PLoS ONE: Rnd3 Regulerer Lung Cancer Cell Proliferation gennem Notch Signaling

Abstrakt

Rnd3 /RhoE er en lille Rho GTPase involveret i reguleringen af ​​forskellige celle adfærd. Dysregulering af Rnd3 er blevet forbundet med tumorgenese og metastase. Lungekræft er den førende årsag til kræft dødsfald i Vesten og resten af ​​verden. Ekspressionen af ​​Rnd3 og dets ektopisk rolle i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) mangler at blive udforsket. Her har vi rapporterede, at Rnd3 blev nedreguleret i tre NSCLC cellelinier: H358, H520 og A549. Nedreguleringen af ​​Rnd3 førte til hyper-aktivering af Rho-kinase og Notch signalering. Genindførelsen af ​​Rnd3 eller selektiv hæmning af Notch signalering, men ikke Rho kinase signalering, blokerede spredning af H358 og H520 celler. Mekanistisk blev Notch intracellulære domæne (NiCd) protein overflod i H358-celler reguleres af Rnd3-medieret NiCd proteasom nedbrydning. Rnd3 reguleret H358 og H520 celledeling gennem en Notch1 /NiCd /Hes1 signalering akse uafhængigt af Rho kinase

Henvisning:. Tang Y, Hu C, Yang H, Cao L, Li Y, Deng P, et al. (2014) Rnd3 Regulerer Lung Cancer Cell Proliferation gennem Notch signalering. PLoS ONE 9 (11): e111897. doi: 10,1371 /journal.pone.0111897

Redaktør: Jeremy J. W. Chen, Institut for Biomedicinsk Institut, Taiwan

Modtaget: Juni 13, 2014, Accepteret: September 29, 2014; Udgivet: 5. november 2014

Copyright: © 2014 Tang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Key citere for National Klinisk Forskningscenter for Respiratory Disease, National Key Scientific Teknologi Support Program: Collaborative innovation for Klinisk Forskning for kronisk obstruktiv lungesygdom og lungekræft, No. 2013BAI09B09. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i de udviklede lande. De vigtigste typer af lungekræft er småcellet lungecarcinom (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Trods fremskridt i aktuel medicin, den samlede 5-års overlevelse af patienter diagnosticeret med NSCLC er cirka 15%, hvilket viser, at (1) vi mangler en effektiv måde at forhindre NSCLC; og at (2) vi ikke helt forstår NSCLC. Den gentagelse af malignitet og kemoterapi modstand er to store begrænsninger i behandlingen af ​​lungekræft. Af interesse har flere maligniteter, der er resistente over for behandling været tæt forbundet med opreguleret Notch signalering [1]. Rolle Notch signalering i NSCLC er kontroversiel. Nogle undersøgelser har rapporteret, at aktiv Notch1 hæmmede væksten af ​​nogle NSCLC-celler [2], [3], mens en nyere undersøgelse viste, at en Notch1 aktiverende mutation i ca. 10% af NSCLC førte til en dårlig prognose hos patienter [4]. Derfor er yderligere undersøgelse af Notch signalering i NSCLC nødvendigt at forstå denne sygdom og kan være gavnlig til behandling af NSCLC.

Rnd3, også kendt som RhoE, er en lille GTPase involveret i reguleringen af ​​en lang række af celle- adfærd, herunder cytoskelettet, proliferation, migration og apoptose [5] – [9]. Den biologiske funktion af Rnd3 blev først identificeret som et rock1 repressor, der regulerer actin dynamik [5]. For nylig har undersøgelser rapporteret den brede funktion Rnd3 i kræft og neuron systemudvikling. Interessant Rnd3 nedreguleres i forskellige cancerceller, såsom brystkræftceller [8], hepatocellulært carcinom [10], pladecellecarcinom [11], mesenkymale tumorceller [12], etc. Men studier af ekspressionen og biologiske funktion af Rnd3 i NSCLC er meget begrænsede.

rolle Rnd3 i regulering af cellens cyklus blev rapporteret for ti år siden. Tvungen overekspression af Rnd3 inhiberer celleproliferation og serum-induceret S-fase indtastning, uafhængig af RhoA-ROCK signalering, hvilket indikerer, at komplicerede signalering er involveret i cellecyklusregulering [13]. En nylig publikation udforsket en meget interessant forhold mellem Rnd3 og Notch signalering [7]. Udeladelsen af ​​Rnd3 resulterede i en opregulering af Notch signalering i mus ependymceller, fremme proliferation i disse celler. RNAi-medieret Rnd3 nedregulering i to cellelinjer, MDA-MB-231 og HepG2, fremmet celledeling, cellecyklus progression og invasion. Men specielt i NSCLC, er fortsat uklart rolle Rnd3 i lungekræft,. Denne undersøgelse, der for første gang, afdækker de patogene roller Rnd3 i NSCLC, herunder følgende: 1) Rnd3 er nedreguleret i A520, H358 og A549, tre lunge cancer cellelinjer; 2) tvunget ekspression af Rnd3 i A520 og A358-celler inhiberer celleproliferation; 3) Rnd3-medieret celleproliferation reguleres gennem Notch signalering regulering via post-translationel modifikation.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og generering af stabile cellelinjer

H358 (ATCC, CRL-5807), H520 (ATCC, HTB-182) og A549 (ATCC, CCL-185) celler blev dyrket i RPMI-1640 (Life Technologies, Cat # 11.875-085) plus 10% føtalt bovint serum (Life teknologier, Cat # 16000-044) og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, Cat # 15.140-148). HBEC celler blev dyrket i keratinocytter serumfrit medium (Life Technologies, Cat # 17.005-042) plus ekstrakt fra bovin hypofyse (Life Technologies, Cat # 13.028-014) og rekombinant human EGF (Life Technologies, Cat # PHG0311).

Rnd3 cDNA blev subklonet ind lentivirusvektoren pWPI-polio-eGFP. 293 T (Invitrogen, Carlsbad, CA) celler blev transficeret med den lentivirale vektor, der udtrykker Rnd3 og to hjælper-vektorer, pMD2 og psPAX2, til frembringelse af lentivirus. H358 og H520-celler blev derefter inficeret med virus ved en MOI på 10. infektionseffektivitet blev verificeret ved GFP-ekspression ved hjælp af fluorescensmikroskopi. De inficerede celler blev selekteret ved puromycin (2 ug /ml). En enkelt klon blev valgt til frembringelse af stabile cellelinier, H358-Rnd3 og H520-Rnd3.

I de celleantal måling eksperimenter blev celler synkroniseret i 12 timer og 10

5 celler fra hver gruppe blev dyrket i vækstmedium. Celletallet blev talt for hver 24 timer i i alt 5 dage.

immunblotting

Proteinprøver Til Western blot-analyse blev ekstraheret ved RIPA puffer (Thermo Scientific, Cat # 89900) plus en protease inhibitor cocktail (Roche, Cat # 11836153001) og phosphataseinhibitorer (50 mM NaF, 2 mM Na

3VO

4, 4 mM natriumpyrophosphat). Kommercielt tilgængelige antistoffer var fra følgende kilder: MYPT1 (2634 S), phospho-T853 MYPT1 (4563 S) og PDK1 (3062) fra Cell Signaling Technology (MA, USA); MLC2 (PA5-17624) og phospho-Ser20 MLC (PA5-17727) fra Thermo Scientific Pierce (IL, USA); Rock1 (sc-5560) og Rnd3 (sc-53.874) fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Hes1 (ab71559) og Notch1 (ab27526) var fra Abcam (MA, USA). Ækvivalent protein lastning blev bekræftet ved intensiteten af ​​en GAPDH (sc20357, Santa Cruz, CA) blot.

mRNA udvinding og QRT-PCR

Total RNA blev udvundet af Trizol reagens (Life Technologies, 15.596-026). QRT-PCR blev udført under anvendelse af en SYBR green fremgangsmåde med et MasterMix puffersystem. De primere sekvenser var som følger: Rnd3: CTATGACCAGGGGGCAAATA /TCTTCGCTTTGTCCTTTCGT; Jag-1: CTATGATGAGGGGGATGCT /CGTCCATTCAGGCACTGG; Jag-2: TGGGATGCCTGGCACA /CCGGCAGATGCAGGA; Dll-1: GAGGGAGGCCTCGTGGA /AGACCCGAAGTGCCTTTGTA; Dll-4: GCATTGTTTACATTGCATCCTG /GCAAACCCCAGCAAGAGAC; Notch1: CACTGTGGGCGGGTCC /GTTGTATTGGTTCGGCACCAT; Hes1: AGGCGGACATTCTGGAAATG /CGGTACTTCCCCAGCACACTT; GAPDH:. GAGTCAACGGATTTGGTCGT /TTGATTTTGGAGGGATCTCG

BrdU inkorporering assay

Cellerne blev synkroniseret og derefter dyrket i vækstmedier i 12 timer efterfulgt af BrdU (bromdeoxyuridin) behandling i 30 min før høst. Anti-BrdU-antistof (mus, BD, 552.598, 1:1000) blev inkuberet ved 4 ° C i 16 timer, og det sekundære ged-anti-muse-IgG-antistof konjugeret med Alexa Fluor 594 (1:200) blev købt fra Invitrogen ( A11032). Inkubationstiden var 1 time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Kerner blev visualiseret ved DAPI (4 ‘, 6’diamidino-2-phenylindol) (Vectashield, Vector Laboratories, Inc. H1000), og billeder blev erhvervet af fluorescens mikroskopi (DMI 4000B, Leica, Mannheim, Tyskland).

Statistisk analyse

De data er udtrykt som middelværdi ± SD I flere gruppe sammenligninger, envejs ANOVA efterfulgt af Student-Newman-Keuls metode blev anvendt. I 2-gruppe sammenligninger, en uparret, to-tailed studerendes

t

test blev anvendt. Alle analyser blev udført ved SigmaPlot 11,0 (Systat, San Jose, CA, USA). En værdi på P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Rnd3 nedreguleres sammen med øget Notch og Rho kinase aktivitet i H358 og H520 celler

To menneske. NSCLC cellelinjer, H358 og H520, blev anvendt i denne undersøgelse. Humane bronkiale epitelceller (HBEC) blev anvendt som en normal kontrol. Vi har registreret den Rnd3 ekspression på både mRNA og protein niveauer. Sammenlignet med HBEC celler, Rnd3 udtryk var signifikant nedreguleret i H358 og H520-celler (Fig. 1A-C). Rnd3 blev først identificeret som en rock1 endogen inhibitor, der regulerer cytoskelettet. Her undersøgte vi Rho-kinase signalering ved at probe to velkarakteriserede Rho-kinase substrater i disse tre cellelinier. Som vist i fig. 1D-G, phosphoryleringen af ​​myosin phosphatase, målrette subunit 1 (MYPT1) og myosin let kæde-2 (MCL2) var signifikant forøget i H358 og H520 celler, hvilket indikerer en hyper-aktiveret Rho-kinase-aktivitet. Imidlertid rock1 ekspressionsniveauet var ikke forskellig blandt cellelinierne (fig. 1H). En potent Rho kinase 1 aktivator [14], PDK1 som kunne konkurrere med Rnd3 at binde til rock1 blev ekspressionsniveauet også ikke ændret i H358 og H520 celler sammenlignet med de HEBC celler (Fig. S1). Af interesse, ud over den opreguleret Rho-kinase-signalering, vi også observeret hyper-aktiveret Notch signalering i H520 og H358, sammenlignet med HBEC celler (Fig. 1i, 1J), som det fremgår af akkumulering af Notch 1 aktive form , Notch intracellulære domæne (NiCd). Både Rho-kinase og Notch er blevet grundigt undersøgt i forskellige celler og genetiske modeller. Den biologiske rolle af aktivering af disse to signalveje i NSCLC, og forholdet mellem Rnd3 nedregulering og NiCd opregulering i lungecancere er endnu ikke blevet karakteriseret.

(A) Rnd3 mRNA detekteret ved qRT- PCR er nedreguleret i H358 og H520 i forhold til HBEC. (B) Rnd3 protein ekspressionsniveauer i celler ved Western blot. (C) Densitometri kvantificering af vestlige band intensitet i B. (D), (F), (H) (I) et Western blot at detektere phosphoryleret MYPT1, phosphoryleret MLC2, rock1 og NiCd i celler. (E), (G) (J) Densitometri kvantificering af vestlige band intensitet viste opregulering af Rho kinase aktivitet og NICD udtryk i H358 og H520 celler sammenlignet med HBEC. Western blots blev kvantificeret fra tre uafhængige eksperimentelle gentagelser. BrdU-positive celler blev kvantificeret fra 8 billeder taget fra fire objektglas. Dataene repræsenterer midler ± SD

Hæmning af proliferation med stabil overekspression af Rnd3 i H520 og H358

For at undersøge ektopisk rolle reduceret Rnd3 udtryk i H520 og H358 celler, vi genereret celle linjer stabilt udtrykker Rnd3-GFP ved anvendelse af et lentivirus system. Rnd3 ekspression blev verificeret ved både anti-Rnd3 (detekterer endogent og eksogent Rnd3) og anti-GFP (detekterer exogent Rnd3 kun) antistoffer (fig. 2A og 2C). H358-Rnd3 og H520-Rnd3 stabilt udtrykt Rnd3 på 2,7 gange og 4,4 gange højere i forhold til H358 og H520 celler henholdsvis (fig. 2B og 2D). Dernæst undersøgte vi proliferationshastigheden af ​​de to stabile cellelinjer under anvendelse af en BrdU inkorporering assay. Cellerne blev synkroniseret ved serum deprivation og derefter dyrket i vækstmedium i 12 timer, efterfulgt af BrdU behandling i 30 minutter før høst. Cellerne blev overført til lysbilleder ved Cytospin for farvning og billeddannelse. Spredningen sats angivet med BrdU positiv farvning blev signifikant reduceret i H358-Rnd3 celler i forhold til H358-celler (fig. 2E og 2F). Det samme resultat blev observeret i H520-Rnd3 celler sammenlignet med H520-celler (fig. 2G og 2H). Vi tælles også forholdet mellem BrdU + celle til GFP + celler som vist i fig. S2. Forholdet var signifikant højere i H358 (50%) og H520 (41%) celler sammenlignet med H358-Rnd3 (15%) og H520-Rnd3 (11%) celler, (fig. S2A og S2B). Desuden blev 1 × 10

5 celler fra hver gruppe synkroniseret og derefter dyrket. Celletallet blev talt på forskellige tidspunkter (dag 0, 1, 2, 3, 4 og 5). Vi observerede en markant stigning i celleantal i H358 og H520 celler. Men denne stigning bemærkelsesværdigt svækket i både H358-Rnd3 og H520-Rnd3 celler startede på dag 2 (fig. 2I og 2J). Tilsammen tvungen overekspression af Rnd3 i H358 og H520 kan reducere spredningen på disse celler. Hæmning af tumorcellevækst er en af ​​de fleste vigtige strategier i behandling af cancer. Rolle Rnd3 hæmme udbredelsen af ​​disse to NSCLCs gør det til et muligt mål for kræftbehandlingen

(A) (B) Dannelsen af ​​en H358 cellelinie stabilt udtrykker GFP-mærkede Rnd3. Den Rnd3 udtryk blev bekræftet ved både Rnd3 og GFP antistoffer. (C) (D) Dannelsen af ​​en H358 cellelinie stabilt udtrykker GFP-mærkede Rnd3. Den Rnd3 udtryk blev bekræftet ved både Rnd3 og GFP antistoffer. (E) (F) H358-Rnd3 har en lavere spredning sats sammenlignet med H358 celler som påvist ved BrdU inkorporering. (G) (H) H520-Rnd3 har en lavere spredning sats sammenlignet med H520 celler som påvist ved BrdU inkorporering. (I) (J) Cell nummer blev kvantificeret på forskellige tidspunkter punkt. Et gennemsnit på tre prøver ved hvert tidspunkt blev præsenteret i denne figur. Western blots blev kvantificeret fra tre uafhængige eksperimentelle gentagelser. Dataene repræsenterer midler ± SD

Genindførelse Rnd3 stumpe Rho kinase og Notch signalering i H520 og H358 celler

Vi viste højere Rho-kinase aktiviteter og NICD udtryk sammen med et reduceret Rnd3 udtryk niveau i H520 og H358 celler i forhold til de normale lunge epitelceller, HBEC (fig. 1). Vi næste undersøgte, om der eksisterer en sammenhæng mellem lavere Rnd3 udtryk og højere Rho-kinase og NICD udtryk. NiCd-ekspression blev nedreguleret mere end 3,5 gange i H520-Rnd3 celler sammenlignet med H520-celler (fig. 3A og 3B). Det phosphorylerede myosin letkæde-phosphatase, subunit 1 (pMYPT1) og myosin let kæde (pMLC2) blev nedreguleret 2,5- og 1,8 gange i henholdsvis H520-Rnd3 celler sammenlignet med H520-celler (fig. 3C og 3D). I de H358 celler, observerede vi den samme tendens som NiCd-ekspression og Rho kinase aktivitet, når Rnd3 blev overudtrykt. NiCd-ekspression blev reduceret 2,9 gange i H358-Rnd3 celler sammenlignet med H358-celler (fig. 3E og 3F), mens pMYPT1 (2,46 gange) og pMLC2 (1,83 gange) også blev reduceret i H358-Rnd3 celler sammenlignet med H358 celler (fig. 3G og 3H). Desuden har overekspression af Rnd3 i H358 og H520 celler ikke ændre ekspressionen af ​​Notch-ligand som vist i fig. S3. Ekspression af humant Jagged-1 (Jag-1), Jagged-2, (Jag-2), Delta-like-1 (Dll-1) og Delta-lignende-4 (Dll-4) mRNA blev målt ved QRT-PCR . Der er ingen statistisk signifikant ændring i forekomsten af ​​de mRNA i H358 og H520 sammenlignede den H358-Rnd3 og H520-Rnd3 henholdsvis (fig. S3A og S3B). Disse resultater tyder på, at Rnd3 kunne regulere både Rho kinase og NICD signalering i H358 og H520 celler. Rnd3 er en regulator hæmmende Rho kinase aktivering og NICD udtryk i NSCLCs. Rnd3 medieret Notch signalering modulation ikke gennem regulering af Notch ligand udtryk

(A) (B) Nedsat NICD udtryk i H520-Rnd3 celler i forhold til H520 celler. (C) (D) Nedsat Rho kinase aktivitet i H520-Rnd3 celler sammenlignet med H520 celler detekteret af antistoffer specifikke for pMYPT1 og pMLC2. (E) (F) Nedsat NICD udtryk i H358-Rnd3 celler i forhold til H358 celler. (G) (H) Nedsat Rho kinase aktivitet i H358-Rnd3 celler i forhold til H358 celler detekteret af antistoffer specifikke for pMYPT1 og pMLC2. Western blots blev kvantificeret fra tre uafhængige eksperimentelle gentagelser. Dataene repræsenterer midler ± SD

Hæmning af Notch signalering forhindret spredning af H520 og H358 celler

Vi viste, at tvungen overekspression af Rnd3 ved lentivirus i både H520 og H358 celler 1) hæmmede proliferation (fig. 2) og 2) blokerede aktiveringen af ​​Rho-kinase og Notch /NiCd signalering. For at bestemme hvilken signalvej kan bidrage til proliferationshastighed blev kemiske inhibitorer anvendt til cellerne. Uanset om Fasudil, en Rho kinase inhibitor [15], [16], kan påvirke celledeling sats i H358 og H520 celler? Vores data viser, at inhibering af Rho-kinase-aktivitet ved Fasudil ikke ændrede proliferation af H520 og H358-celler (Fig. S4). Imidlertid forbindelse E [17], en specifik Notch signalering inhibitor, kan dæmpe proliferation i begge cellelinier (fig. 4). Behandling med forbindelse E reducerede proliferation af H358 ved 40% i forhold til dSmo behandlede kontrolgruppe som angivet ved en BrdU inkorporering assay (fig. 4A og 4B). Spredning faldt til kun 32% af kontrollen i H520-gruppen (fig. 4C og 4D). For at teste den mulige cytotoksicitet af forbindelse E, afprøvede vi den celledød ved trypanblåt-farvning. Ved koncentration på 5 nM sammensatte E, vi ikke registrere en betydelig celledød sammenlignet med ikke-behandlede gruppe i både H358 og H520 celler (Fig. S6, billede 2 og 6 i forhold til 1 og 5, henholdsvis), hvilket tyder på cytotoksicitet af Forbindelse E i alle tre cellelinier ved denne koncentration var minimal. Vi yderligere øget forbindelse E fusions 50 nM og 500 nM, og fandt, at kun mindre end 5% celledød blev observeret i 50 nM gruppe (fig S6, billede 3, 7 og 11.), Mens massiv celledød ( 50%) blev forårsaget af høj dosering forbindelse E (500 nM, fig. S6, billede 4, 8 og 12). Forsøget hjælp selektive signalering hæmmere foreslog, at Rnd3 nedregulering medieret NICD opregulering kan spille en større rolle i udbredelsen af ​​H358 og H520 celler, og at denne spredning er ikke Rho kinase afhængige.

(A) (B) Anvendelsen af ​​sammensatte E blokerer spredning af H358 celler som påvist ved en BrdU inkorporering assay. Cellerne blev behandlet med forbindelse E ved en slutkoncentration på 5 nM og synkroniseret med serum depletion efterfulgt af vækst i medier i 12 timer. Derefter blev cellerne behandlet med BrdU i 30 minutter, inden de blev høstet til analyse. (C) (D) Anvendelsen af ​​sammensatte E blokerer spredning af H520 celler som påvist ved en BrdU inkorporering assay. Cellerne blev behandlet med forbindelse E ved en slutkoncentration på 5 nM og synkroniseret med serum depletion efterfulgt af vækst i medier i 12 timer. Derefter blev cellerne behandlet med BrdU i 30 minutter, inden de blev høstet til analyse. BrdU-positive celler blev kvantificeret fra 8 billeder taget fra fire objektglas. Dataene repræsenterer betyder ± S. D.

Rnd3 regulerer spredning ved at modulere NiCd /Hes1 signalering akse i H520 og H358 celler

Notch signalering er en vigtig cellecyklus regulator. Blokering Notch signalering inhiberer væksten af ​​forskellige celler [18] – [20]. Mærkbart, en nylig undersøgelse fra Chang et al. gruppen viste, at NICD regulerer epidermal proliferation gennem opregulering af Hes1 i Rnd3 knockout-mus [21]. Derfor undersøgte vi Hes1 udtryk i vores celler. Hes1 blev opreguleret 5 gange i H520 og H358 i forhold til de HBEC celler (fig. 5A og 5B). I overensstemmelse med en svækket spredning observeret i H520-Rnd3 og H358-Rnd3 celler (Fig. 3E-3H), Hes1 udtryk blev også nedreguleret med 2 gange og 2,5 gange i disse to cellelinjer i forhold til H520 og H358, . henholdsvis (. figur 5C-5F), hvilket tyder på, at NiCd-hæmning-medierede fald i de spredning satser H520-Rnd3 og H358-Rnd3 celler kan være gennem nedreguleret Hes1 udtryk

(A) (B) Hes1 blev opreguleret i H520 og H358 celler i forhold til HBEC celler. (C-F) Hes1 udtryk faldt da Rnd3 blev stabilt overudtrykt i H358 og H520 celler. (G) (H) Forbigående overekspression af Rnd3 i H358 celler nedreguleret NICD og Hes1 i en dosis afhængig måde. (I) (J) Hæmning af proteasom aktivitet ved MG132 (slutkoncentration på 15 uM) afskaffet Rnd3 dosis afhængig NICD nedregulering i H358 celler. Western blots blev kvantificeret fra tre uafhængige eksperimentelle gentagelser. Data repræsenterer middelværdier ± S.D. *

s

0,05 sammenlignet med kontrol (gruppe 0); #

s

0,05 sammenlignet med gruppe 1; $

s

0,05 sammenlignet med gruppe 3. Data repræsenterer midler ± SD

For at definere forholdet mellem Rnd3 og NiCd, vi udførte en dosis afhængig udtryk for Rnd3 i H358 celler . myc-Rnd3 blev forbigående transficeret ind i H358 celler ved forskellige doseringer (0, 1 ug, 3 ug, 5 ug). Derefter undersøgte vi ekspressionen af ​​NiCd og Hes1 ved Western blot. Med øget Rnd3 udtryk, NiCd og Hes1 ekspressionsniveauerne faldt (fig. 5G og 5H). Ikke overraskende Hes1 mRNA, et NiCd målgen, ændret tilsvarende (fig. S5 fyldt sort bjælke). Men vi ikke observere nogen ændring i Notch1 mRNA (fig. S5 tom bar), på trods af det betydelige fald i protein niveau på grund af Rnd3 overekspression, hvilket tyder på, at Rnd3 reguleret NICD på post-translationel niveau, fordi NiCd niveau reguleres af proteasom nedbrydning [22]. Vi hæmmede proteasom aktivitet under anvendelse af MG132 og fandt, at Rnd3 dosis afhængig NICD nedbrydning blev fuldstændig blokeret (fig. 5I og 5J), hvilket tyder på en post-translationel regulerende rolle Rnd3 i NICD nedbrydning.

Rnd3 regulerer spredning gennem Notch1 signalering i lungeadenocarcinom celler

H358 cellelinien blev afledt fra lunge bronchioalveolar carcinom og H520 cellelinien blev afledt fra lunge squamouse cellecarcinom. Men den største undertype af NSCLC var lungeadenocarcinom. Så vi bekræftede vores studie i én lungeadenokarcinom celler, A549, som vist i fig. 6. Rnd3 blev nedreguleret sammen med opreguleret Rho kinase og Notch1 signalering i A549 celler i forhold til HBEC celler (fig. 6a og 6b). Vi kvantificeret opregulering fold i forandring i to signalering. Resultaterne var viste i fig. 6C. Rho-kinase signalering blev opreguleret med næsten 4 gange fremgår af pMYPT1 niveau; Den Notch1 signalering blev opreguleret med 5 gange dokumenteret ved NICD niveau. Inhibering af Notch1 signalering ved Forbindelse E blokerede proliferation af A549-celler (fig. 6D og 6E). Cytotoksiciteten af ​​forbindelse E i A549 celler blev også evalueret ved trypanblåt-farvning. Som vist i fig. S6 (billede 9 til 12), 5 nM forbindelse E forårsagede ingen signifikant død sammenlignet med baseline tilstand i A549 celler. Mekanistisk, Rnd3 reguleret celledeling gennem NiCd /Hes1 signalering. Overekspression Rnd3 undertrykt NiCd og Hes1 ekspression i en dosis-afhængig måde i A549-celler (fig. 6F og 6G). Vores resultater i A549 celler var i overensstemmelse med resultaterne fra H358 og H520 celler, hvilket tyder på Rnd3-NICD-Hes1 signalering var en generelt molekylær mekanisme til at regulere NSCLC celler vækst. Sammen blev højere NiCd- og Hes1 udtryk og lavere Rnd3 udtryk observeret i H520, H358 og A549 celler i forhold til HBEC celler. Genindførelse af Rnd3 hæmmede NICD og Hes1 udtryk, hvilket resulterede i nedsat proliferation satser H520 og H358 celler. Blokering af Notch1 signalering hæmmede celleproliferation i H358, H520 og A549 celler. Rnd3 reguleret NiCd overflod gennem at spørge sin proteasomalaktivitet nedbrydning i NSCLCs.

(A) Rnd3 mRNA påvist ved QRT-PCR er nedreguleret i A459 i forhold til HBEC. (B) (C) Et western blot at detektere phosphoryleret MYPT1, NICD i celler. (D) (E) Anvendelsen af ​​sammensatte E blokerer spredning af A459 celler som påvist ved en BrdU inkorporering assay. Cellerne blev behandlet med forbindelse E ved en slutkoncentration på 5 nM og synkroniseret med serum depletion efterfulgt af vækst i medier i 12 timer. Derefter blev cellerne behandlet med BrdU i 30 minutter, inden de blev høstet til analyse. (F) (G) Forbigående overekspression af Rnd3 i A549-celler nedreguleret NiCd og Hes1 i en dosis-afhængig måde. Data repræsenterer middelværdier ± S.D. *

s

0,05 sammenlignet med kontrol (gruppe 0); #

s

0,05 sammenlignet med gruppe 1; $

s

0,05 sammenlignet med gruppe 3. Data repræsenterer midler ± SD

Diskussion

Rnd3 tilhører Ras superfamilien og er en lille Rho GTPase som regulerer en række cellefunktioner og sygdomme. Det blev oprindeligt identificeret som et rock1 endogen inhibitor. Rnd3 binder til rock1 at inhibere signalering nedstrøms [5]. For nylig har undersøgelser understreget kritiske rolle Rnd3 i forskellige typer af cancer. Rnd3 nedreguleres i mange kræftformer, såsom hepatocellulært carcinom [10], [23], mesenkymale tumorceller [12], og prostatakræft [12]. Men i nogle kræftformer, Rnd3 opreguleres, såsom i pancreas tumorer [24], [25], coloncancer cellelinier [25] og nogle melanomer [26]. Disse forskelle antyder, at Rnd3 har specifikke roller i forskellige cellelinier. Interessant, som et gen stærkt relateret til tumorer, forskning i rollen som Rnd3 i NSCLC er yderst mangelfuld. To undersøgelser viste, at Rnd3 overekspression kan være forbundet med en ugunstig prognose i NSCLC-patienter [27], [28], mens den præcise rolle af Rnd3 i NSCLC endnu ikke blevet undersøgt. Her har vi rapporteret at Rnd3 nedreguleres i H358, H520 og A549-celler, og dette nedregulering fremmer væksten af ​​disse to cellelinier og afhænger opreguleret Notch signalering.

En af de de fleste vigtige strategier til kurere kræft er inhibering af den ukontrollerede tumorcelleproliferation. Men en mangel på specifik inhibering er det store problem står i klinikken. Forståelse af unikke reguleringsmekanisme af cellecyklussen i cancerceller ville favorisere opdagelsen af ​​nye lægemidler og nye behandlinger for cancer. Rnd3 overekspression i fibroblaster hæmmer S post fasen ved at blokere cyklin D1 udtryk på post-transkriptionelle niveau [13]. I den samme undersøgelse, gjorde overekspression af cyklin D1 ikke redde Rnd3-medieret cellecyklusstop, hvilket tyder på, at andre spillere er involveret cellecyklus regulering. I prostatacancerceller, Rnd3 ekspression inducerer de celler standset i G2 /M i stedet for i G1, som det ses i fibroblaster, hvilket antyder, at Rnd3 har evnen til at regulere cellecyklus ved forskellige faser [29]. Vores data viste, at Notch /Hes1 signalering er kritisk i Rnd3 mangel-medieret vækst i H358, H520 og A549 celler. Dette fund udvider forståelsen af ​​Rnd3 funktion i kræftcellen cyklus regulering og giver også et potentielt mål for NSCLC behandling.

Rnd3 udtryk er korreleret med celle migration i udvikling og sygdomme. To nylige undersøgelser konstateret, at Rnd3 reguleret neuron migration gennem Rho kinase afhængig signalering [30], [31]. I mellemtiden i kræft, nedregulering af Rnd3 er tæt forbundet med invasion og metastase [10], [23], [32]. Den potentielle mekanisme kan også være gennem RhoA /rock1 signalering. I denne undersøgelse viste vi, at både NiCd og Rho-kinase aktiveres i H358, H520 og A549-celler sammenlignet med HBEC. Genindførelse af Rnd3 inhiberede begge signalveje. Men kun Indskæring signalering hæmning forhindrer hyper-vækst i H358 og H520 celler; Rho-kinase-inhibering ikke. Yderligere undersøgelser for at undersøge reguleringen af ​​tumorigenese, migration og tumor celle apoptose i respons på Rho Kinase hæmning ville være nødvendigt og interessant.

Notch er et evolutionært bevaret transmembrane receptor er involveret i udvikling og sygdomme. Ved ligand stimulation, kan Notch spaltes ved γ-sekretase. Den intracellulære del (NiCd) kan translokere ind i kernen for at initiere transkription. Tvungen ekspression af Notch 1 inhiberede væksten af ​​A549-celler i kultur [2]. Imidlertid har en uafhængig undersøgelse udfordret dette begreb [33]. For nylig er et Notch 1 aktivering mutant blevet fundet hos ca. 10% af NSCLC, og mutationerne medførte en dårligere prognose hos patienter [4]. Denne kontrovers antyder, i hvert fald, at en) funktion af Notch 1 i NSCLC er diversificeret i forskellige celler og forskellige kræft faser; 2) Notch1 udtryk bør overvejes, mens behandling af patienter; 3) Vi har hårdt brug for at forstå den rolle Notch1 i NSCLC. I denne undersøgelse vores data viste, at Notch signalering er aktiveret i H358 og H520 celler, og denne aktivering kørte proliferationen af ​​disse to celler gennem Hes1. Rnd3 kunne undertrykke H358, H520 og A549 celler spredning ved antagonisering Notch signalering i en post-translationel måde.

En nyligt offentliggjort undersøgelse fremhævet, at Rnd3 var en nedstrøms mediator af Notch signalering i planocellulært karcinom (SCC) i huden epitel [34]. Disse forfattere foreslået, at Rnd3 er en transskriptionel mål af aktiveret Notch1, og Rnd3 udtømning undertrykker Notch signalering ved at mediere nukleare translokation af NiCd gennem en interaktion med importins. I vores undersøgelse fandt vi, at Rnd3 overekspression undertrykt Notch signalering ved at blokere NICD nedbrydning. Disse afvigelser kan være fordi 1) en anden cellelinie blev anvendt til undersøgelsen; 2) mere sandsynligt, disse to typer af regulering sameksisterer i celler, der arbejder som en feedback-mekanisme til præcist at kontrollere Notch signalering.

Angivelse af Rnd3 Express var nøjagtigt reguleret i humane tumorvæv. Rnd3 blev opreguleret i tyktarmskræft sammenlignet med normalt humant kolorektal væv [35]. Mens nedregulering af Rnd3 var observation i human lever tumorvæv og humane øsofageale pladecellecarcinom væv sammenlignet med de tilstødende normale væv henholdsvis [11], [36]. Selv om de forskellige ekspressionsmønster af Rnd3 blev fundet i forskellige tumorer hos mennesker, blev Rnd3 ekspression tæt forbundet med tumorcelleproliferation, cellemigration /metastase og diagnose /prognose. I betragtning af at Rnd3 blev nedreguleret i NSCLC celler og nedregulering af Rnd3 forfremmet NSCLC celler spredning på, ville det være interessant og nødvendigt at evaluere Rnd3 udtryk i humane lungecancer vævsprøver.

Samlet vi er den første gruppe til at rapportere, at Rnd3 er nedreguleret i H358, H520 og A549 celler, hvilket resulterer i en hyper-aktivering af Notch og Rho-kinase signalering. Mekanistisk, Rnd3 regulerer spredning af H358, H520 og A549 celler gennem NiCd /Hes1 signalering akse.

Støtte Information

Figur S1.

Ekspression af PDK1, en Rho-kinase-aktivator, forbliver uændret i H358 og H520 celler sammenlignet med HBEC celler.