold eller pVHL-fremmet ubiquitin ligering af HIF-1α. Det medieres af lysosomale cathepsin-B-enzymer med cathepsin-B-aktivitet optimeres i cellerne gennem hypericin-medieret reduktion i intracellulær pH. Vores resultater antyder, at hypericin potentielt kan være anvendelig til forebyggelse af vækst af tumorer, hvori HIF-1α spiller afgørende roller, og i pVHL ablateret tumorceller såsom nyrecellecarcinom ved udligning af forhøjede HIF-1α indhold i disse celler, nedskalering den overdrevne angiogenese som karakteriserer disse tumorer

Henvisning:. Barliya T, Mandel M, Livnat T, Weinberger D, Lavie G (2011) Nedbrydning af HIF-1alpha under Hypoxi Kombineret med Induktion af Hsp90 Polyubiquitination i cancerceller ved hypericin: en unik Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (9): e22849. doi: 10,1371 /journal.pone.0022849

Redaktør: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, Indien

Modtaget: Marts 30, 2011; Accepteret: 30 juni 2011; Udgivet: 19 September, 2011

Copyright: © 2011 Barliya et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af Israel Cancer Association, Grant 20090033 (https://ica.cancer.org.il/english/) takket være et bidrag fra Rick og Rita Weinstein og to konkurrerende tilskud fra Tel Aviv University: den Maratier Foundation og Elsa og Leo Abramson Foundation, Tel Aviv University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. G. Lavie har økonomisk interesse i Hy Biopharma Corporation, der udvikler drug hypericin (beskrevet her) som et anti-cancer middel. Men virksomheden er i fremskredne kliniske forsøg og det er usandsynligt at få noget fra denne publikation. Forskningen blev ikke finansieret af dette selskab, og der er ingen andre vederlag til nogen af ​​forfatterne. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Dannelse af tumor metastaser ved at formidle cancerceller og deres eksplosive vækst er fortsat den mest udbredte årsag for svigt og død kræftbehandling. Tumor celler remodel den ekstracellulære matrix, ændre celle adhæsionsegenskaber, invaderer omgivende væv og der vandrer til distale organer til at danne metastatiske foci. Udvikling foci generere hypoxi og et behov for neoangiogenese at understøtte væksten. Hypoxi stabiliserer stress respons precursor HIF-1α [1], hvilket fører til dets translokation til kernen via en hsp90 afhængig proces [2], [3] og heterodimerisering med HIF-1β, genererer den funktionelle HIF-1 transkriptionsfaktor. HIF-1 fremmer transkription af -100 stressrespons målproteiner, herunder VEGF. VEGF stimulerer øget udtryk for dens primære receptor VEGFR2. VEGF-VEGFR2 komplekser, som formen kræver association med hsp90 at aktivere nedstrøms signalering, der initierer neoangiogenic kaskade, [4] og aktiverer integrin-fokal adhæsionkinase (FAK) -Src signalering kompleks. Både FAK og Src også Hsp90 klient proteiner, der kræver samarbejde med denne chaperone for at opretholde deres funktionelle konformationer [5], [6]. Disse funktioner omfatter dannelsen af ​​fokale adhæsioner forbundet med en F-actin kontraktile apparat, der er knyttet til cellemembranen og aktivere migrationen maskiner via interaktion med den ekstracellulære matrix [7]. Således kan Hsp90 hæmning forstyrre flere steder i angiogene og celle dispersion signalering kaskader og forstyrre tumorprogression.

De markante stigninger i HIF-1α indhold, der forekommer i mange tumortyper implicerer HIF-1 i at fremme onkogenese. Tumor progression accelereres via heterogene mekanismer, herunder dysfunktionel /slettet VHL-genet i renalcellecarcinom og hemangioblastoma [8], inaktiveret IDH1 gen i glioblastom [9], mutationer i mitokondrie ravsyre dehydrogenaser i paragangliom og andre [10]. Faktisk er forhøjet intratumoral HIF-1α (eller HIF-2α) associeret med accelereret dødelighed patient, fremgår retrospektive immunohistokemiske analyser af paraffinindlejrede biopsi sektioner fra forskellige tumorer [11]. Det er i øjeblikket accepteret, at faldende tumorale HIF-1α niveauer kan omfatte vigtige kliniske fordele, ansporet intensive søgninger efter småmolekyleinhibitorer af HIF-1α.

Reagenser med forskellige aktiviteter, der kan forstyrre tumorcelleproliferation, migration og neoangiogenic signalering vil sandsynligvis mere effektivt at hæmme dannelsen af ​​metastaser og gavne kræftpatienter. Et sådant potentielt lovende reagens er den perihydroxylated perylen quinon – hypericin. Vi fandt, at hypericin effektivt inhiberer dannelsen af ​​metastaser af murine bryst og pladecellecarcinom tumorer

in vivo

[12], tilsyneladende ved at interferere med signalveje, der fremmer angiogenese [13] og tumorcelleproliferation [14]. Fællesnævneren forbinder disse forskellige aktiviteter er en unik evne til hypericin til at fungere som exogen inducer af tvungen poly-ubiquitinering af varmechokprotein 90 (Hsp90), destabiliserende og hurtigt nedbrydelige en overflod af hsp90-klient-proteiner [14].

Her har vi rapportere, at hypericin kan nedbryde HIF-1α i celler via en unik hypoxi og proteasom uafhængig mekanisme. Selvom HIF-1α er et hsp90 klient protein [15] nedbrydes af andre Hsp90-inhibitorer [16], den hypericin-induceret HIF-1α katabolisme synes at involvere en unik lysosomal cathepsin-B afhængig mekanisme, aktiveres i en reduceret intracellulær pH-miljø. Vi viser også, at den angiogene signalering kaskade kan blive påvirket af hypericin på flere steder, hvilket gør dette molekyle potentielt lovende i anti kræftbehandling.

Resultater

Tvunget HIF-1α nedbrydning under hypoxi ved celle behandling med hypericin

med sigte på at dechifrere mekanismen for den antiangiogene aktivitet af hypericin [13], vi undersøgte, om hypericin påvirker HIF-1α adaptive stabilisering, som opstår under hypoxi i fravær af prolin og asparagin hydroxylering [1 ] i tre humane cellelinier: U87-mG glioblastom-celler, RCC-C2

VHL – /- (C2

VHL – /-) renale carcinomaceller deficiente i pVHL, og ARPE-19 retinal pigment epitelceller. Cellerne blev først udsat for hypericin i 72 timer, den tid der kræves for optimale hypericin effekter til at udvikle og hypoxi genereret kemisk med CoCl

2, og med en atmosfære med lavt oxygenindhold (0,5% O

2, 5% CO

2 og 94,5% N

2) for de sidste 6 timers behandling for at forhindre hypoxisk cytotoksicitet. HIF-1a-niveauer blev analyseret i cytosoliske og nukleare fraktioner ved Western blotting. Resultaterne viser fig. 1 viser, at eksponering for 10 uM og 30 uM hypericin reduceres effektivt hypoxi-inducerede stigninger i HIF-1α-niveauer i et hypericin dosisafhængig måde i ARPE-19 celler (fig. 1a), U87-MG-celler (fig. 1B ). Reduktioner i HIF-1α var mere udtalt i de nukleare fraktioner af begge cellelinier, især når hypoxi blev induceret kemisk med CoCl

2.

[A] ARPE19, [B] U87-MG, [C ] RCC-C2

VHL – /- og [D]. RCC-C2

VHL + (VHL-genet rekonstitueres) cellelinier blev udsat for 10 og 30 pM hypericin i 72 timer. Kulturerne blev underkastet hypoxiske betingelser med 150 pM CoC

2 (A B, øvre panel dubletter) og med en atmosfære med lavt oxygenindhold (0,5% O

2, 94,5% N

2 og 5% CO

2) (A B, lavere panel dubletter) for de sidste 6 timers behandling. Hypericin forårsagede nedbrydning af HIF-1α. Formidler af HIF-1α proteolytisk spaltning blev karakteriseret ved inhibering af HIF-1α nedbrydning med CA-074 cathepsin B-hæmmer, med MG-132 og med AllN proteasomalaktivitet calpainhæmmere, indgives til kulturerne i de sidste 6 timers inkubering med celler. Cytosoliske ekstrakter og kerneekstrakter blev fremstillet, separeret på SDS-PAGE og Western blots udviklet med anti-HIF-1α. Lige belastning blev bekræftet med β-Actin. [E]. Virkninger af hypericin på den intracellulære pH af U87-MG og C2

VHL – /- celler. Kvantitativ BCECF, pH-afhængig fluorescens målt spectrofluorimetrically (FRU betegner Fluorescens relative enheder). [F]. Analyse af den rolle, hypericin-medieret intracellulær pH ​​reduktion i fremme HIF-1α omsætning under CoCl

2 hypoxi, bestemt efter cytoplasmatisk alkalinisering med 20 mM NH

4CL anvendt i løbet af de sidste 6 timers inkubation. Cytoplasmatisk basisk formindskede hypericin-induceret HIF-1α omsætning under CoCl

2 hypoxi.

For at bestemme, hvordan hypericin forbedrer HIF-1α nedbrydning vi brugte VHL genet slettet C2

VHL- /- cellelinie. pVHL substratet genkendelse og binding modul af en E-3 ubiquitin ligase kompleks binder HIF-1α efter prolyl hydroxylering på HIF-1α prolyl-hydroxylase domæne-protein-2 [17], hvorved ubiquitinating HIF-1α og mediering af proteasomalaktivitet nedbrydning af denne stress-respons transkriptionsfaktor precursor [18]. pVHL mangel forstyrrer denne oxygen-afhængige nedbrydning reaktion, hvilket fører til konstitutiv akkumulering af HIF-1α. Vi undersøgte HIF-1α indhold i C2

VHL – /- celler efter 72 timers behandlinger med hypericin. Den konstitutivt høje HIF-1α indhold i C2

VHL – /- celler faldt efter udsættelse for hypericin (. Figur 1C udstillinger) på en måde svarende til reduktioner i HIF-1α observeret i U87-MG og ARPE-19 celler behandlet med hypericin under hypoxi. HIF-1α eliminering af hypericin i C2

VHL – /- celler forekom uafhængigt af pVHL og viste sig at være ufølsom for inhibering med MG132 eller AllN proteasomalaktivitet calpainhæmmere (figur 1C.), Dermed udelukke inddragelse af ubiquitinproteasomvejen i denne proces. HIF-1α nedbrydning med hypericin blev imidlertid effektivt inhiberet af cathepsin-B-hæmmer CA-074 i C2

VHL – /- celler (figur 1C). Og upåvirkede af CLI-III, en cathepsin-L-inhibitor (data ikke vist). Disse observationer indikerer, at hypericin-forstærket HIF-1α omsætning medieres gennem katabolisme af en cathepsin-B-type-enzymet uafhængigt af ubiquitinproteasomvejen

Stabil transfektion af VHL ind C2

VHL -. /- celler, der restitueres E3 ubiquitin ligase komplekse funktionalitet [19], herunder HIF-1α proteasomalaktivitet nedbrydning under normoxi og HIF-1α stabilisering under hypoxiske betingelser (fig. 1D). I denne indstilling hypericin også accelereret HIF-1α nedbrydning under hypoxi, ophævelse af hypoxi-induceret HIF-1α stabilisering i VHL-rekonstituerede RCC-C2

VHL + -celler (C2

VHL + celler) (fig. 1D). HIF-1α nedbrydning af hypericin i C2

VHL + celler blev også hæmmet af CA-074 (fig. 1D). , Cathepsin-B sti forbliver således den vigtigste rute for HIF-1α nedbrydning af hypericin under hypoxi efter pVHL rekonstituering.

Hypericin fremkalder reduktioner i intracellulær pH ​​

Skiftet i HIF-1α omsætning fra den fysiologiske pVHL-medieret proteasomalaktivitet nedbrydning til et cathepsin-B afhængig mekanisme forårsaget af hypericin fik os til at undersøge, om ændringer i intracellulære betingelser bidrog til dette skift. Da lysinducerede fotodynamiske aktiviteter af hypericin fremkalde reduktioner i den intracellulære pH (pH

i), tumorcelle [20], vi hypotese, at hypericin kan også forårsage intracellulær pH ​​reduktion i mørke via redox aktiviteter, optimering betingelser for lysosomale enzym aktivitet. pH

i blev målt i U87-MG og C2

VHL – /- celler behandlet med 10 og 30 pM hypericin i 72 timer i mørke, overvågning pH-afhængig esterolytisk spaltning af acetoxymethyl-esterderivat af BCECF ( se Metoder til detaljer). Trods en streng vedligeholdelse af mørke forhold, indspillede vi hypericin koncentration afhængige reduktioner i intracellulær pH ​​i U87-MG og C2

VHL – /- celler (Fig 1E.). Den cytosoliske pH

jeg faldt i U87-MG celler fra et udgangspunkt på 7,12 ± 0,08 til 6,75 ± 0,06 med 10 pM af hypericin (p ≤ 0,05), og til 6,45 ± 0,20 med 30 pM hypericin (p≤0.03). I C2

VHL – /- celler pH

jeg faldt fra 7,18 ± 0,04 til 6,85 ± 0,28 (p≤0.08) med 10 pM hypericin og til 6,42 ± 0,2 med 30 pM hypericin (p ≤ 0,05). Disse undersøgelser viser, at hypericin fremkalder også koncentration afhængige reduktioner af cellulær pH ​​

jeg i mørket.

For at bestemme, om nedsat pH-værdi

Jeg er afgørende for cathepsin-B medieret HIF-1α nedbrydning af hypericin, virkning af cytoplasmatisk alkalinisering med NH

4CL på HIF-1α cytosoliske indhold blev undersøgt i hypericin-behandlede celler. U87-MG celler blev udsat for hypericin i 72 timer i mørke og 150 uM CoC

2 hypoxi induceres under de sidste 6 timers inkubering i medium suppleret med 20 mM ammoniumchlorid at fremkalde cytoplasmatisk alkalinisering. Cytosoliske ekstrakter blev fremstillet og Western blots fremkaldt med antistof mod HIF-1α. Fig. 1F viser, at forebyggelse af intracellulær reduktion pH formindsket HIF-1α nedbrydning med hypericin, men ved den højere 30 uM hypericin koncentration nogle HIF-1α nedbrydning under hypoksi faktisk fandt sted. Denne nedbrydning viste sig at være mindre følsomme over for cathepsin-B-hæmmer CA-074 og kan afspejle inddragelse af en proteasomforløb afhængig mekanisme.

Hypericin interfererer med HIF-1α binding til VEGF og GLUT1 genpromotor HRE-sekvenser

hypericin forbedret HIF-1α nedbrydning og deraf følgende HIF-1 nuklear indhold mangel, blev hypotese at mindske HIF-1 interaktioner med hypoxi responselementer (hres) på stress response genpromotorer såsom VEGF og GLUT1. HIF-1-binding til human VEGF genpromotor HRE blev derfor analyseret i hypericin-behandlede U87-MG, C2

VHL – /- og ARPE-19 celler ved hjælp af Fluorescens eltrafik Shift Assays (F-EMSA). Celler blev udsat for hypericin i 72 timer, kerneekstrakter fremstillet og DNA-protein-kompleks-dannelse med VEGF promotor- HRE element indeholdende fluorescerende prober blev analyseret for SYPRO Ruby fluorescens. In C2

VHL – /- celler, der bærer høj basislinie HIF-1-indhold, HIF-1 dannede DNA-protein-komplekser med HRE probe (figur 2A.). Ingen gratis probe blev påvist (SYBER Green farvning, venstre panel), hvilket afspejler en overvejende bundet DNA-probe. Ved behandling med 30 pM hypericin, HIF-1-HRE kompleksdannelse blev markant nedsat med de fleste DNA-probe resterende ubundet (bane 2)

Fundet på promotorer af:. [A]. VEGF-genet, analyseret ved fluorescens eltrafik Shift Assay (F-EMSA). Nukleare proteiner blev separeret på 6% SDS-PAGE, farvet med SYBER Green mærket DNA-probe og ubundet protein detekteret med SYPRO Ruby proteinbinding fluorochrom. Geler blev scannet med FL-5000 laserbaseret scanner. [B]. Den GLUT1 genet analyseret ved chromatin immunoprecipitation (chip). Sheared chromatin blev immunfældet med anti HIF-1α-antistof og DNA isoleret fra denne kromatin blev amplificeret med primere specifikke for GLUT1 genpromotorregion. [C]. Interferens ved hypericin med VEGF promoter aktivering i tumorcellelinier. Venstre figur – C2

VHL – /- celler. Bane 1 – ubehandlede celler, bane 2-celler behandlet med 30 pM hypericin i 72 timer. Højre figur – U87-MG-celler. Bane 1 – ubehandlede celler, bane 2 – celler udsat for hypoxi (150 uM CoC

2 for sidste 6 timer), bane 3 – CoCl

2-hypoxi for sidste 6 timer og hypericin 30 uM i 72 timer, og bane 4 -. hypericin, 30 uM for 72 timer

I normoxiske U87-mG celler, HIF-1-HRE komplekse var lavt og øget under hypoxi efterlader ingen påviselig fri DNA-probe. Hypoxi-induceret, blev HIF-1-HRE kompleksdannelse ophævet ved hypericin celle behandling (fig. 2A, midterste panel), der forlader DNA-proben overvejende ubundet. I hypoksiske ARPE-19 celler protein-HRE komplekse niveauer var højere i forhold til normoksiske basislinjer og hypericin effektivt reducerede HIF-1 – sonde binding. Ligeledes gratis probe niveauer lavt i hypoxiske celler, forøget efter udsættelse for hypericin (Fig. 2A, højre panel). Behandling med hypericin af cellelinier med høj HIF-1-niveauer på grund af hypoxi eller defekt pVHL (C2

VHL – /- celler) resulterede i reducerede interaktioner med hypoxi respons elementer

HIF-1 interaktioner med andre. stress respons gen-promoter hres som GLUT1 genet blev også påvirket af hypericin, som vist ved kromatin immunpræcipitation analyser. Chromatin fremstillet ud fra kerner af hypericin-behandlede og kontrolceller blev klippet og HIF-1 holdige fragmenter immunfældet med anti-HIF-1-antistof. HRE-bundne HIF-1-niveauer blev bestemt ud fra amplifikation af ekstraheret DNA ved PCR under anvendelse GLUT1 promotor- specifikke prober. I U87-MG-celler udsat for hypoxi resulterede i øgede HIF-1 interaktioner med GLUT1 promotor HRE (fig. 2B midterste panel), mens samtidig eksponering for hypericin reducerede mængderne af promotor bundet HIF-1 (bane 3). Lignende reduktioner fandt sted i ARPE19 celler (Fig. 2B, venstre panel). I C2

VHL – /- celler, forårsaget hypericin dramatiske fald i GLUT1 promotor-bundne HIF-1 (fig 2B, højre panel.). Samlet set reduktioner i HIF-1α cytoplasmatiske indhold i hypericin-behandlede hypoxiske celler resulterede også i reducerede modne HIF-1 transskription fremmende aktiviteter i cellekerner, faldende HIF-1 interaktioner med VEGF og GLUT1 genpromotorer.

hypericin forstyrrer VEGF promoter aktivering i tumorcellelinjer

Faldet i HIF-1 binding til VEGF og Glut1 initiativtagere forårsaget af hypericin, bedt analyser af virkningerne af hypericin på VEGF promoter aktivering. U87-MG og C2

VHL – /- celler blev transient transficeret med en reporterkonstruktion, der indeholder HRE element af VEGF-A-genet (pGL3P-1100). Cellerne blev opdelt i 30 pM hypericin behandlede gruppe (i 72 timer) og ubehandlet kontrolgruppe. Luciferaseaktivitet blev målt over for pGL3P vehikelkontrol vektor transficerede celler blottet for reporterkonstruktet. Fig. 2C (venstre exhibit) viser ekspression af høj luciferaseaktivitet i ubehandlet kontrol C2

VHL – /- transfektantcellerne, der viste en tendens mod undertrykt luciferaseaktivitet i hypericin-behandlede C2

VHL – /- celler med ca. 40% , hvilket antyder, at hypericin tendens til at interferere med VEGF promoter aktivering i C2

VHL – /- celler, men forskellene nåede ikke statistisk signifikans (

P

= 0,06, Mann Whitney-test). Luciferase niveauer af køretøjets plasmid pGL3P var lav og ensartet i begge grupper (ikke vist).

I U87-MG celler, blev VEGF-promotoren også stærkt aktiveret i respons på hypoxi (fig. 2C), mens celle behandling med 30 pM hypericin helt afskaffet hypoxi-induceret promotor aktivering (

P

= 0,05) (3

rd kolonne). Hypericin alene uden hypoxi havde ingen virkning på promoter aktivering (4

th kolonne). pGL3P køretøj styrevektor transfektanter var lave i alle grupper (ikke vist). Således kan hypericin hæmme VEGF-promoter aktivering under hypoxiske betingelser via HIF-1α nedbrydning i U87-MG celler.

Hypericin modulerer VEGF gentranskription i tumorcellelinier

nedregulering af VEGF promoter aktivering grundet hypericin-induceret HIF-1α katabolisme i hypoxiske celler bedt undersøgelse af virkningerne af hypericin-fremkaldt, HIF-1α katabolisme på VEGF gentranskription. U87-MG og ARPE-19 celler udsat for hypericin (72 timer i mørke) blev underkastet CoCl

2 hypoxi i de sidste 6 behandlingsgrupper timer. RNA blev fremstillet og VEGF transkription analyseret ved semikvantitativ RT-PCR under anvendelse af primere spænder exon1 og exon8 af VEGF-A-genet. Disse primere forstærke alle seks VEGF-splejsningsvarianter og semikvantitative analyser gør det muligt differentieret profil analyser af indholdet af hver VEGF splejse udskrift. Resultaterne viser, at i ARPE-19 celler, hypoxi induceret modulationer i VEGF splejsningsvariant transkriptionelle profiler. Når hypoksi blev kombineret med udsættelse for hypericin, transskription af VEGF

189 og VEGF

165 isoformer, som dramatisk øgede under hypoksi faldt (fig. 3A), især med 30 pM dosis (fig. 3A, bane 4). VEGF

145 udtrykt i ubehandlede kontrol celler og undertrykt under hypoxi blev re-udtryk efter hypericin behandling (fig. 3A, bane 4).

A. I ARPE-19 celler, B. i U87-MG celler og C. i C2

VHL – /-. Celler

I U87-MG celler baseline niveauer af nogle VEGF-isoformer under normoxi, hovedsageligt VEGF

189 var høj på grund af hypoxi-uafhængige mekanismer som reaktive ilt arter [21], NO [22], phosphatidylinositol-3-kinase og MAP kinase aktivering gennem virkningen af ​​mTOR [23], eller tab af IDH1 gen funktion i glioblastom [9]. Ikke desto mindre er transskription af VEGF isoformer primært VEGF

206, VEGF

165 og VEGF

121 steg efter celle eksponering for hypoxi. Deres transkription faldt efter celle udsættelse for 30 pM hypericin (fig. 3B, bane 3). I C2

VHL – /- celler konstitutivt udtrykker HIF-1α, VEGF transskription var derfor meget høj ved baseline. Eksponering til hypericin (72 timer) inducerede reduktioner i VEGF

206, VEGF

189 og marginalt også VEGF

165 (fig. 3C). Interessant, når hypericin-behandlede celler blev også udsat for CA-074 (100 ug /ml), cathepsin-B-hæmmer, som forhindrede hypericin-forstærket HIF-1α nedbrydning, VEGF gentranskription blev også stimulerede sammenlignet med celler behandlet med hypericin kun (fig. 3C). Sammenfattende hypericin stimulerede ændringer i VEGF-splejsningsvariant ekspressionsmønstre især i ARPE-19 celler (figur 3A.) Og også påvises i U87-MG og C2

VHL – /-. Celler

Forebyggelse af VEGFR2 /KDR ekspression i hypericin behandlede celler

modulationerne i VEGF gentranskription mønstre induceret af hypericin-medieret accelereret HIF-1α nedbrydning, berettiget analyser af hypericin virkninger på mediatorer af angiogenese på proteinniveauet. Mulige korrelationer med Hsp90 aktiviteter blev også vurderet på grund af hsp90 polyubiquitination, inaktivering og nedbrydning som også fremkaldes af hypericin [14], og rollerne Hsp90 spiller på centrale steder i den angiogene kaskade [2], [24].

Virkninger af hypericin behandling på VEGFR2 /KDR udtryk blev undersøgt i de tre cellelinier, herunder ARPE-19, fordi VEGFR2 også udtrykkes på RPE celler [25]. Behandlingen med hypericin induceret markant undertrykkelse af VEGFR2 cellulære indhold i U87-MG og ARPE-19 celler dog receptor niveauer var upåvirket i renal C2

VHL – /- celler (. Figur 4A). For at bestemme om reduceret VEGFR2 ekspression skyldes formindsket VEGF-produktion vi supplerede vækstmedium U87-MG og ARPE-19 celler med VEGF (10 ng /ml) med eller uden heparin (1 enhed /ml i 48 timer) en dag efter hypericin administration og analyseret VEGFR2 ekspression i disse celler. Disse behandlinger ændrede ikke hypericin nedreguleret VEGFR2 udtryk og steg ikke VEGFR2 niveauer (data ikke vist). Vi har derfor undersøgt, om hypericin moduleret VEGFR2 mRNA ekspressionsniveauer i disse celler. RNA blev fremstillet ud fra hypericin behandlede celler (72 timer i mørke) og semikvantitativ RT-PCR-analyser udført med VEGFR2-specifikke primere under anvendelse VEGFR1 som sammenlignende reference. Disse forsøg viste, at VEGFR2 gentransskription effektivt og selektivt blev inhiberet af hypericin i alle tre cellelinier, hvorimod VEGFR1 transkription blev mindre påvirket (fig S1). De foreslår, at hypericin udløser epigenetiske virkninger selektivt nedregulere ekspression af VEGFR2 og flere andre gener. Men denne store emne overstiger omfanget af dette manuskript og vil blive yderligere omtalt andetsteds.

[A]. Western blot-analyser af VEGFR2 proteinniveauer i cytosoliske ekstrakter fra ubehandlede kontrolceller (C), eller celler behandlet med 30 pM hypericin i 72 timer (HYP). [B]. Farvning af U87-MG celler med Phalloidin-FITC. (1) Ubehandlede celler og (2) celler behandlet med hypericin 30 uM i 72 timer. Orange pile viser F-actinfilamenter; gule pile skildrer kollapsede actin kugler efter udsættelse for hypericin. [C]. VEGFR2-hsp90 kompleksdannelse efter behandling med hypericin 30 uM i 72 timer. Resultater af immunofældning med anti-Hsp90-antistof og udvikling af Western blots med anti-VEGFR2 antistof. Hypericin formindsket VEGFR2-Hsp90 kompleksdannelse. [D]. Induktion af tvungen hsp90 poly-ubiquitinering af hypericin (30 uM i 72 timer) i humane ondartede cellelinjer. Topplade – immunopræcipitation med anti-hsp90 og Western blot med anti-hsp90-antistof (kontrol); midterste panel – immunopræcipitation med anti-hsp90 og Western blot med anti-ubiquitin, og nederste panel immunofældning med anti-ubiquitin og Western blot med anti-hsp90. (I.p. – immunopræcipitation, W. B. – Western blots).

VEGFR2 nedstrøms signalering efter aktivering af VEGF-VEGFR2 interaktioner kræver også samarbejde med hsp90 [24]. Hsp90 engagement er relevant for vores analyser af antiangiogeniske virkninger, fordi vi tidligere rapporteret i murine bryst og planocellulære karcinom tumorceller at hypericin inducerer hsp90 polyubiquitination og accelereret nedbrydning, destabiliserende og nedværdigende hsp90-klient proteiner i disse celler [14]. VEGFR2 nedstrøms signalering aktiverer alphavbeta3 og fokal adhæsion kinase (FAK) til dannelse cytoskeletale fokale adhæsioner og F-actin polymerer [24]. FAK og Src også Hsp90 klient proteiner og faktisk hypericin behandling interfererer med F-actin polymerisation (fig. 4B). Vi har derfor undersøgt hypericin virkninger på VEGFR2 association med hsp90, analysere VEGFR2 trække ned efter immunpræcipitation med anti-hsp90 antistof. Fig. 4C viser, at VEGFR2 co-immunpræcipitater med hsp90, men dette co-immunfældning blev ophævet efter behandling med 30 pM hypericin i alle tre cellelinier. Dette tilsyneladende universelle fund indikerer, at VEGF-VEGFR2-Hsp90 kompleksdannelse aftager på grund af handlinger af hypericin.

Vi har også bekræfte her, at hypericin inducerer hsp90 polyubiquitination i humane cellelinjer. Immunpræcipitation af U87-MG og C2

VHL – /- cellelysater med anti-hsp90 trukket ned ubiquitin efter hypericin eksponering og vice versa: immunopræcipitation med anti-ubiquitin trukket ned hsp90 (figur 4D.)

. hsp90 poly-ubiquitinering interfererer med nukleare transport af HIF-1α før nedbrydning af HIF-1α

for at bestemme om den hypericin-medierede destabilisering af HIF-1α afhænger også af hypericin-inducerede poly-ubiquitinering af hsp90 vi udførte tidsafhængige evalueringer af virkningerne af hypericin på hsp90 poly-ubiquitinering og contemporarily på hsp90-associeret HIF-1α cellulære indhold i U87-mG celler under hypoxi. Cellerne blev eksponeret for 10 og 30 uM af hypericin i 48 timer, på hvilket tidspunkt hsp90 poly-ubiquitinering blev detekterbar og i 72 timer, når chaperonen er nedbrudt [14]. Hypoxi blev induceret med CoCl

2 for de sidste 6 timer af forsøget blev cellerne lyseret, og både cytosoliske og nukleare ekstrakter blev fremstillet. Hsp90 blev immunpræcipiteret med dets tilsvarende antistof og Western blots udviklet med anti-HIF-1α antistoffer at overvåge for hsp-90 bundet HIF-1α og med anti-hsp90 som kontrol (fig. 5A). HIF-1a niveauer bundet til hsp90 blev sammenlignet med total HIF-1α analyseret på Western blots direkte fra hele cytosoliske og nukleare fraktioner. Resultaterne viser, at efter udsættelse for hypericin i 48 timer hsp90 blev poly-ubiquitinerede, endnu chaperone nedbrydning blev primært noteret ved den højere dosis på 30 uM hypericin (fig. 5A, venstre billede). Cytosolisk HIF-1α begyndte at blive nedbrudt på 48 h tidspunkt, efter behandling med 30 pM hypericin (fig. 5B, øvre venstre panel). Imidlertid blev HIF-1α nuklear transport stærkest ophævet af både hypericin dosisniveauer (fig. 5B, 48 timers tid-punkt 2

nd panel, nuklear fraktion). Dette skyldtes den store afhængighed af HIF-1α nuklear transport på intakt hsp90 chaperone aktivitet [26]. Hsp90 poly-ubiquitinering af hypericin forårsaget tab af anstandsdame aktivitet og forhindrede den fysiologiske HIF-1α trans-migration ind i kernen, hvor det normalt dissocierer fra hsp90 [27]. HIF-1α bundet til hsp90 og co-immunpræcipiteret med anti hsp90 antistof blev også stærkere nedbrudt på grund af hsp90 ubiquitinering efter 48 timer (fig. 5B, nederste venstre panel). Ved 72 timer cytosolisk hsp90 var stærkt nedbrudt til under detektionsniveauet (fig. 5A, højre billede) og påvirkes både co-immunpræcipiteret HIF-1α og HIF-1α transporteres ind i kernen (fig. 5B, tredje og fjerde billeder). Det samlede cytosoliske HIF-1α indhold på 72 hr tid-punkt er også stærkt nedbrudt, men nogle HIF-1α protein forblev detekterbar. Således cytosolisk HIF-1α forbundet med hsp90 reduceret som poly-ubiquitinering af hsp90 forøget (fig 5A . 5B), men korrelerede mindre med den faktiske hsp90 nedbrydning

U87-MG celler blev udsat for 10 30 pM hypericin i 48 timer (venstre paneler) og 72 timer (højre paneler) under hypoxiske betingelser (150 uM CoC

2) og hsp90 udtryk og chaperone aktiviteter blev analyseret. Cytosoliske ekstrakter blev immunfældet med anti-hsp90 og Western blots fremkaldt med: [A] anti-Hsp90-antistoffer. [B] anti HIF-1α.