Abstrakt
Andrographis lineata
er et urte lægeplante brugt i traditionel medicin som en erstatning for
Andrographis paniculata
. Her bruger modne bladeksplantater af
A
.
lineata
vi demonstrerer for første gang callus induktion etableret på MS medium, der indeholder 1,0 mg l
-1 IAA. Tørret callus blev underkastet opløsningsmiddel-ekstraktion med acetone. Yderligere acetone rest blev separeret ved silicagelsøjlekromatografi, krystalliseret og karakteriseret på grundlag af kernemagnetisk resonans (proton og C13) og flydende kromatografisk massespektroskopi. Denne analyse viste forekomsten af to kendte flavoner nemlig 7-
O
-methylwogonin (MW) og Echioidinin (ED). Desuden blev disse forbindelser testet for deres cytotoksicitet over leukæmisk cellelinie, CEM. Vi identificerer, at ED og MW-induceret cytotoksicitet i en tids- og koncentrationsafhængig måde. Yderligere stigning i LDH frigivelse ved behandling med ED og MW yderligere bekræftet vores cytotoksicitet resultater mod leukæmisk cellelinie. Påfaldende, MW var mere potent end ED sammenlignet ved trypanblåt og MTT-assays. Vores resultater rekapitulere anvendeligheden af calluskulturer for produktionen af vegetabilske specifik bioaktive sekundære metabolitter stedet for at bruge vilde planter. Sammen vores
in vitro
undersøgelser giver ny indsigt i
A
.
lineata
calluskulturer tjener som en kilde til kræft kemoterapeutika
Henvisning:. Mohammed A, Chiruvella KK, Rao YK, Geethangili M, Raghavan SC, Ghanta RG (2015)
I vitro
Produktion af Echioidinin, 7-
O
-Methywogonin fra Callus kulturer af
Andrographis lineata
og deres cytotoksicitet på kræftceller. PLoS ONE 10 (10): e0141154. doi: 10,1371 /journal.pone.0141154
Redaktør: Brett Neilan, University of New South Wales, Australien
Modtaget: Maj 26, 2015; Accepteret: 3 Oktober 2015; Udgivet 21. oktober, 2015
Copyright: © 2015 Mohammed et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Forkortelser: MS, Murashige og Skoog; BA, benzyladenin; IAA, indol 3 eddikesyre; NAA, naphthalen eddikesyre; 2,4-D, 2,4-D; TLC, tyndtlagskromatografi; NMR, kernemagnetisk resonans; LC /MS, væskekromatografi /massespektrometri; UV, ultraviolet synlig spektroskopi; IR, infrarød spektroskopi; MTT, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid; MW, 7-
O
-methylwogonin; ED, echoidinin; DMF, dimethylformamid; DMSO, dimethylsulfoxid; nm, nanometer; MHz, mega hertz
Introduktion
Blandt alle former for kræft, er leukæmi betragtes en af de mest aggressive livstruende blodkræftsygdomme med millioner af patienter diagnosticeres hvert år. Leukæmi viser sig at være meget følsomme over for kemoterapeutiske midler [1]. Screening naturlige produkter baseret på medicinplanter har været lovende som værdifulde kilder til antitumor narkotika. Naturlige produkter udøver anticancer potentialer ved at inhibere celleproliferation og inducere apoptose [2,3]. Planteekstrakter, som udviser anticanceraktivitet er blandingen af alle de forbindelser, der findes i ekstrakten i stedet for særlig forbindelse [4,5]. Dette tilskynder til søgningen af isolerede forbindelser med veldefinerede farmakologiske egenskaber.
In vitro
kulturer beskæftiger plantevæv kultur teknologi er fordelagtig i forhold intakt fabrik til fremstilling af sekundære metabolitter uden at ødelægge naturlige habitat [6,7,8]. Dette skyldes det faktum, at hastigheden af cellevækst og biosyntese i kultur initieret fra en lille mængde af plantemateriale er ganske høj, en væsentligt fremstillet i en kort periode. Manipulering dyrkningsbetingelser, plantehormoner er et værdifuldt redskab til at øge niveauet af bioaktive metabolitter [9]. Dette er i modsætning til mange af
in vivo
planter, som anvendes til at opnå en lille mængde narkotika.
Produktion af plante-afledte lægemidler forbindelser er et spørgsmål af stor samfundsøkonomisk betydning. Dette har foranlediget industrier samt forskere til at overveje brugen af
in vitro Salg kulturer som alternativ forsyning. Produktion af plante sekundære produkter ved voksende udifferentierede væv
in vitro
store mængder har længe været anerkendt som et middel, hvor både sæsonudsving og tid specificitet af produktionen ville blive omgået. Calluskulturer er lovende for at få anlægsspecifikke værdifulde metabolitter udnyttes til at forbedre udbyttet af bioaktive stoffer, at fremskynde tempoet i bevarelse og udbredelse af et vigtigt etnisk-medicinske planter [10]. Tidligere undersøgelser har lykkedes i produktion af sekundære metabolitter gennem
in vitro
kultur [11,12,13,14,15,16]. For eksempel prenyleres flavanoner såsom sophoraflavanone G og lehmanin blev opnået fra
Sophora flavescens
calluskultur [17]. Callus af
Hypericum perforatum
yeilded 6-C-prenyl luteolin, sammen med luteolin-5,3′-dimethylether, luteolin-5-glucosid og luteolin-3′- glucosid [18]. Vigtigere anticancer forbindelse, såsom taxol blev også opnået fra callus kulturer af Taxus-species [19,20,21]. Slående, isoflavone indhold fra calluskulturer af Genista arter var mere end de
in vivo
planter [22,23].
Andrographis
(Acanthaceae) består af 250 slægter og 2500 arter. Blandt alle slægter, Andrographis
paniculata
er af potentiel betydning i traditionel medicin til behandling af forskellige sygdomme på grund af sin brede spektrum af biologiske aktiviteter [24,25]. De farmakologiske aktiviteter af
Andrographis
skyldes tilstedeværelsen af flavonoider, terpenoider og flavonoidglycosider såsom andrographolide, echiodinin og echiodinin 5-
o
-β-D-glucopyranosid. Andrographolide og deres derivater besidder potentielle anticancer egenskaber [26]. 7-
O
methyl dihydrowogonin, 5-hydroxy-3,7,8,2′-tetramethoxyorthosilikat flavon og flavon 7-
O
-methylwogonin fra rødderne af
A
.
paniculata
er blevet identificeret [27]. Callus kulturer af
A
.
paniculata
blev rapporteret til at være 7-
O
-methylwogonin, kalot flavoner I og 5-hydroxyl-7,8,2′-trimethoxyflavon [28]. Forekomsten af 7-
O
-methylwogonin udgør den første rapport af en 2′-deoxyflavone.
Andrographis lineata
anvendt i den foreliggende undersøgelse er en tribal lægeplante servering som god erstatning for
A
.
paniculata
. Ligeledes denne plante bruges af læger til behandling af slangebid, diabetes, hudsygdomme, feber, forstoppelse, bronkitis, kræft, inflammation og stomachic. Det besidder også antihelminthic, antiinflammatorisk, antipyretisk og antiperiodic egenskaber [29,30]. Blad pasta anvendes til hærdning luftvejsinfektioner mens root afkog som modgift. Flavonoider sammen med andrographolide er blevet rapporteret fra blad ekstrakter [31]. Farmakologiske studier med blade ekstrakter viste antibakterielle, vanddrivende leverbeskyttende og antidiabetiske aktiviteter [32,33,34].
Tidligere studier med
A
.
paniculata
har vist anvendeligheden af calluskulturer til produktion af sekundære metabolitter stedet for at bruge vilde planter. Det fik os til at udvikle callus induktion til
in vitro
produktion af sekundære metabolitter i en forholdsvis kort periode ved at passere sæsonmæssige pres året rundt. Her rapporterer vi for første gang etablering af calluskulturer fra bladeksplantater af
A
.
lineata
. Vi viser isolation og strukturel karakterisering af echioidinin (ED) og 7-
O
-methywogonin (MW) ved silicagelsøjlekromatografi efterfulgt af kernemagnetisk resonans (proton og C13) og flydende kromatografisk massespektroskopi. Yderligere vi demonstrere ED og MW-induceret cytotoksicitet mod leukæmiceller i en tids- og koncentrationsafhængig måde.
Materialer og metoder
Reagenser og kemikalier
Kemikalier såsom NAA, 2,4-D, blev IAA opnået fra Sigma. HgCl
2 var fra E. Merck, saccharose fra Sisco, silicagel fra Acme syntetiske kemikalier og Agar fra CDH, Mumbai, Indien. DMSO, DMF, acetone, hexan, ethylacetat og methanol blev opnået fra Sigma.
plantemateriale og vævskultur Betingelser for Callus Induction
Modne blade indsamlet fra marken dyrkes planter af
A
.
lineata
blev brugt som eksplantater. Bladene blev overfladesteriliseret i 70% ethanol i 30 sekunder efterfulgt af skylning i sterilt destilleret vand, derefter behandlet med 0,1% HgCl
2 (vægt /volumen) (Merck) i 2 minutter og efterfulgt af vask i sterilt destilleret vand. De afskårne ender af eksplantaterne blev trimmet med skarpe kant sterile kirurgiske knive. Desuden blev eksplantaterne blottet på sterile filter papirskiver før inokulering. Næringsmedier anvendt i den foreliggende undersøgelse var Murashige og Skoog medium, blev 1962. Medierne congealed med agar (0,8%) og saccharose 3% blev anvendt som en kilde til kulhydrat. PH af mediet blev derefter indstillet til 5,6-5,8, og mediet blev endelig gjort til et kendt volumen. Agar blev sat til medierne, før udlevering i beholderne (15 ml for 25 × 150 mm reagensglas), som blev autoklaveres i 15 min ved 15 lbs /i
2. Reagensglassene med sterile medier blev anbragt i en skrå stilling for at forøge overfladearealet af mediet. Alle kulturer blev inkuberet i en kultur rum ved 25 ± 2 ° C med en relativ fugtighed på 50-60% og 16 h lysperiode ved en fotonfluxtæthed på 15-20 μ E m
2 s
-1 fra hvide kølige lysstofrør
MS-medium med forskellige koncentrationer af auxiner (2,4-D, IAA og NAA) lige 0,1-1,0 mgl
– l. blev anvendt til at undersøge deres virkninger på kallus induktion ved varierende koncentrationer (tabel 1). Efterfølgende veletablerede callus opnået på MS medium beriget med 1,0 mg l
-1 IAA blev subdyrket 4-5 gange for optimal callus produktion med regelmæssige intervaller på 20 dage efter podning. Denne teknik af callus induktion til produktion af sekundære metabolitter er tidligere beskrevet af forskellige grupper [10,14,23,35].
Udvinding, isolering og identifikation af rensede forbindelser fra
A
.
lineata
Calli
indkøbt calli blev først tørret ved stuetemperatur i et par dage og det materiale blev derefter knust til et fint pulver (750 g). Det opnåede pulver blev underkastet opløsningsmiddel-ekstraktion under anvendelse af varm acetone i et Soxhlet appartus [10]. Varm ekstraktion øger opløst stof opløselighed af naturlige produkter og ekstrakter de fleste af de sekundære metabolitter. For at opnå det maksimale antal forbindelser fra
Andrographis lineata
calli, brugte vi acetone til soxhlation under varm tilstand. Derudover brugen af acetone som ekstraktionsopløsningsmiddel er ikke at ekstrahere lipider med samme effektivitet som det ville for sekundære metabolitter. Inddampning af ekstrakten
i vakuum
gav en mørkebrun remanens, acetone ekstrakt (30 g) (Fig 1B). Acetoneekstrakten suspenderet i H
2O, blev delt med hexan til opnåelse hexan opløselige og uopløselige fraktioner. Endvidere har vi gennemført hexan fraktionering da det fjerner ud klorofyl og ikke-polære bestanddele.
(A) Callus blev induceret fra bladeksplantater på MS medium suppleret med 1,0 mg l
-1 IAA (Bar = 2,5 mm) efter 4 uger. (B) Skematisk gengivelse af fytokemiske analyse af callus af
Andrographis lineata
til isolering af bioaktive forbindelser.
hexan uopløselige rest (20 g) blev kromatograferet over silicagel ved anvendelse hexan- ethylacetat-gradient eluent, og lignende fraktioner blev kombineret for at fremstille fire sub-fraktioner (Fr. i til Fr. IV). Fraktioner II blev yderligere separeret under anvendelse af en silicagelsøjle ved eluering med en gradient af hexan-ethylacetat, hvilket gav et gult faststof (24 mg), som blev betegnet ALC-1. Dette gav en grøn farve med Fe
3+ en orange rød farve med både Mg-HCI og Zn-HCI. På den anden side, gentagen silicagel CC (5 x 90 cm) af hexan opløselig fraktion med stigende polaritet anvendelse af blandinger af ethylacetat /hexan gav tre sub-fraktioner (F1-F3). Fraktion F2 blev rekromatograferet over en silicagelsøjle ved anvendelse af hexan /EtOAc (60:40) for at give et hvidt faststof (20 mg). Fremme denne på krystallisation fra methanol gav farveløse nåle (19 mg). Dette blev betegnet som ALC-2. Det gav en grøn farve med alkoholisk ferrichlorid og en lyserød farve med Mg-HCI-syre.
Yderligere rensning af subfraktioner fra hexan uopløselig (Fr. I, Fr. III-IV), og hexan opløselig (F1 og F3) fraktioner gav ikke nogen krystallinsk princip. Alle eluaterne der indeholdt “rest” eller “ingen rester” blev undersøgt ved TLC som beskrevet nedenfor ved sprøjtning 8% methanolisk svovlsyre. Dette efterfølges af opvarmning på en varm plade ved 100 ° C i 4 min for optimal farveudvikling. Pladerne blev visualiseret og Rf-værdier blev beregnet. Næste de oprensede forbindelser blev elueret i de tilsvarende opløsningsmiddelsystemer og eluaterne blev bevaret for spektralanalyse.
Ultra violet (UV) spektre blev registreret på Beckman 25 og Shimadzu UV-240 spektrofotometre og værdier blev givet i nm. Infrarød (IR) spektre blev registreret på Perkin-Elmer model 283b og 297 dobbelt stråle spektrofotometre og
ν
værdier blev givet i cm
-1. Protonmagnetisk resonans (
1H NMR) spektre blev registreret på Varian, 200, JEOL FX-90Q og Bruker-AM-300 spektrofotometre med TMS som intern standard. Carbon-13 kernemagnetisk resonans (
13C NMR) spektre blev registreret på JEOL FX-90Q spektrofotometer. De kemiske skift blev angivet i δ ppm. Massespektre (MS) blev optaget på LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) på National Center for Mass Spectroscopy på Indian Institute of Chemical Technology, Hyderabad.
tyndtlagskromatografi (TLC)
glasplader (20 x 20 cm) blev vasket grundigt under rindende vand efterfulgt af destilleret vand, og pladerne blev holdt klar til silicagel ansøgning. Silicagel 25 g (ACME) blev opløst i 50 ml dobbeltdestilleret vand, omrørt grundigt og opslæmningen blev derefter ført i sprederen. Sprederen blev forsigtigt trukket langs pladerne, (2-3 mm tykkelse) for at få en jævn påføring. Pladerne blev aktiveret ved 100 ° C i ca. 45 min, fik lov at afkøle, fjernet fra ovnen og underkastet bruge.
Eluaterne blev anvendt i form af stedet med mikropipette, 2 cm over bunden af pladen og fik lov til at tørre med hårtørrer. Hvorefter pladerne blev fremkaldt i hexan: ethylacetat 9: 1 (v /v) og i hexan: ethylacetat 8: 2 (v /v). Opløsningsmidlet fik lov til at bevæge sig op til 15 cm, derefter blev fjernet, fik lov til at tørre. Pladerne blev sprøjtet med 8% methanol svovlsyre, der efter underkastes opvarmning i en varmluftovn ved 100 ° C i 5 min. Så forbindelserne blev visualiseret og Rf-værdier blev beregnet. Tilsvarende forudgående gjort silicagelplader overtrukne plader blev udviklet i forskellige opløsningsmiddelsystemer med hexan, ethylacetat og methanol ekstrakter. Pladerne blev i modsætning til de chromatoplates modtaget spray reagens. Omridset af forbindelserne blev markeret med en nål på usprøjtede silicagelplader.
Cell Culture
Menneskelig leukæmi cellelinje CEM blev købt fra National Center for Cell Science, Pune, Indien. Celler blev dyrket i RPMI 1640 (SERA LAB, USA) indeholdende 10% FBS (GIBCO BRL, USA), 100 U penicillin G /ml og 100 ug streptomycin /ml ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO
2. Celler blev delt i forholdet 1:10 hver 3-5 dage.
Echioidinin (ED) og 7-
O
-methywogonin (MW), der anvendes i den foreliggende undersøgelse er naturlige flavonoider oprenset fra blad callus af
A
.
lineata
. Forbindelser ED og MW blev opløst i DMF (Sigma, USA). Den maksimale koncentration af DMF (dimethylformamid) anvendt i forsøgene var lig med 0,05% og det samme beløb blev anvendt som kontrol køretøj. I alle eksperimenterne beskrevet heri echioidinin og 7-O-methywogonin blev tilsat 24 timer efter dyrkning.
Cell levedygtighed ved Trypan Blå udelukkelse
trypanblå eksklusion assay blev udført for at vurdere effekten af ED og MW om levedygtighed CEM celler. Ca. 0,75 × 10
5 celler /ml blev behandlet med forskellige koncentrationer af ED og MW. Efter 24 timers cellevækst, forskellige koncentrationer af ED og MW (10, 50, 100 eller 250 uM) eller vehikel (DMF) blev tilsat til cellerne. Celler blev udtaget fra kulturen efter hver 24 h og farvet med trypanblåt som beskrevet [2,36]. Antallet af celler (levedygtige-ufarvede og ikke-levedygtige-blåt) blev talt under anvendelse hæmocytometer. Hvert eksperiment blev udført tre uafhængige gange med god overensstemmelse.
celleproliferation ved MTT-assay
Celleoverlevelse blev yderligere vurderet ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) reduktion farvestof-assay, som er baseret på evnen af levedygtige celler til at metabolisere et gult tetrazoliumsalt til violet formazan produkt, som kan detekteres spektrofotometrisk. CEM-celler vokser med logaritmisk fase blev behandlet med forskellige koncentrationer af ED og MW (10, 50, 100, 250 pM) og inkuberet i 5% CO
2 atmosfære med høj luftfugtighed. Celler blev opsamlet efter 48 og 72 timer og behandlet med MTT (0,5 mg /ml) som beskrevet tidligere [36,37]. Absorbans blev målt ved 570 nm på en multibrønd ELISA-pladelæser. Den gennemsnitlige absorbans af mellemstore kontroller var emnet og blev trukket. Koncentration af forbindelse, der forårsager 50% inhibering af cellevækst (IC
50) blev estimeret efter 72 timer af eksponering. Absorbansen af kontrolceller blev taget som 100% levedygtighed og værdierne af behandlede celler blev beregnet som en procentdel af kontrol. De viste data er opnået fra tre uafhængige partier af eksperimenter.
LDH-frigivelse assay
Frigivelse af lactatdehydrogenase (LDH) er en indikator for membran integritet og dermed celleskade. LDH-assay blev udført for at vurdere LDH-frigivelse i kulturen efter ED og MW behandling (10, 50, 100 og 250 uM) på CEM-celler i 48 og 72 timer pr standard protokoller [37]. Den intracellulære LDH blev bestemt efter lyse af cellerne ved frysning og hurtig optøning. LDH frigivelse blev målt ved en absorbans på 490 nm. Procentdelen af LDH frigivelse blev beregnet som: (LDH aktivitet i medier) /(LDH aktivitet i medierne + intracellulær LDH aktivitet) × 100. Hvert eksperiment blev udført tre uafhængige gange med god aftale.
Statistisk analyse
Resultaterne udtrykkes som middelværdien plus eller minus standardfejl. Alle analyser blev udført med GraphPad software ved hjælp envejs ANOVA efterfulgt af Tukey-Kramer Multiple Sammenligning Test. Statistisk signifikans blev behandlet på p. 0,05
Resultater
In vitro
Callus Induktion Fra Ældre bladeksplantater
Vi har etableret calluskulturer fra modne bladeksplantater på MS medium beriget med auxiner som NAA, 2,4-D og IAA. Beskaffenheden af callus varieret med koncentrationen af forskellige auxiner anvendte (tabel 1). Hvid, blød og sprød callus blev opnået på MS-medium suppleret med 2,4-D (0,1-0,5 mg l
-1). Hyppigheden af lys gullig grøn, hårdt, organogene callusing i form af vækst biomasse blev fundet at være maksimal (75%) i nærvær af 1,0 mg l
-1 IAA (Fig 1A) efter 4 uger (tabel 1).
Men 1,0 mg l
-1 NAA og 2,4-D stærkt forværret frekvensen af callus dannelse. Alderen på bladeksplantatet var kritisk for callus fortsatte spredning. Anvendelse af ældre blade sænket callusdannelse. Den optimale kallus induktion blev observeret i nærvær af 1,0 mg l
-1 IAA og blev anvendt til isolering af bioaktive forbindelser (Fig 1A). Organogene callus blev øget i volumen ved subkultur callus segmenter på MS medium beriget med 1,0 mg l
-1 IAA for hver tyve dage. Callus var sundt i alle subkulturer og subkultur af callus forudsat bulk mængde for sekundær metabolit udvinding. Som forventet, efter overførsel til medier, der indeholder cytokinin viste BA skyde morfogene respons (data ikke vist).
Struktur Identifikation af Echioidinin og 7-
O
-methylwogonin
Karakterisering og strukturel bestemmelse af echioidinin (ED) og 7-
O
-methywogonin (MW) blev etableret primært på grundlag af 1D NMR og masse spektrale studier. Forbindelsen ALC-1 blev krystalliseret fra methanol som gule krystaller (20 mg) med smeltepunktet, 264-265 ° C. Det blev undersøgt for dets molekylformel C
16H
12o
5 med molekylvægt på 285 [M + H]
+. Det var lilla under UV og UV /NH
3. De spektrale detaljer af forbindelsen er angivet nedenfor
UV (S1A Figur):.
λ
max (MeOH) (log ε) 265 (4,40), 335 (4,19) nm . IR (S1B Fig):
v
max (KBr) 3416 (OH), 2980, 1662 ( C = O), 1614, 1504, 1452, 1350, 1245, 1159, 865 , 831 cm
-1.
1H NMR (Fig 2A): (300 MHz, DMSO
d
6) δ 12,88 (1H, s, 5-OH, udskiftelig med D
2O), 10,90 ( 1H, s, 2′-OH, udskiftelig med D
2O), 7,90 (1H, dd,
J
= 2,0, 8,0 Hz, H-6 ‘), 7,40 (dt, 1H,
J
= 2,0, 8,0 Hz, H-4 ‘), 7,10 (s, 1 H, H-3), 6,99-7,05 (m, 2H, H-3’, 5 ‘), 6,75 (d, 1H,
J
= 2,5 Hz, H-8), 6,35 (d, 1 H,
J
= 2,5 Hz, H-6), 3,90 (s, 3H, OMe-7) .
13C NMR (Fig 2B): (300 MHz, DMSO
d
6) δ 182,0 (C-4), 165,1 (C-7), 161,4 (C-2), 161,0 (C-5), 157,3 (C-8a), 156,7 (C-2 ‘), 132,8 (C-4’), 128,4 (C-6 ‘) 119,3 (C-5’), 117,0 (C-1 ‘), 116,9 (C-3’), 109,1 (C-3), 104,6 (C-3a), 97,8 (C-6), 92,4 (C-8), 55,9 (OMe-7). LC-MSD (fig 2C):.
m
/
z
= 284 [M]
+, 285 [M + H]
+
(A)
1H NMR spektre (B)
13C NMR spektre (C) Væskekromatografi masse spektre (D) struktur af echioidinin.
Således fra ovenstående ovenstående spektrale studier ALC -1 blev karakteriseret som 5, 2′-dihydroxy-7-methoxyflavone (Echioidinin, ED) (fig 2D) som dens fysiske og spektrale data var i god overensstemmelse med værdier fra litteraturen [38].
Dernæst sammensatte ALC-2 blev krystalliseret fra hexan som bleggule nåle (20 mg) med smeltepunkt 181-182 ° C. Det blev undersøgt for sin molekylformel C
17H
14o
5 med molekylvægt, 298. Det var lilla under UV og UV /NH
3. De spektrale detaljer af forbindelsen er angivet nedenfor
UV (S2A Figur):.
λ
max (MeOH) nm (log
ε
) 272 (4,52 ), 345 (3,78) nm. IR (S2B Fig):
ν
max (KBr) 3416 (OH), 2938 (-OMe), 1661 ( C = 0), 1605, 1510, 1447, 1376, 1274 , 1225, 1125, 1030, 970, 833, 767, 686 cm
-1.
1H NMR (Fig 3A): (300 MHz, DMSO
d
6) δ 12,65 (1H, s, OH-5), 8,10 (2H, m, H-2 ‘ , 6 ‘), 7,61 (3H, m, H-3’, 4 ‘, 5’), 7,01 (1H, s, H-3), 6,60 (1H, s, H-6), 3,98 (3H, s , OMe-7), 3,87 (3H, s, OMe-8).
13C NMR (Fig 3B): (300 MHz, DMSO
d
6) δ 183,5 (C-4), 164,7 (C-2), 160,0 (C-7), 159,4 (C-5), 150,3 (C-8a), 132,8 (C-4 ‘), 132,3 (C-8), 130,0 (C-1’), 130,1 (C-3 ‘, 5’), 127,2 ( C-2 ‘, 6’), 105,8 (C-3), 105,4 (C-4a), 96,7 (C-6), 61,6 (OMe-8), 56,8 (OMe-7). LC-MSD (fig 3C):.
m
/
z
= 299,1 [M + H]
+
(A)
1H NMR-spektre (B)
13C NMR spektre (C) Væskekromatografi masse spektre (D) struktur af 7-
O
methyl wogonin.
således af det ovenfor spektrale undersøgelser, strukturen af ALC-2 blev belyst som 5-hydroxy-7, 8-dimethoxyflavone (7-
O
-methylwogonin) (fig 3D) og blev også bekræftet ved sammenligning af værdier fra litteraturen [39].
Echioidinin (ED) og 7-
O
-Methylwogonin (MW) cytotoksicitet i leukæmiceller i en dosis- og tidsafhængig måde
Dernæst undersøgte vi cytotoksiske effekt af ED og MW (figur 4A og 5A) på proliferationen og overlevelsen af leukæmisk cellelinie, CEM (T-celleleukæmi). Trypanblåt assay var den første linje i vores undersøgelse, hvor CEM blev behandlet med 10, 50, 100 eller 250 uM af ED og MW. De celler uden tilsætning af forbindelse tjente som kontrol. Da forbindelsen blev opløst i DMF (dimethylformamid) blev cellerne med DMF anvendes som vehikelkontrol. Den maksimale koncentration af DMF anvendt i forsøgene var lig med 0,05% og det samme beløb blev anvendt som kontrol køretøj. Efter tilsætning af forbindelse blev cellerne talt med intervaller på 24 timer, indtil kontrolcellerne opnået stationær fase. Resultaterne viste, at cellevækst var påvirket med forøgelse af tiden (fig 4B og 5B). Virkningen var begrænset, når 10 uM ED og MW blev anvendt. Men koncentrationer på 100 og 250 uM resulterede i øget celledød (fig 4B og 5B). IC
50 af ED og MW var ca. 100 pM, ved 72 timer af behandlingen.
(A) Struktur af ED. (B) Vurdering af cellelevedygtighed under anvendelse af trypanblåt assay efter 10, 50, 100 og 250 uM af ED eller DMF (kontrol) behandling. Celler blev høstet, trypanblåt farves og tælles hver 24 timer, indtil det nåede stationær fase. (C) Bestemmelse af% cellelevedygtighed ved MTT-assay i CEM-celler. Celler blev dyrket med 10, 50, 100 og 250 uM af ED eller kontrol køretøj til 24, 48 og 72 timer. Den% af cellelevedygtighed blev beregnet på basis af DMF-behandlede celler som 100% og afbildet med repræsentation af fejlsøjler. (D) Måling af LDH-frigivelse efter behandling med ED. Efter eksponering af CEM-celler med ED ved forskellige koncentrationer (10, 50, 100 og 250 uM) i 24, 48 og 72 timer blev frigivelse af LDH målt ved 490 nm. Resultaterne præsenteres som procent af LDH-frigivelse. Hvert eksperiment blev udført tre uafhængige gange med god aftale.
(A) Struktur af MW. (B) Vurdering af cellelevedygtighed under anvendelse af trypanblåt assay efter 10, 50, 100 og 250 uM af MW eller DMF (vehikelkontrol) behandling. Celler blev høstet, trypanblåt farves og tælles hver 24 timer, indtil det nåede stationær fase. (C) Bestemmelse af% cellelevedygtighed ved MTT-assay i CEM-celler. Celler blev dyrket med 10, 50, 100 og 250 uM af MWor vehikelkontrol i 24, 48 og 72 timer. Den% af cellelevedygtighed blev beregnet på basis af DMF-behandlede celler som 100% og afbildet med repræsentation af fejlsøjler. (D) Måling af LDH-frigivelse efter behandling med MW. Efter eksponering af CEM-celler med MW ved forskellige koncentrationer (10, 50, 100 og 250 uM) i 24, 48 og 72 timer blev frigivelse af LDH målt ved 490 nm. Resultaterne præsenteres som procent af LDH-frigivelse. Hvert eksperiment blev udført tre uafhængige gange med god aftale.
cytotoksicitet induceret af ED og MW om spredning af leukæmiceller blev yderligere kontrolleres ved hjælp af MTT-analysen. CEM-celler behandlet med 10, 50, 100 og 250 uM af ED og MW blev høstet efter 24, 48 eller 72 timer og blev underkastet MTT-assayet (fig 4C og 5C). Resultaterne viste, at cellelevedygtigheden blev påvirket ved behandling med ED og MW ved 100 og 250 uM, især efter 72 timer. Disse resultater yderligere tyder på, at ED og MW fremkalde cytotoksicitet.
Endvidere blev LDH assay udført for at bestemme den cellulære integritet efter ED og MW behandling (10, 50, 100 og 250 uM). Resultaterne viste en koncentrations- og tidsafhængig stigning i LDH-frigivelse ved behandling med ED og MW, hvilket yderligere bekræfter ovenstående resultater (fig 4D og 5D). Samlet tyder vore resultater, at ED og MW var stand til at inducere cytotoksicitet i cancercellelinie.
Discussion
Der har været en stigende interesse for at identificere planteprodukter som terapeutiske midler, der effektivt kan forstyrre cancercelleproliferation. Et slående lægeplante i dette register er
A
.
lineata
med en bred vifte af farmakologiske virkninger. I den foreliggende undersøgelse dels beskriver vi etablering af callus kulturer fra modne bladeksplantater. For det andet demonstrerer vi isolation og strukturel karakterisering af echioidinin, 7-
O
-methywogonin fra calluskulturer. For det tredje, udnytte cellebaserede assays vi viser behandling af echiodinin, 7-
O
-methywogonin på leukæmiceller afskaffet sin celleproliferation. De ovennævnte konklusioner er baseret på flere forskellige analyser som beskrevet i vores papir. Disse resultater er vigtige på grund af erkendelser for mennesker som søgningen efter nye farmakologisk aktive forbindelser fra planter har ført til opdagelsen af mange klinisk nyttige lægemidler.
Flere linjer af beviser i fortiden foreslår rolle plantevækstregulatorer stimulere biosyntesen af medicinsk vigtige sekundære metabolitter i planter
in vitro
vævskulturer [10,22,35,40]. En sådan sekundær metabolit produktion
in vitro
er baseret på den forudsætning, at den værdifulde vare produceret i naturen i alle organer eller andet væv fra en plante kan stimuleres til at ophobe sig i udifferentierede celler. Sådanne calluskulturer kan producere metabolitter i mængder langt over detektionsgrænsen, afhængigt af næringsmedium, saccharose koncentration, alder kallus og cellelinie. Wewetzer [40] rapporterede, at morfologisk differentiering er ikke en forudsætning for azadirachtin produktion; men de højeste koncentrationer blev påvist i helt udifferentierede celler. Vi rapporterer for første gang IAA akkumulere de flavonoider i callus kultur
A
.
lineata
. For nylig er det blevet rapporteret indflydelsen af IAA i at øge isoflavonindhold i callus kulturer af
Farve-Visse
sammen med cytokinin [22]. Yderligere vores observation af grønne pletter på callus indikerer den høje callus vækstrate samt callus evne til at producere skud. Forskere har formået at producere flere værdifulde sekundære fytokemikalier i uorganiserede calluskulturer [14,35,41,42,43,44,45].
I den foreliggende undersøgelse, en systematisk phytochemical undersøgelse af
A
.
lineata
callus kulturer fører til isolering og karakterisering af to forbindelser: 5, 2′-dihydroxy-7-methoxyflavone (echioidinin) og 7-
O
-methylwogonin. Isolering af 2′-iltede flavonoider, som forekommer sjældent i naturen, fra
A
.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.