PLoS ONE: Cancer Cells resistente over for behandling Fremme Cell Surface Relocalization af GRP78 Hvilke komplekser med PI3K og Forbedrer PI (3,4,5) P3 Production

Abstrakt

Traditionelt GRP78 er blevet betragtet som en endoplasmatisk reticulum (ER) luminale protein grundet dens carboxyl KDEL- fastholdelse motiv. For nylig er en underfraktion af GRP78 fundet at lokalisere til overfladen af ​​specifikke celletyper, der tjener som co-receptorer og regulering signalering. Dog er den fysiologiske relevans af celleoverfladen GRP78 (sGRP78) udtryk i kræft og dets funktionelle interaktioner ved celleoverfladen bare opstå. I denne rapport, vi kombineret biokemiske, billedbehandling og mutationsmønstre tilgange til at løse disse problemer. Til påvisning af sGRP78, vi udnyttet en muse monoklonalt antistof yderst kraftig og specifik for GRP78 eller epitop-tagget GRP78, kombineret med billedbehandling og biokemiske teknikker, der tillod påvisning af sGRP78 men ikke intracellulært GRP78. Vore undersøgelser viste, at bryst- og prostatacancerceller resistente over for hormonbehandling aktivt at fremme GRP78 til celleoverfladen, som yderligere kan hæves ved en række ER stress-inducerende betingelser. Vi viste, at sGRP78 danner kompleks med PI3K, og overekspression af sGRP78 fremmer PIP3 dannelse, indikerer PI3K-aktivering. Vi opdagede endvidere, at en insertion mutant af GRP78 på N-terminus domæne, og samtidig bevare stabil ekspression og evnen til at translokere til celleoverfladen som vildtypeproteinet, udviste reduceret kompleksdannelse med p85 og produktion af PIP3. Således er vores undersøgelser giver en mekanistisk forklaring på regulering af PI3K /AKT signalering ved sGRP78. Vores resultater tyder på, at målrette sGRP78 kan undertrykke terapeutisk modstand i kræftceller og tilbyde en ny strategi for at undertrykke PI3K aktivitet

Henvisning:. Zhang Y, Tseng CC, Tsai YL, Fu X, Schiff R, Lee AS (2013 ) Cancer Cells resistente over for behandling Fremme Cell Surface Relocalization af GRP78 Hvilke komplekser med PI3K og Forbedrer PI (3,4,5) P3 Production. PLoS ONE 8 (11): e80071. doi: 10,1371 /journal.pone.0080071

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: August 2, 2013; Accepteret: 8 oktober 2013; Udgivet: 11. november 2013 |

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health (NIH) giver R01 CA027607 og P01 AG034906 at ASL; P50 CA058183 (Breast Cancer SPORE), P01 CA030195, The Breast Cancer Research Foundation og SU2C /Breast program til RS; P30 CA014089 (USC Norris Comprehensive Cancer Center Cell og Tissue Imaging Core) og P30 DK048522 (USC Forskningscenter for leversygdomme Cell og Tissue Imaging Core). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

78 kDa glucose-reguleret protein (GRP78), også benævnt BiP /HSPA5, er en vigtig endoplasmatiske reticulum (eR) chaperone med anti-apoptotiske egenskaber [1] og en master regulator af eR stress signalering [2], [3]. Tumorceller udsættes for ER stress på grund af iboende faktorer med ændret metabolisme og ydre faktorer af hypoxi og næringsberøvelse. ER stress induktion af GRP78 i cancerceller begunstiger celleoverlevelse, tumorprogression [4], [5] og bibringer lægemiddelresistens i både prolifererende og hvilende cancerceller, såvel som tumorassocierede endotelceller [6] – [11]. Derfor forstå, hvordan GRP78 udøver sine pleiotropiske virkninger på celleproliferation og overlevelse er af stor betydning.

Traditionelt GRP78 har været betragtet som en ER luminale protein på grund af sin carboxyl KDEL- fastholdelse motiv [12]. For nylig blev en underfraktion af GRP78 fundet at lokalisere til overfladen af ​​specifikke celletyper, især i cancerceller [13] – [16]. Celle overflade proteomanalyse profilering af tumorceller viste en relativ overflod af heat shock chaperoner og glucose-reguleret proteiner, herunder GRP78 [17]. Vigtigt er, præferentiel ekspression af GRP78 på overfladen af ​​tumorceller, men ikke i normale organer muliggør specifik tumor målretning, hvilket fører til tumor suppression uden skadelige virkninger på normale væv [18] – [21].

Evidence er ved at opstå, at sGRP78 kan danne komplekser med specifikke celleoverfladeproteiner og regulere signaltransduktion [13], [14], [16], såsom at være en co-receptor for proteinaseinhibitor α2-makroglobulin (α2-M *) induceret signaltransduktion for kræft overlevelse og metastase [22], [23]. Cripto, et GPI-forankret celleoverfladeprotein nøglen til human tumor progression, og sGRP78 danne et kompleks og samarbejde til at inhibere TGF-β-signalering og forbedre cellevækst og PI3K /AKT aktivering [24], [25]. Derudover er sGRP78 kræves til T-cadherin-afhængig endotelcelle overlevelse [26], aktivering af apoptose medieret af Kringle 5 [27], [28] og ekstracellulær Par-4 og TRAIL [29], samt viral indgang i værten celler [30], [31]. For nylig vi vist celleoverfladen lokalisering af GRP78 reguleres af ER hentning maskiner og forbedret ved udtømning af Ca

2+ fra ER [32]. Cancerceller er ofte udsat for ER stress, som forværres af cytotoksisk behandling, der fører til resistens. Men om patologisk stress, såsom udvikling af terapeutisk resistens, fører til relocalization af GRP78 til celleoverfladen er ikke kendt.

PI3K /AKT pathway aktiveres i en bred vifte af cancere, der fører til proliferation og terapeutisk modstand [33]. PI3K har to underenheder, p85 regulatoriske underenhed og den p110-katalytiske underenhed. For PI3K-aktivering, tyrosinphosphorylering af p85 regulatoriske underenhed af PI3K lindrer sin inhiberende aktivitet på PI3K, hvilket fører til dens aktivering. Ved binding til den aktiverede vækstfaktorreceptor, er PI3K rekrutteret til plasmamembranen. PI (4,5) P2 phosphoryleres med PI3K til opnåelse PI (3,4,5) P3, som fremmer membran lokalisering af PDK1, som derefter phosphorylerer og aktiverer AKT. Gennem knockdown af GRP78 ved siRNA, ligering af celleoverflade GRP78 med antistof og i genetiske modeller af cancer, GRP78 er blevet etableret som en ny regulator af PI3K signalering både in vitro og in vivo [16], [25], [34], [35]. Mens der kan være flere mekanismer hvorved GRP78 kan påvirke AKT aktivering, er det blevet rapporteret, at antistof rettet mod den N-terminale ende af grp78 efterligner receptor-anerkendte former af α2-M * som en ligand og driver PI3K-afhængig aktivering af AKT og efterfølgende stimulering af cellulær proliferation in vitro [21], [36]. Omvendt er en carboxylterminale domæne reaktive antistof-virker som en antagonist af α2-M * og undertrykker α2-M * induceret AKT phosphorylering [21]. For nylig, er et monoklonalt antistof rettet mod celleoverfladen GRP78 vist at undertrykke PI3K /AKT signalering, tumor udvikling og metastase i flere kræftmodeller [37]. På trods af disse fremskridt, er lidt kendt om, hvordan sGRP78 regulerer PI3K aktivitet. I denne rapport, vi analyserede sGRP78 ekspression i bryst- og prostatakræft-cellelinier resistente over for hormonbehandling, og undersøgt dens regulering af PIP3 produktion. Disse resultater udvide vores viden om sGRP78 og har stor betydning for kræftbehandling.

Materialer og metoder

Alle protokoller for anvendelsen af ​​dyr blev gennemgået og godkendt af USC Institutional Animal Care og brug Udvalg. Dyret sikkerhed nummer er A3518-01. Protokollen nummer er 9964.

cellelinjer og kultur

Mus embryonale fibroblast (MEF) celler [38], humane cellelinjer, HEK293T [32] og HeLa [32], blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin. Humane cellelinjer, LNCaP (ATCC, Manassas, VA) og C4-2B (Viromed Lab, Minneapolis, MN), blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. De MCF7L parentale celler [39] blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og 1% penicillin /streptomycin /glutamin; De MCF7L-Tamr celler var i det samme medium bortset fra phenolrødtfrit (PRF) RPMI 1640 og 10% trækul dextran strippet (CS) FBS. Det parenterale MCF7 /HER2-18 celler [40] blev dyrket i DMEM indeholdende 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin, 0,4% geneticin (Life Technologies, Grand Island, NY) og 15 ug /ml insulin (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO); De MCF7 /HER2-18-Tamr celler var i det samme medium med undtagelse af PRF DMEM og 10% CS-FBS. De Tamr celler af både MCF7L og MCF7-HER2-18 modeller blev opretholdt i medium indeholdende 100 nM 4-hydroxytamoxifen (Sigma-Aldrich) som slutkoncentration. Østrogen-afhængige cellelinie, MCF-7 /BUS, blev venligst tilvejebragt af A.M. Soto (Tufts University, Medford, MA) og er blevet beskrevet [41], [42]. Isoleringen og dyrkningsbetingelser for østrogen sult resistent klon MCF-7 /BUS-10 er blevet beskrevet [43]. Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2, 95% luft. Mod stress behandling, blev cellerne behandlet med thapsigargin (Tg) på 300 nM, tunicamycin (Tu) 1.5 ug /ml i 16 timer, eller 2-deoxyglucose (2DG) ved 10 mM i 24 timer.

Plasmider

opførelsen af ​​FLAG-GRP78 med en FLAG-tag indsættes efter eR signal peptid (aa 1-18) af fuld længde human GRP78 (aa 1-654) er blevet beskrevet [32]. GRP78-103F indeholdende et FLAG-mærke indsættes lige efter aa 103 af human GRP78 blev konstrueret som følger: fuld-længde human GRP78 i pcDNA3 (Life Technologies) backbone blev anvendt som template med QuikChange site-directed mutagenese (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Den fulde længde human PI3K regulatoriske underenhed, p85 alpha-cDNA, blev amplificeret ved RT-PCR fra human HEK293 RNA og subklonet ind i pcDNA3 ved BamHI- og Xbal-stederne.

transfektionsbetingelser Salg

Cellerne blev dyrket til 60-80% konfluens og transficeret med BIOT (Bioland Scientific, Paramount, CA) ifølge producentens instruktioner, som beskrevet [32].

Immunblotanalyse

Celler blev lyseret i radioimmunudfældning (RIPA) buffer suppleret med kompetent proteasehæmmer (Thermo Scientific, Rockford, IL). Cellelysaterne blev underkastet 10% SDS-geler og Western blot-analyser som beskrevet [32]. Anvendte antistoffer var: muse-anti-FLAG-antistof (Sigma-Aldrich), 1:1000; muse-anti-GRP78 antistof MAb159 (gave fra P. Gill, USC), 1:2000; kanin anti-PI3K p85 antistof (# 4292, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1:1000; kanin anti-PI3K p110α antistof (# 4249, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1:1000; muse anti-EphB4 antistof (gave fra P. Gill, USC), 1:1000; kanin anti-NKA α1 (Na, K-ATPase α1) antistof (Cell Signaling Technology), 1:1000; muse anti-β-actin-antistof (Sigma-Aldrich), 1:5000. Forsøg blev gentaget 2-3 gange. Proteinniveauer blev påvist enten ved forøget kemiluminescens (ECL) eller fluorescens-farvning, og visualiseret og kvantificeret med Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) eller ved LiCor Odyssey.

Immunofluorescens og konfokal mikroskopi

til påvisning af endogen sGRP78 blev C4-2B celler podet ved 5 x 10

3 per brønd i en 8-brønds kammer slide (Millipore, Billerica, MA) i 24 timer og derefter behandlet med Tg i 8 timer . Cellerne blev derefter fikseret i kold 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket med kold PBS, og derefter blokeret med 5% BSA i PBS (BSA /PBS) på is i 30 minutter. Cellerne blev farvet med muse-anti-GRP78 monoklonalt antistof (MAb159) i 1% BSA /PBS ved 10 ug /ml ved 4 ° C natten over uden permeabilisering. Cellerne blev vasket med koldt PBS og farvet med AlexaFluor-488 gede-anti-muse-antistof (Life Technologies) i 1% BSA /PBS ved 4 ° C i 1 time. Til efterfølgende immunfarvning for p85, som er intracellulært, blev cellerne permeabiliseret med 0,5% (w /v) saponin i PBS ved stuetemperatur (RT) i 15 min. Cellerne blev vasket med PBS indeholdende 0,01% saponin (PBS /SAP), og derefter blokeret med 5% BSA i PBS /Sap ved stuetemperatur i 1 time. Cellerne blev farvet med kanin-anti-p85-antistof (1:50, Cell Signaling Technology) i 1% BSA i PBS /Sap ved stuetemperatur i 2 timer, efterfulgt af farvning med AlexaFluor-594 gede-anti-kanin-antistof (Life Technologies) i 1% BSA i PBS /Sap ved stuetemperatur i 1 time.

til påvisning af ektopisk udtrykte FLAG-mærket GRP78 på celleoverfladen, HeLa-celler blev podet ved 5 x 10

3 per brønd i 8- godt kammer slides 24 timer før transfektion. Transfektion blev udført ved anvendelse biot. Otteogfyrre timer efter transfektion, ikke-permeabiliserede celler blev fikseret og blokeret som beskrevet ovenfor og derefter inkuberet med muse-anti-FLAG-antistof (Sigma-Aldrich) i 1% BSA /PBS ved 4 ° C i 1 time efterfulgt af inkubation med AlexaFluor -488 gede-anti-muse-antistof (Life Technologies) i 1% BSA /PBS ved 4 ° C i 30 minutter. Til påvisning af phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphat (PI (3,4,5) P3), blev cellerne derefter behandlet med MOM ™ Mouse Ig Blocking Reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ved stuetemperatur i 1 time for at blokere muse-immunglobulin fra primær muse anti-FLAG-antistof. Cellerne blev efterfølgende permeabiliseret som beskrevet ovenfor og intracellulær PI (3,4,5) P3-farvning blev udført som beskrevet [35]. Til påvisning af p85 i HeLa-celler, blev cellerne permeabiliseret og farvet med det primære antistof ved 37 ° C i 1 time og det sekundære antistof ved 37 ° C i 30 minutter.

Alle immunofarvede celler blev monteret med Vectashield anti-fade medium indeholdende DAPI (Vector Laboratories), og analyseret ved et Zeiss LSM510 konfokalt mikroskop udstyret med LSM 510 Version erhvervelse 4.2 SP1 software (Carl Zeiss). Repræsentative billeder blev taget med et EF Plan-Neofluar 40 × /1,30 olie objektiv eller et Plan-Apochromat 100 × /1.4 olie DIC mål. Z-stack billeder blev taget med et Plan-Apochromat 100 × /1.4 olie DIC mål.

celleoverfladeprotein biotinylering og isolation

celleoverfladeproteiner blev biotinyleret med ikke-gennemtrængelige biotin, lyseret i RIPA-buffer og rensedes ved nEUTRAVIDIN agaroseperler som beskrevet tidligere [32].

Co-immunopræcipitering assay

De transficerede celler blev biotinyleret og lyseret med immunopræcipitation (IP) puffer (25 mM Tris- Cl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40). Cellelysaterne blev underkastet monomer avidin søjle (Thermo Scientific) og elueret med 2 mM D-biotin i PBS efter producentens anvisninger. Eluatet blev koncentreret med VIVASPIN 6 koncentratorer (10 kDa MWCO, Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA), klaret med 50 pi Dynabeads protein G (Life Technologies) og udsat for inkubation med 1 pg muse-anti-FLAG-antistof (Sigma-Aldrich) eller normalt muse-IgG natten over ved 4 ° C, efterfulgt af inkubation med 50 pi Dynabeads protein G i 1 time ved 4 ° C. Efter vask blev kuglerne kogt i 5 minutter i 2 x SDS-prøvebuffer blev prøverne underkastet 10% SDS-PAGE-elektroforese og Western blot.

Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) assay

cellerne blev løsnet med ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning (Sigma-Aldrich) ved 37 ° C i 15 minutter og alikvoteret til 1 × 10

6 celler /rør og inkuberet med 10% normalt humant serum i PBS i 20 min på is for at blokere Fc-receptorer på celleoverfladen. Cellerne blev inkuberet med en mættende mængde af muse-anti-GRP78 antistof (MAb159) (1 ug) i 40 min på is i 100 pi farvning puffer (Dulbeccos PBS, 2% varme-inaktiveret føtalt kalveserum, 0,09% natriumazid) efterfulgt af AlexaFluor-488-konjugeret ged anti-mus sekundært antistof (0,5 ug, Life Technologies) og suspenderet i iskold PBS indeholdende 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1 ug /ml, Sigma-Aldrich) og underkastet FACS. Dataene blev erhvervet af LSR II flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) og analyseret ved hjælp FlowJo software.

Resultater

Aktiv fremme af celleoverfladen GRP78 udtryk i kræftceller resistente over for hormonal terapi

for at teste, om udvikling af resistens over for terapeutisk behandling ændrer ekspressionen af ​​sGRP78 i kræftceller, vi udnyttet tre sæt kræft cellelinjer og deres derivater, der har erhvervet resistens mod behandlingen regime. Den humane brystcancer-cellelinie MCF7L parentale linje (MCF7L-P) og et derivat tamoxifen resistente linje (MCF7L-Tamr) blev dannet ved langtidsdyrkning af MCF7L-P celler i PRF-medium indeholdende 10% CS-FBS og 100 nM tamoxifen (Tam), indtil cellevækst genoptaget (efter 4 mo). I modsætning til de MCF7L-P-celler, der voksede i medium indeholdende E2, men ikke i medium indeholdende Tam, viste MCF7L-Tamr celler ækvivalente vækstrater, når de underkastes enten østrogen (E2) eller Tam (figur 1A). Den humane brystcancer MCF7 /HER2-18-P, som er en HER2-overekspression klon og dens Tam-R-derivat blev isoleret efter lang tids udsættelse for Tam i ca. 11 mo. Det tredje par af celler er de veletablerede androgensensitive humane prostataadenokarcinomceller, LNCaP, og dets derivat, androgen-uafhængig cellelinie, C4-2B.

(A) Validering af Tam fænotype af MCF7L-tamr celler. MCF7L-parental (P) og -TamR celler blev præ-udsultet i phenol-rød fri (PRF) medium indeholdende 5% CS-FBS i 5 d før underkastes østrogen (E2) (1 nM) eller Tam (100 nM) behandling til 8 d. Celler blev podet i firdobbelte i 96-brønds pladen, og celleantal blev talt ved et in situ celle cytometeret. På dag 8 blev celler farvet med methylenblåt som vist i det nederste panel. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse; * P 0,001, to-sidet t-test, cellevækst under Tam vs. E2. (B) immunoblotter af MEF celler under anvendelse af MAb159, med β-actin som ladningskontrol. Venstre bane viste MEF lysater fra

Grp78 floxet /floxet

mus. Lige bane viste afskaffelse af GRP78 bandet efter infektion med adenovirus udtrykker Cre-rekombinase til knockout

Grp78 floxet /Floxed

alleler. (C) Repræsentative Western blots for øget sGRP78 niveau i resistente kræftceller. Parentale (P) og Tamr derivater af humane brystcancer-celle modeller af MCF7L og MCF7 /HER2-18 samt det parentale androgen følsomme LNCaP-cellelinie og androgen-uafhængige C4-2B celler blev underkastet biotinylering og NeutrAvidin agarose pull -Down at berige for celleoverfladeprotein. Celleoverflade GRP78 (sGRP78) og total intracellulær GRP78 (tGRP78) i cellelysatet blev probet ved Western blot. Mængden af ​​totale lysat var 10% af den mængde, der anvendes til avidin pull-down. β-actin tjente som ladningskontrol for tGRP78, mens membranprotein, EphB4 eller Na, K-ATPase-α1 (NKA α1) tjente som ladningskontrol af celleoverfladeproteiner i bryst- eller prostatacancerceller (PCA), henholdsvis. Forsøgene blev gentaget to gange. Proteinbåndene blev kvantificeret og de relative niveauer af tGRP78 i de parentale og resistente cellelinier blev normaliseret mod β-actin, og sGRP78 niveau normaliseres mod EphB4 eller NKA α1 henholdsvis som vist ved middelværdi ± standardafvigelse (SD) i grafen nedenfor. Niveauerne i forældrenes cellelinjer og i androgen følsomme cellelinje, er LNCaP indstillet som 1.

Til påvisning af GRP78, vi udnyttet en høj affinitet monoklonalt antistof MAb159 rettet mod humant GRP78 at kun anerkendte den GRP78 proteinbånd (figur 1B). Ved knockout af

GRP78

floxede alleler i MEF’er ved infektion med adenovirus udtrykker Cre-rekombinase, den GRP78 bandet blev afskaffet, bekræfter, at MAb159 specifikt genkender GRP78. Til påvisning af sGRP78 blev cellerne biotinyleret og celleoverflade-proteiner blev oprenset ved NeutrAvidin agarose pull-down. Fra Western blot-analyse af de biotinylerede proteiner og den totale lysat, blev niveauerne af sGRP78 og total intracellulær GRP78 bestemt for hver cellelinie, med EphB4 og NKA α1 tjener som lastning kontroller til celleoverfladeproteiner for brystkræft og prostatakræft-cellelinier, henholdsvis. β-actin, cytosolprotein, tjente som lastning kontrol for de samlede cellelysater. Repræsentative Western blot-analyser til påvisning af sGRP78 og total GRP78 er vist, med grp78 niveauer efter kvantificering og normalisering til de respektive loading kontroller tegnes nedenfor og vist med standardafvigelser (figur 1C). Fraværet af β-actin i proteinerne pull-down af NeutrAvidin bekræftede manglen på kontaminering intracellulært protein i celleoverfladeprotein fraktioner. For MCF7L-P celler, som udtrykte en moderat basal niveau af GRP78, var der en 3 gange stigning i den samlede GRP78 men en 7-dobling i sGRP78 i Tamr celler. For MCF7 /HER2-18-P celler, som udtrykte en højere basal niveau af GRP78, de Tamr celler viste kun minimal stigning i den samlede GRP78 men en 4-dobling i sGRP78. For androgen-uafhængige C4-2B celler, den samlede GRP78 stigning over androgen-følsomme LNCaP celler var mindre, men der var om en 7-fold stigning i sGRP78. Kollektivt, disse resultater indebærer, at stigningen i sGRP78 i resistente cellelinier ikke blot parallel stigningen i den samlede mængde GRP78, snarere udviklingen af ​​resistens fremmer særlig mekanisme (r), der kan forbedre GRP78 lokalisering til celleoverfladen.

ER stress yderligere hæver celleoverfladen GRP78 niveau i resistente kræftceller

Tidligere vi rapporterede, at Tg, som hæmmer ER ATPase, hvilket medfører Ca

2+ udstrømning fra ER, fremmer translokation af GRP78 fra ER til celleoverfladen i humane embryonale nyre 293T-celler [32]. Men om dette gælder for cancercellelinier, der allerede udviser moderate til høje niveauer af GRP78 er ikke kendt. Som cancerceller rutinemæssigt udsættes for ER stress i tumormikromiljøet, er det vigtigt at fastslå, om kræftceller, der har udviklet resistens over for behandling er i stand til yderligere højdejusterbare sGRP78 ekspression som reaktion på ER stress. For at teste disse behandlede vi resistente celler med forskellige inducere af ER stress og måles sGRP78 ved FACS samt ved biokemiske metoder. I den første fremgangsmåde blev de MCF7L-P og Tamr cellelinier behandlet med Tg. Celle overflade GRP78 blev påvist ved FACS-analyse (figur 2A). På MCF7L-P-cellelinie, behandling med Tg førte til en 4,8 gange stigning i sGRP78. På MCF7L-Tamr cellelinie, som allerede udviser 12-fold højere sGRP78 sammenlignet med de parentale MCF7L-P-celler, Tg behandling yderligere hæver sGRP78 ekspression til 20-fold (figur 2A).

(A) parentale og tamoxifen-resistente MCF7L cellerne enten ubehandlede (Ctrl) eller behandlet med 300 nM thapsigargin (Tg) i 16 timer. Celleoverflade GRP78 blev målt ved FACS. Repræsentative FACS profiler er vist og procentdele af positive celler er vist i øverste højre hjørne. Blå stiplet linie, isotypekontrol; rød optrukket linje, anti-GRP78 Ab. (B) Østrogen sult følsomme human brystcancer cellelinje, MCF7 /BUS, og dens modstandsdygtige derivat klon, MCF7 /BUS-10, var enten ubehandlede (Ctrl) eller behandlet med 10 mM 2-deoxyglucose (2DG) i 24 timer. Cellerne blev biotinyleret og celleoverfladeproteiner oprenset ved NeutrAvidin agarose pull-down. sGRP78 og tGRP78 blev påvist ved Western Blot. β-actin tjente som ladningskontrol. De fold ændringer i sGRP78 og tGRP78 er vist nedenfor og kontrol tilstand i MCF7 /BUS celler blev sat som 1. (C) Samme som (B), bortset C4-2B celler behandlet med Tg, Tu (tunicamycin) eller 2DG. NKA α1 tjente som celleoverfladeprotein loading kontrol. De relative niveauer af tGRP78 og sGRP78 normaliseres mod β-actin eller NKA α1 henholdsvis og udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse fra to uafhængige forsøg i grafen (højre).

I den anden fremgangsmåde, udnyttede vi østrogen-afhængige cellelinie MCF-7 /BUS og dets derivat MCF-7 /BUS-10 cellelinie, der har erhvervet resistens over for østrogen sult [43]. Cellerne blev biotinyleret og celleoverfladeproteiner underkastet NEUTRAVIDIN agaroseperler pull-down. Niveauerne af sGRP78 og totale intracellulære GRP78 blev bestemt ved Western blot (figur 2B). Efter aftale med MCF7L og MCF7 /HER2-18 cellelinjer, udvikling af resistens i MCF-7 /BUS-10 model steget væsentligt mængden af ​​sGRP78 (med 9 gange), mens den samlede intracellulære beløb var moderat forhøjet (ved 1,3 gange). For både de parentale og resistente cellelinier, behandling af celler med 2DG, en inducer af ER stress via hæmning af glykolyse og glycosylering, yderligere forhøjet sGRP78 ekspression ved ca. 5,2 gange i den parentale linje og 3,5 gange i den resistente linje (figur 2B).

Vi undersøgte dernæst niveauet af sGRP78 og total GRP78 i androgen-uafhængige prostatacancer-cellelinie C4-2B, med eller uden ER stress (figur 2C). I disse undersøgelser foruden Tg og 2DG behandling, vi tilføjet en anden ER stress inducer, tunicamycin (Tu), som skaber ER stress ved at blokere N-bundet protein glycosylering, hvilket forårsager akkumulering af underglykosylerede proteiner i ER. I Western blot analyse, β-actin og NKA α1 tjente som lastning kontrol for total og celleoverfladeproteiner hhv. Som i tilfældet med de resistente brystcancerceller, ER stress forårsaget en moderat stigning af den samlede GRP78 (med ca. 2 gange), da disse celler allerede udtrykt højt basalt GRP78 sammenlignet med deres følsomme parentale celler. Under alle tre ER stress betingelser, sGRP78 niveau steg med 5 til 6 gange, sammenlignet med ikke-stressede celler. Tilsammen viser disse resultater, at forskelligartede ER stress stimuli er i stand til aktivt at fremme sGRP78 ekspression i både drug følsomme og resistente kræftceller, og at udviklingen af ​​terapeutiske resistens i kombination med ER stress videreudbygger sGRP78 ekspression.

Cell overflade GRP78 formularer kompleks med PI3K

Nylige undersøgelser tyder på, at forstyrrelse af sGRP78 ændrer PI3K /AKT-vejen, men hvordan der opnås er ikke godt forstået [14], [16]. For at løse dette, vi fastslået, om sGRP78 co-lokaliseret med PI3K på celleoverfladen. C4-2B, med høj endogen sGRP78 og relativt lette kultur, præsenterer en egnet celle modelsystem. For at maksimere sGRP78 ekspression, blev cellerne behandlet med Tg. Hos ikke-permeabiliserede celler, vil antistof-farvning primært detektere GRP78 på celleoverfladen, snarere end den meget rigelige intracellulære GRP78, der lokaliseres majorly i perinukleære ER region. Efter 8 timer af Tg behandling, endogen sGRP78, som visualiseret ved immunfluorescensfarvning med MAb159 monoklonale antistof, blev påvist spredt over celleoverfladen af ​​C4-2B celler (figur 3A). At påvise PI3K regulatoriske underenhed p85, som er intracellulært, blev MAb159 immunofarvede celler permeabiliseret efterfulgt af farvning med antistof mod p85. Som vist i repræsentative billeder, blev co-lokalisering af endogen sGRP78 og p85 i flere steder observeret for en underfraktion af sGRP78 og p85 (figur 3A, pile).

(A) Konfokal mikroskopi påvisning af co-lokalisering af endogene sGRP78 med p85 i C4-2B celler behandlet med Tg i 8 timer. Ikke-permeabiliserede celler blev først farvet med anti-GRP78 antistof (MAb159) for at detektere sGRP78 (

Grøn

) (venstre). Cellerne blev derefter permeabiliseret og derefter farvet med anti-p85 antistof (

rød og). (B) Co-lokalisering af celleoverflade F-GRP78 med p85 i HeLa-celler. Ikke-permeabiliserede HeLa-celler transficeret med F-GRP78 ekspressionsvektor blev først farvet med anti-FLAG-antistof til påvisning af overfladen F-GRP78 (

Grøn

) (venstre), derefter permeabiliseret og farvet med anti-p85 antistof (

rød og). I både (A) og (B), blev kernerne farves ved DAPI (

blå og) og de boxed regioner (hvid firkant) af de komprimerede Z-stack billeder (venstre paneler) blev udvidet og vises på højre paneler i enkelt konfokal afsnit fly (tykkelse 0,38 um) .Den fusionerede billeder viste co-lokaliseringer (

gul

) af celleoverfladen GRP78 og p85 detekteret på flere tilsvarende sites (

hvide pile

) . Scale søjler repræsenterer 2 um. (C) Protokol til påvisning af interaktion mellem celleoverfladen F-GRP78 og p85. Biotinylerede celleoverfladeproteiner blev oprenset ved monomer avidin kolonne, efterfulgt af immunpræcipitering (IP) og Western blot. (D) 293T-celler blev transficeret med F-GRP78 ekspressionsvektor. Celleoverfladeproteiner elueret fra monomere avidin søjle (input) som beskrevet i (C) blev underkastet immunpræcipitering (IP) med enten anti-FLAG-antistof eller isotype IgG tjener som negativ kontrol. F-GRP78, p85 og p110α niveauer i immunopræcipiteret kompleks blev målt ved Western blot med anti-FLAG, anti-p85 og anti-p110α antistoffer.

For at udvide disse observationer, vi transficeret HeLa celler med ekspressionsvektor til FLAG-GRP78 (F-GRP78). Anvendelsen af ​​GRP78 mærket med FLAG-epitopen tilladt at anvende den meget specifikke anti-FLAG-antistof til påvisning af celleoverflade GRP78 ekspression i ikke-permeabiliserede celler. HeLa-celler blev anvendt, eftersom de klæber stærkere til mikroskopiske objektglas, som er kritisk for de multiple trin i eksperimentelle manipulationer af de transficerede celler. Vores resultater viste rigelige co-lokalisering af celleoverflade F-GRP78 med p85 (figur 3B).

Dernæst at bestemme biokemisk hvorvidt sGRP78 dannet kompleks med PI3K, 293T-celler blev transficeret med F-GRP78. 293T-celler blev anvendt på grund af deres høje transfektionseffektivitet. Brugen af ​​F-GRP78 tilladt os at immunpræcipitere GRP78 med høj specificitet og affinitet. Det eksperimentelle design er vist i figur 3C. Efter transfektion blev cellerne biotinyleret og cellelysaterne blev inkuberet med monomere avidin agaroseperler, der tillader isolering af biotinylerede celleoverfladeproteiner ved mild eluering tilstand på grund af dens svage affinitet til biotinyleret protein. De eluerede celleoverfladeproteiner blev immunfældet med anti-FLAG-antistof eller isotypen IgG kontrol. Immunopræcipitaterne blev derefter udsat for Western blot og probet med antistoffer mod p85 og p110α, samt anti-FLAG-antistof. Vi observerede, at celleoverflade F-GRP78 dannet kompleks med både den regulerende (p85) og katalytisk (p110α) underenheder af PI3K, i modsætning til IgG-kontrol, som ikke viste nogen binding (figur 3D). Kollektivt, disse resultater tyder på, at sGRP78 direkte eller indirekte interagerer med p85 og p110α.

Cell overflade GRP78 overekspression stimulerer PI (3,4,5) P3 produktion og co-lokalisering

Den komplekse dannelse mellem sGRP78 og PI3K antyder, at det kan føre til modulering af PI3K-aktivitet. Efter aktivering, PI3K lokaliseres til celleoverfladen og phosphorylerer PI (4,5) P2 fører til PI (3,4,5) P3 (i det følgende benævnt PIP3) produktion.