PLoS ONE: hexon- Ændring til at forbedre aktiviteten af ​​onkolytiske adenovirusvektorer mod Neoplastiske og stromacellers i kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

Primær pancreas carcinoma har en ugunstig prognose og standard behandlingsstrategier meste fejle i avancerede tilfælde. Virotherapy kunne overvinde denne modstand til aktuelle behandlingsmodaliteter. Imidlertid har data fra kliniske studier med onkolytiske virus, herunder replikere adenovirale (Ad) vektorer, vises kun begrænset aktivitet mod kræft i bugspytkirtlen og andre karcinomer. Da bugspytkirtelcarcinomer har en kompleks tumor arkitektur og ofte en stærk stromale rum bestående af ikke-neoplastiske celletyper (hovedsagelig pancreas stjerneformige celler = hPSCs) og ekstracellulær matrix, er det ikke overraskende, at Ad-vektorer replikere i neoplastiske celler sandsynligvis ikke vil kunne udrydde denne aggressiv tumortype. Fordi TGFp-receptor (TGFBR) udtrykkes på begge neoplastiske celler og hPSCs vi indsat TGFBR målrettende peptid CKS17 i ​​den hypervariable region 5 (HVR5) af capsidprotein hexon med det formål at generere et replikerende Ad-vektor med forbedret aktivitet i komplekse tumorer . Vi demonstrerede øget transduktion af både kræft i bugspytkirtlen cellelinier og hPSCs og forbedret cytotoksicitet i co-kulturer af begge celletyper. Overfladeplasmonresonans analyse viste nedsat binding af koagulationsfaktor X til CKS17-modificerede Ad-partikler og

in vivo

biodistributionsstudier udført på mus angivet faldt transduktion af hepatocytter. For således at øge aktiviteten af ​​replikerende Ad-vektorer foreslår vi at slappe tumorcelle selektivitet ved genetisk hexon-medieret målretning til TGFBR (eller andre receptorer er til stede på begge neoplastiske og ikke neoplastiske celler i tumoren) for at muliggøre replikation også i det stromale celle rum af tumorer, mens afskaffe hepatocyt transduktion, og derved øge sikkerheden

Henvisning:. Lucas T, Benihoud K, Vigant F, Schmidt CQA, Bachem MG, Simmet T, et al. (2015) hexon- Ændring Forbedre Aktivitet af onkolytiske adenovirusvektorer mod Neoplastiske og stromacellers i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 10 (2): e0117254. doi: 10,1371 /journal.pone.0117254

Academic Redaktør: Eric J. Kremer, franske Nationale Center for Videnskabelig Forskning, FRANCE

Modtaget: November 14, 2013; Accepteret: December 22, 2014; Publiceret: 18 feb 2015

Copyright: © 2015 Lucas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Dette arbejde understøttes ved tilskud 109.545 (til SK og AW) fra Deutsche Krebshilfe. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bugspytkirtelkræft karcinom hører til de mest fatale menneskelige maligniteter i de vestlige lande, der har den laveste overlevelsesraten for enhver kræft [1,2]. Årsagerne er hurtig tumorvækst, tidlig fremkomst af metastaser, og diagnosticering på et fremskredent stadium. Til dato, reaktionen på nuværende standardbehandlinger (kirurgi, radio- og kemoterapi) er begrænset. Således er andre strategier presserende behov og genterapi tilgange med virusvektorer kan udgøre en ny vej til pancreas kræftpatienter. Adenovirale (Ad) vektorer er ofte blevet brugt i kliniske kræftbehandling studier. Trods lovende prækliniske data Ad-vektorer, der anvendes til behandling af pancreascancer har afsløret dårlig klinisk virkning [3,4]. Barrierer forklarer disse skuffende resultater omfatter i) den stærke leveren tropisme af humant adenovirus type 5 (HAdV-5; kort: Ad5), ii) den komplekse morfologi pancreascancer, og den lave ekspression af den primære Ad receptoren på tumorceller, og iii ) utilstrækkelig intratumoral spredning af ikke-replikerende eller konditionelt-replikerende vektorer.

på grund af den hurtige progression og tidlig debut af metastaser af pancreas ductusceller adenocarcinomer (PDACs) intravenøs administration af Ad-vektorer ville være nødvendigt for at nå formidles metastaser. Under vaskulær transport, dog Ad5 interagerer med en række forskellige cirkulerende opløselige faktorer, såsom koagulation blodfaktorer [5-7], naturlige antistoffer, og supplere [8] resulterer i en stærk optagelse af forskellige leveren celletyper, fx hepatocytter, lever makrofager (Kupffer celler) [9,10] og lever sinusformede endotelceller (LSECs) [11,12]. Selvom den serielle binding af Ad5 til dets primære receptor CAR [13] og avp3 og αvβ5 integriner [14] er afgørende for celle post

in vitro

, disse interaktioner synes ikke at være behov for hepatocyt transduktion, i det mindste i mus [15]. I stedet har adskillige grupper identificeret en anden annonce optagelse mekanisme, som er baseret på blod koagulationsfaktorer [5,6,16], særlig faktor X (FX), i mediering hepatocyt transduktion [5,7]. FX binder via dets Gla-domænet til forskellige hypervariable regioner (HVR) af de hexon capsomerer [7,16] og interagerer med membran-lokaliserede heparansulfatproteoglycan (HSPGs) [6], hvorved “bridging” virus til hepatocyt overflade. For nylig er en anden funktion af FX-binding til Ad-partikler blevet beskrevet, viser, at FX beskytter Ad partikler mod angreb fra det klassiske komplementforløb, så liver transduktion [17]. Foruden FX, har en anden optagelsesmekanisme blevet identificeret. Flere grupper har påvist optagelse og clearance af Ad partikler fra blod ved Kupffer celler (og LSEC) ved scavenger receptorer, naturlige antistoffer og supplerer [8,18,12].

bugspytkirtelcarcinomer-lignende andre karcinomer-have en komplekse væv sammensætning. Udover neoplastiske celler, stromale komponenter fundet i tumoren omfatter ikke neoplastiske celletyper, herunder stromaceller, endotelceller og makrofager og ekstracellulær matrix (ECM) komponenter (fx kollagener, fibronektiner). I mange tilfælde cancerceller udgør et mindre bidrag til den cellulære masse i tumoren. Ofte stromacellerne og ECM fuldstændigt omslutter tumorcellelinier reder. Denne stramme fysisk barriere dannet af stroma kan forhindre de nuværende Ad-vektorer (målrettet til kun tumorceller) at transducere tilstødende tumor celle områder og spredt over hele tumoren. Stromaceller af bugspytkirtelcarcinomer-udpeget som aktiverede pancreas stjerneformige celler (kvikskranker) – spiller en central rolle i tumorvækst og desmoplasia. Hos mus har co-injektion af bugspytkirtelkræftceller og menneskelige kvikskranker (hPSCs) vist sig at resultere i en accelereret tumorvækst fremhæver betydningen af ​​hPSCs i bugspytkirtelkræft [19,20].

Et komplekst indbyrdes samspil mellem kræft celler og ikke neoplastiske PSC er orkestreret gennem sekretion af forskellige vækstfaktorer, herunder transformerende vækstfaktor beta (TGFp). Således vil de fleste pancreas cancer cellelinjer udtrykker normale eller endog høje niveauer af type II TGF-receptor (TGFBRII) [21-23], og analyse af PDACs afslørede forøget TGFBRII ekspression sammenlignet med normal pancreas væv [24,25]. På grund af den lave CAR udtryk (Ad5 receptor) på bugspytkirtelcarcinomer eller andre maligniteter [26-28], kan TGFBRII være en kandidat receptor mål at overvinde begrænset tumor transduktion af Ad-vektorer.

For fuldstændig tumor ødelæggelse effektiv sprede af Ad5 er behov vektorer inden tumorvævet. I princippet kan intratumoral spredning opnås ved anvendelse replikerende (onkolytiske) Ad-vektorer. Sammenlignet med replikationsdefekte, E1-deleteret (ΔE1) Ad-vektorer, kan onkolytiske vektorer replikere og ødelægge tumorceller ved at frigive afkomsvirioner som er i stand til at inficere naboceller indtil-ideelt-hele tumoren ødelægges. På grund af sikkerhedshensyn, replikationen af ​​onkolytiske Ad-vektorer i almindelighed er normalt begrænset til kræftceller, enten ved anvendelse af vævs- /tumorspecifikke promotorer til at styre E1A-ekspression, eller ved at indføre mutationer i E1A og /eller E1 B, sidstnævnte principielt deaktivering viral replikation i ikke neoplastiske celletyper. I betragtning af den komplekse sammensætning af pancreas tumorer (som beskrevet ovenfor), sådan vektor design, dog vil usandsynligt resultat i udryddelse af karcinomer.

På vej mod vores mål at generere en onkolytisk Ad5 vektor målrettet igen fra hepatocytter til udbredes tumorvæv , erstattet vi den hypervariable region 5 (HVR5) af hexon (involveret i FX-binding og hepatocyt transduktion) ved det syntetiske targeting peptid CKS17, som er homolog med et konserveret domæne fundet i retrovirale kappeproteiner [29-31]. Af interesse til målretning både pancreas carcinomaceller og PSC indeholder heptadecapeptid CKS17 en formodet TGFp aktiv-site-motivet [32], der medierer binding til TGFBRII som opreguleres i de fleste bugspytkirtelcarcinomer. Faktisk fandt vi, at CKS17-modificerede Ad-vektorer kunne ansætte en TGFBRII-afhængig indgang celle mekanisme til at transducere CAR-negative bugspytkirtelkræftceller og primære hPSCs, resulterer i en øget cytolytisk effektivitet

in vitro

. Desuden udskiftning af hexon HVR5 af CKS17 reduceret binding til FX og førte til nedsat vektor optagelse i hepatocytter

in vivo

i mus.

Samlet set disse resultater viste, at Ad5 vektorer med reduceret hepatocyt tropisme og øget målretning til forskellige celletyper i tumor-især kræft og stromaceller-kan overvinde nogle af de vigtigste hindringer (signifikant hepatocyt transduktion, ineffektiv transduktion af målceller og begrænset intratumoral spredning på grund af den komplekse tumor struktur) for effektiv tumor målretning og destruktion af pancreascancer.

Materiale og metoder

Cellelinjer

N52.E6 celler er baseret på menneskelige amniocyter stabilt transformeret af E1A og E1B Ad5) [33] og blev dyrket i α-MEM-medium (Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 2 mM glutamin (Glutamax; Gibco). A549-cellelinien er en human lunge adenocarcinom epithelial cellelinie, der blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC nr CCL-243). A549-celler blev holdt i MEM-medium (Gibco) suppleret med 10% FCS og 2 mM glutamin. Etablerede humane pancreas tumorcellelinier Panc1 (ATCC No. CRL-1469), og MiaPaCa (ATCC nr 1420), og den tidlige humane pancreas tumorcellelinie UlaPaCa [34] blev dyrket i DMEM /F12 Ham’s medier (PAA, GE Healthcare, Coelbe, Tyskland) suppleret med 10% FCS og 2 mM glutamin. Primære humane pancreas stjemeformige celler (hPSC), isoleret som beskrevet tidligere [19,35], blev holdt i DMEM /Ham’s F12 medie suppleret med 20% FCS og 2 mM glutamin. Den kinesiske hamsterovarie K1 (CHOK1, ATCC nr CCL-61) cellelinje, der mangler coxsackie og adenovirus receptor (CAR) blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FCS og 2 mM glutamin. Den murine makrofag cellelinie Raw 264.7 (ATCC No. CRL-2278) blev dyrket i RPMI-1640-medium (Gibco) suppleret med 10% FCS og 2 mM glutamin. Cellelinier blev dyrket under standardbetingelser ved 37 ° C, 95% fugtighed og 5% CO

2.

Vira og adenovirusvektorer Salg

Alle vektorer blev afledt fra HAdV-5 (kort : Ad5). Ad1stGFP er en ΔE1 Ad5 vektor beskrevet tidligere [36]. AdGFPhCKS17 og AdGFPhWt er ΔE1 /E3 Ad vektorer. Alle tre vektorer udtrykker GFP under kontrol af en hCMV umiddelbart tidlige promotor i stedet for E1-regionen. Derudover har AdGFPhCKS17 været hexon modificeret ved at erstatte 13 aminosyrer af den hypervariable region 5 (HVR5) svarende til Ad5-sekvenser nukleotid (nt.) 19.645 til 19.684 (nummereringen er ifølge HAdV-5-sekvensen fra GenBank nummer AC_000008) med den syntetiske retroviral CKS17 peptidet [37] flankeret af yderligere aminosyrer, der tjener som afstandsstykke for bedre peptid display [38]. Den kodende sekvens af CKS17 peptid, der anvendes i dette arbejde er flankeret af korte sekvenser, der koder spacerregionen (små bogstaver) og tilstødende Ad5-sekvenser (understreget): CAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCGgggTTACAGAATCGTAGAGGCCTAGATCTACTATTCCTAAAAGAGGGAGGTTTGctgggcgggCCTAAGGTGGTATTGTACAGT. For vektor produktion alle ΔE1 og ΔE1 /E3 Ad-vektorer blev produceret i N52.E6 celler.

replikationskompetent vektor AdhCKS17 (være vildtype for Ad5 E1) bærer samme hexon-modifikation som dens ikke-replikerende modpart AdGFPhCKS17. AdhCKS17 og hexon-umodificeret kontrolvektor (AdhWt) blev dannet ved at indsætte Ad5 E1-området og for AdhCKS17 den CKS17 peptid kodende nucleotidsekvens i bacmidet pBelo-pGS66 baseret på pGS66 [33] ved homolog rekombination (Gene Bridges, Heidelberg, Tyskland ) efterfulgt af vektor regenerering fra bacmid. Humant Ad5 vildtype virus (Ad5Wt, venligst stillet til rådighed af Albert Heim, Hannover Medical School, Hannover, Tyskland), AdhWt og AdhCKS17 blev opformeret i A549 celler

Alle vektorer blev renset som tidligere beskrevet [39] af. en CsCI-densitet tringradient efterfulgt af en kontinuerlig CsCI densitetsgradient. Vektorerne blev afsaltet ved en PD-10 størrelsesudelukkelses-søjle (GE Healthcare, Dassel, Tyskland) og blev opbevaret ved -80 ° C i PBS suppleret med 10% (vol /vol) glycerol. Efter vektor oprensning vektor-DNA’et blev isoleret fra vektorpartikler af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) som beskrevet af manufacturer`s protokol og verificeret ved restriktionsanalyse og partiel sekventering. Smitsomme og partikler vektor titere blev bestemt ved DNA slot-blot-analyse [40] under anvendelse af et Ad5 fiber-specifik probe omfatter nt. 31.042 til 32.390 af Ad5-sekvensen. Den inverse bioaktivitet blev beregnet ved at dividere antallet af fysisk med antallet af infektiøse partikler.

Ad vektor medieret transduktion

in vitro

2×10

4 hPSCs eller 2×10

5 tumorceller blev podet i plader med 24 brønde. Ca. 16 timer senere blev celler transduceret med ΔE1 GFP-udtrykkende Ad5-vektorer (Ad1stGFP, AdGFPhCKS17 eller AdGFPhWt) ved angivne infektionsmultiplicitet (MOI) på fysiske partikler (PMOI) eller infektiøse partikler (iMOI) per celle.

til vurdering af vektor-medieret GFP-ekspression celler blev frigjort fra dyrkningsplader 24 timer efter transduktion under anvendelse af en forvarmet trypsinopløsning (Gibco). Efter tilsætning af PBS indeholdende 20 mM EDTA og 10% (v /v) FCS (for at inaktivere trypsin) og centrifugering ved 300 xg i 5 minutter, blev celler resuspenderet i FACS-buffer indeholdende 2% (v /v) FCS, 20 mM EDTA i PBS. Celler blev vurderet ved flowcytometrisk analyse ved anvendelse af et Becton-Dickinson FACSCalibur uden gating (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Relative transduktion enheder refererer til procentdelen af ​​GFP-positive celler eller den gennemsnitlige fluorescens af alle celler. At bestemme den relative Ad-genomet indhold i celler blev cellerne vasket to gange med forvarmet PBS i 5 minutter 2 timer efter transduktion og blev derefter løsrevet med 200 pi 50 mM EDTA i PBS. Efter tilsætning af 200 pi 0,8 N NaOH til cellelyse blev cellelysater underkastet DNA-slot-blot-analyse [40]. Relative Ad vektor genom indhold udtrykt som relative transduktion enheder blev beregnet og sat til 100% for A549 celler transduceret med en hexon-umodificeret Ad vektor.

AdWt replikation

in vitro

1×10

6 tumorceller pr 6 cm skål podet dagen før blev inficeret med Ad5Wt på en slot-blot justeres MOI på 1. To og 48 timer efter infektion blev cellerne vasket med forvarmet PBS og løsgøres ved trypsination. Efter inaktivering af trypsin af FCS-celler blev pelleteret (300 x g, 5 min, 4 ° C) og vasket med 1 ml PBS. Efter endnu centrifugeringstrin (300 x g, 5 min, 4 ° C) hver cellepellet blev resuspenderet i 200 pi PBS og totalt DNA blev isoleret med QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens protokol. To mikrogram DNA blev underkastet slot-blot-analyse under anvendelse af et Ad5 fiber-specifik probe. Ad replikation blev beregnet ud fra forholdet mellem Ad genom indhold opnået ved 48 og 2 timer efter infektion og sat til 100% for Ad5Wt-inficerede A549 celler.

Produktion af smitsomme Ad partikler

in vitro

1×10

6 tumorceller pr 6 cm skål podet dagen før blev inficeret med Ad5Wt på en slot-blot justeres MOI på 1. Otteogfyrre timer efter infektion blev cellerne vasket med forvarmet PBS og frigøres ved trypsination . Efter inaktivering af trypsin af FCS-celler blev pelleteret (300 x g, 5 min, 4 ° C) og vasket med 1 ml PBS. Efter endnu centrifugeringstrin (300 x g, 5 min, 4 ° C) hver cellepellet blev igen resuspenderet i 1 ml PBS. Celler blev derefter sprængt ved gentagen nedfrysning og optøning, og lysater blev klaret ved centrifugering (1800 x g, 5 min, 4 ° C). At fjerne uemballerede adenovirale genomer, cellulært DNA og RNA, blev lysater behandlet med 5 enheder Benzonase endonuklease (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. To og 10 mikroliter af lysatet blev anvendt til at reinficere 2×10

5 A549-celler podet dagen før. To timer efter reinfektion blev A549-celler vasket to gange med forvarmet PBS. Derefter blev celler fritliggende med 50 mM EDTA i PBS og lyseret med 0,4 N NaOH. Antallet af infektiøse partikler blev bestemt ved DNA slot-blot-analyse [40] under anvendelse af et Ad5 fiber-specifikke probe, og antallet af infektiøse partikler pr tumorcelle blev beregnet.

CAR-ekspression på pancreasceller

5×10

4 hPSCs og 5×10

5 tumorceller podet dagen før blev vasket med PBS og fritliggende med trypsin. Efter trypsin inaktivering med FCS blev celler pelleteret (300 x g, 5 min, 4 ° C) og vasket med 1 ml vaskebuffer (iskold PBS indeholdende 5% (v /v) FCS). Efter centrifugering blev supernatanten aspireret, anti-CAR primære antistof (1 ug per prøve, RmcB klon, Millipore, Schwalbach, Tyskland) blev tilsat og inkuberet i 30 minutter på is. Celler blev igen vasket og inkuberet med det sekundære antistof, Alexa 488, F (ab ‘)

2-fragment (1 ug pr prøve; Invitrogen, Darmstadt, Tyskland), i 30 minutter på is. Som kontrol tjente celler, som blev farvet med kun det sekundære antistof. Efter yderligere vasketrin celler blev resuspenderet i vaskebuffer og underkastet flowcytometrisk analyse for at bestemme CAR ekspression beregnet ud fra den gennemsnitlige fluorescensintensitet af alle celler.

Steady-state niveauer af TGFBRII på pancreasceller

Pankreatisk hPSCs og tumorceller blev lyseret i NP40 lysepuffer (50 mM Tris /HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,15% (vægt /volumen) Nonidet P-40) i nærvær af komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche, Penzberg, Tyskland) og 1 mM PMSF i 1 time på is. Efter gentagen nedfrysning og optøning celleaffald blev pelleteret (21.000 x g, 15 min, 4 ° C). Proteinkoncentrationen af ​​lysatet supernatanten blev bestemt (Bio-Rad protein assay; Biorad, Munchen, Tyskland). Halvtreds ug af lysaterne blev analyseret ved 8% SDS-PAGE og immunoblotting. TGFBRII blev påvist ved en anti-TGFBRII-specifikt polyklonalt antistof fra kanin (sc-1700; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland). Musen monoklonalt antistof DM1A fra Sigma-Adrich (Taufkirchen, Tyskland) blev anvendt til påvisning af α-tubulin tjener som en loading kontrol.

Competitive virus transduktion assays

For at demonstrere en ændret celle entry vej af en CKS17 hexon-modificerede Ad vektor blev monolag af A549 celler forbehandlet med opløselige fibre knop (venligst stillet til rådighed af Pierre Boulanger, Université Lyon, Lyon, Frankrig) ved 1000 ganges molært overskud i forhold til fiber protein eller med et polyklonalt anti-TGFBRII antistof fra kanin (sc-1700; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland) ved 1000 gange molært overskud i forhold hexonprotein i 30 minutter ved stuetemperatur. Som en isotype kontrol for anti-TGFBRII antistof blev anvendt det samme volumen af ​​kaninserum. AdGFPhCKS17 og kontrolvektoren blev tilsat ved en PMOI 100 uden at fjerne competitiors. Efter inkubation i 1,5 timer inkubation ved stuetemperatur blev cellerne vasket to gange med dyrkningsmedium til fjernelse resterende virus og konkurrenter. Derefter blev cellerne dyrket ved 37 ° C i yderligere 2 timer for at bestemme Ad genom niveauer fra isolerede totale DNA ved qPCR eller i 24 timer for at vurdere GFP-ekspression (udtrykt som den gennemsnitlige fluorescens af alle) ved flowcytometri.

Frigivelse af afkomsvirioner

1×10

6 hPSCs eller 2.5×10

6 A549, Panc1 eller UlaPaCa celler seedede dagen før blev vasket en gang med PBS. Efter tilsætning af mediet og replikerende Ad-vektorer (AdhWt eller AdhCKS17) ved en infektiøs MOI på 20, blev celler inkuberet i 6 timer ved 37 ° C. Derefter blev mediet indeholdende Ad-vektorer fjernet, og cellerne blev vasket to gange før frisk medium blev tilsat til cellerne. Prøver af mediet blev udtaget efter 48 og 72 timer efter infektion, centrifugeret for at fjerne celler, blandet med glycerol (til opnåelse af en 10% slutkoncentration af glycerol), og opbevares ved -80 ° C. Ved 72 timer efter infektion, blev celler skrabet i det resterende medium, og også opbevaret ved -80 ° C.

I efterfølgende kvantitativ PCR-analyse af frigivne Ad partikler i mediet DNA blev isoleret fra mediet udtaget 48 og 72 timer efter infektion under anvendelse af GenElute ™ Mammalian Genomisk DNA Miniprep kit (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). Kvantitativ PCR-analyse blev udført ved amplifikation af Ad5 E4 genet ved anvendelse af Stratagene 2 × Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step i en Stratagene 3005P qPCR maskine. For at generere en standard kurve blev medium tilsat 1×10

8 partikler af AdhWt og serielt fortyndet. Oligonukleotider: E4-sense (5’tagacgatccctactgtacg -3), E4-antisense (5’ggaaatatgactacgtccgg -3). Fyrre cykler med følgende termiske protokol blev udført: smeltning (95 ° C; 30 sekunder), annealing (60 ° C; 30 sekunder), og forlængelse (72 ° C; 30 sekunder). Til analyse blev antallet af E4 kopier bestemt af E4 Ct (dR) værdier, og standardkurven og henviste til celle numre seedede.

Antallet af smitsomme partikler, der frigives i mediet på 48 og 72 timer efter infektion og i cellerne og det opsamlede efter 72 timer medium blev bestemt ved plaque-analyse. Celler indsamlet sammen med medium blev sprængt ved gentagen frysning og optøning som beskrevet ovenfor. For at fjerne cellerester blev prøver centrifugeret ved 400 x g i 10 minutter, og supernatanter blev overført til friske rør. Mediet taget ved de angivne tidspunkter blev anvendt direkte i dette assay. Serielle fortyndinger af supernatanterne og mediet blev anvendt til at inficere A549-celler, der blev podet ved en række 7.5×10

5 celler dagen før. En 5% (vægt /volumen) PeqGold lavtsmeltende agarose-opløsning (opløst i PBS og autoklaveret) var 1: 4 fortyndet med medium indeholdende 2% serum og holdt ved 37 ° C. Efter 2 timer virusholdige medium blev forsigtigt aspireret, og cellerne blev overlejret med forvarmet (37 ° C) 1,25% (vægt /volumen) agarose-opløsning. Efter 15 minutter ved stuetemperatur for at tillade agarosen at størkne, blev cellerne inkuberet ved 37 ° C. Antallet af plaques blev talt 10 dage efter infektion.

Cellelevedygtighed assay

cytolytiske aktivitet af hexon-modificerede vektor blev analyseret i både enkelt- og co-kulturer af cancerceller og hPSCs. Således 2 x10

3-celler i enkelte cellekulturer i 96-brønds plader per brønd og hver 1 x10

3 af tumorceller og hPSCs i co-kulturer podet dagen før blev transduceret med AdhCKS17 og AdhWt kontrol, henholdsvis på forskellige partikel MOI i området fra 1 til 1.000. Syv dage efter infektion, blev cellelevedygtighed bestemt i henhold til den producentgaranti protokol ved hjælp af Cell-TiterGlo systemet (Promega, Mannheim, Tyskland).

SPR analyse

For at analysere samspillet mellem den hexon–modificeret (AdGFPhCKS17) og hexon-umodificeret kontrol (AdGFPhWt) vektorer med faktor X (FX) overflade (SPR) eksperimenter blev udført ved hjælp af en Reichert SR7500DC SPR instrument (Reichert Technologies, Buffalo, New York, USA Amerika). Menneskelig koagulation FX (Hæmatologisk Technologies, Essex Junction, Vermont, USA) blev kovalent immobiliseret på et flow celle af en (carboxymethyldextran hydrogel biosensor chip (CMD500m chip købt fra XanTec bioanalytics GmbH, Düsseldorf, Tyskland)) ved amin kobling ifølge producentens anvisninger. Standard aminkobling i mangel af protein (dummy kobling) blev udført på en anden flowcelle, hvilket gav en reference flowcelle. Signaler opnået for FX-overfladen blev trukket ved hjælp af signaler opnået for referencestrømmene celle ifølge standard procedure. Eneste reference trækkes sensorgrams vises. Fjernelse af glycerol fra virus-stamopløsninger og udveksling af puffer til 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM CaCI

2, og 0,005% Tween 20 blev opnået ved gelfiltrering under anvendelse af PD MiniTrap G-25-søjler (GE Healthcare , Dassel, Tyskland). Vektorer serielt fortyndet med den samme buffer til opnåelse af koncentrationer i området fra 1.25×10

8 til 1×10

9 fysiske partikler per milliliter blev passeret over chip’en i 3 minutter ved en strømningshastighed på 25 pl /min. Dissociationen fase bestod af buffer flow ved 25 pl /min i 5 minutter og blev efterfulgt af en regenerering trin med regenerering buffer (10 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA og 0,005% Tween 20), som blev injiceret i 50 s ved en flowhastighed på 25 pl /min.

FX-afhængige transduktion

for at undersøge indflydelsen af ​​hexon modifikation på samspil med FX FX-afhængige transduktion satser CKS17 hexon-modificerede Ad-vektor blev analyseret. Derfor 2×10

4 A549-celler blev intensivt vasket to gange med PBS en dag efter podning. Derefter modtog cellerne enten serumfrit medium (kontrol) eller serumfrit medium indeholdende 8 ug /ml FX (fysiologisk koncentration). Ad-vektorer med en partikel MOI (PMOI) på 1.000 blev tilsat til cellerne. Celler blev derefter inkuberet i 3 timer ved 37 ° C og vasket tre gange med PBS. Efter tilsætningen af ​​serumholdigt cellekulturmedium blev celler inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Derefter blev celler høstet som beskrevet ovenfor, og GFP-ekspression blev analyseret ved flowcytometri analyse.

In vivo

biofordeling

For at undersøge indflydelsen af ​​reduceret FX binding af hexon -modificeret annonce vektor AdGFPhCKS17

in vivo

, en biodistribution studie i mus blev udført. BALB /c-mus (6 til 8 uger gamle) blev erhvervet fra Charles River, Sulzfeld, Tyskland. Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care Kommissionen regerings Baden-Württemberg (Permit Antal: 975) og var i nøje overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. Clodronat var en gave fra Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Tyskland). Det blev indkapslet i lipsosomes som tidligere beskrevet [41]. For Kupffer-celle depletion, blev 200 pi clodronatpræparater liposomer injiceret i halevenen. Efter 24 timer, Ad vektorpartikler (3 x10

10) blev injiceret intravenøst ​​i halevenen af ​​mus i et totalt volumen på 200 pi (i HEPES-bufret saltvand). Fyrre minutter eller 72 timer efter injektion blev musene bedøvet ved isofluran (Forene; Abbott, Ludwigshafen, Tyskland) inhalation, blev leverne perfunderet med PBS, og organer blev opsamlet. Derefter blev musene aflivet ved bilateral torakotomi. Derefter organerne var snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C til efterfølgende DNA-isolering (qPCR analyse) eller homogenisering (fluorimetrisk analyse).

Kvantitativ PCR-analyser

Kvantitativ PCR analyse blev udført ved amplifikation af Ad5 fiber genet under anvendelse af Stratagene 2 × Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step i en Stratagene 3005P qPCR maskine. At normalisere for det cellulære DNA-indhold murine eller humane β-actin blev anvendt. For at generere standardkurver, lever-DNA fra naive mus (biofordeling undersøgelse) eller genomisk DNA isoleret fra humane A549-celler (konkurrence eksperiment) blev tilsat pGS66 indeholdende fiberen genet Ad5. Oligonucleotider: murint β-actin-sense (5′-GCTGTGTTCTTGCACTCCTTG-3 ‘), murine β-actin-antisense (5′-CGCACGATTTCCCTCTCAGC-3′), human β-actin-sense (5’-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3 ‘), humant β-actin-antisense (5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3 ‘), fiber-sense (5′-GCTACAGTTTCAGTTTTGGCTG-3′), fiber-antisense (5’-GTTGTGGCCAGACCAGTCCC-3 ‘). Fyrre cykler med følgende termiske protokol blev udført: smeltning (95 ° C; 30 sekunder), annealing (60 ° C; 30 sekunder), og forlængelse (72 ° C; 30 sekunder). Til analyse blev fiber Ct (DR) værdier normaliseret til p-actin Ct (DR) værdier af den samme prøve.

Fluorimetrisk analyse af mus leverhomogenater

Fem hundrede mikrogram perfunderet og lynfrosset lever blev homogeniseret i 1 ml homogeniseringsbuffer (50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v /v) NP-40, 0,25% (vægt /volumen) natrium-desoxycholat) med en konisk vævsformaler (Wheaton, Millville, NJ, USA), overført til et 1,5 ml reaktionsrør og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. Prøverne blev centrifugeret i 10 minutter, 20.000 x g, 4 ° C. Supernatanten klare fraktion blev overført til et nyt reagensglas, centrifugeret i 10 minutter, 20.000 g, 4 ° C, og fortyndet 1: 500 til 1: 20.000 i homogeniseringsbuffer. GFP-fluorescens blev analyseret i et fluorescensspektrometer LS50B (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) ved 488 nm excitationsbølgelængde og 512 nm emissionsbølgelængde. Relative enheder blev beregnet, og de vilkårlige enheder for den ikke-modificerede vektor blev sat til 1.

Neutralisering af Ad vektorer ved naturlig IgM

indflydelse hexon modifikation om anerkendelse af naturlige IgM-antistoffer blev undersøgt i en neutralisering assay. 2×10

4 A549 podet dagen før blev vasket en gang med PBS, og serum-frit medium blev tilsat. 1×10

7 AD partikler, som var blevet inkuberet i 20 minutter ved 37 ° C med 30 pi hirudinized (Refludan®, Celgene, München) plasma fra NMR1 mus eller med serum-frit medium (kontrol) i et samlet volumen af 32 pi, blev tilsat til cellerne. Efter 3 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne vasket en gang med PBS, og efter tilsætning af serumholdigt medium blev cellerne inkuberet ved 37 ° C i 24 timer efterfulgt af flowcytometri til bestemmelse GFP-ekspression.

Optagelse af Ad-vektorer af murine makrofager

1×10

5 Raw 264.7-celler podet dagen før blev vasket en gang med PBS, og serum-frit medium blev tilsat.

2×10

8 Ad vektorpartikel, som var blevet inkuberet med 30 pi hirudinized plasma fra NMR1 mus eller med serum-frit medium (kontrol) (i et samlet volumen på 35 pi) i 20 minutter ved 37 ° C blev tilsat til cellerne. Efter 45 minutters inkubering ved 37 ° C blev cellerne vasket to gange med PBS, og totalt DNA blev isoleret i overensstemmelse med producentgaranti protokol. *

P

*

P

*

P

*

P

0,01, ***

P