PLoS ONE: MIR-20a opreguleres i anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen og Mål LIMK1

Abstrakt

Baggrund

Der har været modstridende rapporter om funktionen af ​​miR-20a i en række forskellige kræftformer og vi tidligere fundet det at være dysreguleret i sporadisk versus familiær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen. I denne undersøgelse, studerede vi udtryk for miR-20a i normale, benigne og maligne thyreoidea prøver, og dens virkning på skjoldbruskkirtlen kræftceller

in vitro

in vivo

.

Metodologi /vigtigste resultater

udtryk for miR-20a i normal, benigne og maligne thyreoidea væv blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Thyroid cancer celler blev transficeret med MIR-20a og virkningen på cellulær proliferation, tumor kugleformet dannelse, og invasion blev evalueret. Target gener af miR-20 blev bestemt ved genom-dækkende mRNA-ekspression analyse med miR-20a overekspression i skjoldbruskkirtlen cancerceller og mål forudsigelse database. Målgener blev valideret ved kvantitativ PCR og immunoblotting, og luciferaseassays. MIR-20a-ekspression var betydeligt højere i anaplastisk thyreoideacancer end i differentieret thyroidcancer, og godartede og normal thyroid væv. MIR-20a betydeligt hæmmet kræft i skjoldbruskkirtlen celledeling

in vitro

(p 0,01) og

in vivo

(p 0,01), tumor klumpformet dannelse (p 0,05) og invasion (p 0,05) i multiple skjoldbruskkirtlen cancercellelinier. Vi fandt, at

LIMK1

var et mål på miR-20a i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer og direkte knockdown af LIMK1 opsummerede effekten af ​​miR-20a i skjoldbruskkirtlen kræftceller.

Konklusioner /Betydning

så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at vise, at miR-20a spiller en rolle som tumorsuppressor i skjoldbruskkirtlen kræftceller og mål

LIMK1

. Vores resultater tyder på opreguleret udtryk for miR-20a i anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen modvirker kræft i skjoldbruskkirtlen progression og kan have terapeutisk potentiale

Henvisning:. Xiong Y, Zhang L, Kebebew E (2014) MIR-20a opreguleres i anaplastisk Thyroid Cancer og Mål

LIMK1

. PLoS ONE 9 (5): e96103. doi: 10,1371 /journal.pone.0096103

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: 31 januar 2014; Accepteret: April 3, 2014; Udgivet: 23 maj, 2014

Copyright: © 2014. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i skjoldbruskkirtlen er den mest almindelige endokrine kræft og en af ​​de hurtigst voksende kræftdiagnoser i USA [1], [2]. Skjoldbruskkirtelkræft stammer fra follikulært celler og parafollikulære celler [3], [4]. Skjoldbruskkirtelkræft stammer fra follikulære celler tegner sig for over 95% af alle tilfælde kræft i skjoldbruskkirtlen og er klassificeret i fire store histologiske grupper (papillær kræft i skjoldbruskkirtlen (PTC), follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen (FTC), Hürthle celle carcinom (HCC), og anaplastisk thyroidea carcinom (ATC)). MikroRNA’er (miRNA) er blevet vist at blive dysreguleret i skjoldbruskkirtelkræft stammer fra follikelceller [5] – [7]. MiRNA er små, ikke-kodende RNA’er, som er ca. 21 nukleotider lang og regulerer genekspression [8], [9]. Generelt miRNA binder til 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af målgenet, der fører til undertrykte oversættelse eller nedbrydning af mRNA [9], [10].

MIR-20a er medlem på mIR-17-92 klynge lokaliseret på kromosom 13. Tidligere undersøgelser har vist, at mIR-20 kan virke til at fremme eller inhibere kendetegnende for malign celle fænotype i en celletype specifik måde [11] – [13]. For eksempel MIR-20a overekspression hæmmer cellulær proliferation, invasion, og tumormetastase i brystcancercellelinier [11], [12]. På den anden side, miR-20a undertrykker

E2F1

ekspression i humane B-cellelinie P-493-6, en transskriptionsfaktor, som fremmer G1-S-fase progression i mammale celler [14]. Dette fund tyder på, at miR-20a funktion kan være forskellige afhængigt af celletype. Vi har tidligere fundet MIR-20a at være opreguleret i familiær PTC sammenlignet med sporadiske tilfælde, som menes at være mere aggressive [3], [15]. Takakura et al. [16] fandt også, at miRNA af miR-17-92 klynge (miR-17-3p, -17-5p, -18a, -19a, -20a, -19b, og -92-1) blev overudtrykt i ATC-celle linjer.

i denne undersøgelse karakteriserer vi udtryk for miR-20a i normale, benigne og maligne thyreoidea prøver, og studeret dens virkning på kræft i skjoldbruskkirtlen celler

in vitro

i vivo

. Vi udførte også analyse af miR-20a målgener bruger mål forudsigelse database og genom-dækkende udtryk med miR-20a overekspression, og valideret target gener med luciferaseanalyse. Endelig viser vi, at LIMK1 rekapitulerer virkningerne af miR-20a i skjoldbruskkirtlen kræftceller.

Materialer og metoder

Menneskelig skjoldbruskkirtlen vævsprøver og dyreforsøg

Thyroid vævsprøver var lynfrosset på tidspunktet for thyroidectomy under en protokol godkendt af Kontoret for human Emne Forskning ved National Institutes of Health Clinical center, efter skriftligt informeret samtykke. Alle vævsprøver undergik sekundære yderligere histologi anmeldelse af en endokrin patolog at bekræfte diagnosen og identificere prøver med mere end 80% af tumorcellerne. Vævsprøver blev klassificeret som normalt, godartet (multinodøs struma, follikulært adenom, Hürthle celle adenom), differentieret kræft i skjoldbruskkirtlen [DTC] (klassisk PTC, follikulært variant af PTC, FTC), og ATC. Normal thyroid væv blev opnået fra patienter, der undergår thyroidectomy for benign eller malign sygdom fra den kontralaterale skjoldbruskkirtlen lap. I alt blev otte ATC, 22 DTC, 24 godartet, og 11 normale skjoldbruskkirtlen vævsprøver analyseret.

The National Cancer Institute Animal Care og brug Udvalg godkendte protokollerne for dyr pleje og håndtering i den foreliggende undersøgelse. Enhver mus oplever markant unormale neurologiske tegn, blødning fra enhver åbning, nedsat mobilitet, hurtigt vægttab, invaliderende diarré, ru pels, foroverbøjet kropsholdning, besværet vejrtrækning, sløvhed, vedvarende recumbence, gulsot, blodmangel, selvforskyldt traumer, bliver døende eller ellers bliver ude af stand til at skaffe føde eller vand, eller med en tumor 2 cm eller større i diameter er blevet straks aflivet ved CO

2 kammer.

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Menneskelig skjoldbruskkirtlen cancercellelinier XTC-1 (HCC) (venligst stillet til rådighed af Dr. Orlo H. Clark (San Francisco, CA)) [17], FTC-133 (FTC) (venligst stillet til rådighed af Dr. Peter Goretzki (Tyskland)), og TPC-1 (PTC) (venligst stillet til rådighed af Dr. Nabuo Satoh (Japan) [18]) blev opretholdt i DMEM med 4.500 mg /l D-glucose og L-glutamin og 110 mg /l natriumpyruvat, suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), thyreoidea-stimulerende hormon (TSH) (10 mU /ml), penicillin (10.000 U /ml), streptomycin (10.000 U /ml), Fungizone (250 mg /ml) og insulin ( 10 ug /ml) i en standard befugtet inkubator ved 37 ° C i en CO 5%

2 og 95% O

2 atmosfære. Serumfrie medier (DMEM-F12 media), som suppleres med fire hormoner (insulin [10 ug /ml], somatostatin [10 ng /ml], transferrin [5 ug /ml], og hydrocortison [0,36 ng /mL]), blev anvendt til de funktionelle genomics studier. Den humane ATC-cellelinje C643 blev venligst stillet til rådighed af Dr. Rebecca Schweppe, med tilladelse fra Dr. N.-E. Heldin (Sverige) [18], og blev opretholdt i RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA) indeholdende 10% FBS. Alle cellelinjer blev bekræftet af kort tandem repeat den 9. oktober, 2013 og den XTC-1-cellelinje blev også bekræftet at udtrykke thyroglobulin og natrium jod symporter som tidligere rapporteret [17].

miRNA transfektion

Modne miRNA precursor (pre-mIR-20a; Applied Biosystems, Foster City, CA) blev transficeret ind i celler ved en koncentration på 25 nm ved anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. En oligonukleotid ikke repræsenterer nogen kendt miRNA (Pre-mir miRNA precursormolekyler-Negative Control # 1; Applied Biosystems, Foster City, CA). Blev brugt som en negativ kontrol

SiRNA transfektion

LIMK1 siRNA # a (ID s8188), siRNA #B (ID s8189) og siRNA #C (ID s 8190) (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev transficeret ind i celler ved en koncentration på 60 nm ved anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad , CA) ifølge fabrikantens protokol. Lyddæmper Vælg Negative Control # 1 siRNA (Applied Biosystems) blev anvendt som en negativ kontrol.

RNA-isolering og kvantitativ real-time RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra cellelinjer under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). TaqMan miRNA Assay (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) blev anvendt til at måle miRNA ekspressionsniveauet. Totalt RNA blev revers transkriberet med en miRNA-specifik primer, efterfulgt af realtids-PCR med TaqMan prober. U6 blev anvendt som en endogen kontrol. Den relative mængde af mRNA’er i

LIM kinase 1

(

LIMK1

) blev bestemt under anvendelse af TaqMan assay (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) på en ABI 7900 HT-system, og human

GAPDH

blev anvendt som en endogen kontrol. Den ΔΔ Ct metode blev anvendt til at beregne ekspressionsniveauer.

Western blot-

Whole-cellelysat blev fremstillet med RIPA-buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL). LIMK1 proteinniveau blev bestemt ved Western blot under anvendelse af et kanin-polyklonalt anti-LIMK1 antistof (1:1500 fortynding; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). GAPDH protein blev detekteret ved anvendelse af et muse-monoklonalt anti-GAPDH (# 0411) antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Proliferationsassay

Celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af CyQUANT Cell proliferation Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Fluorescensintensiteten blev målt under anvendelse af en fluorescens-mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), med excitation ved 485 nm og emission detektion ved 538 nm.

Invasion assay

Cellulær invasion blev målt ved anvendelse BD BioCoat Matrigel invasion Chamber (BD Biosciences, Bedford, MA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Cellekulturmedium med 10% FBS blev anvendt som en kemoattraktant i den nedre brønd i Boyden kammer. Efter rehydrering af basalmembranen blev skjoldbruskkirtlen cancerceller podet i det øvre rum af kammeret i serum-frit medium (4 × 10

4 celler per brønd). Efter inkubation ved 37 ° C i 5% CO

2 i 22 timer, blev de ikke-indtrængende celler fjernet fra den øvre overflade, og de celler, der havde invaderet membranen til den nedre overflade blev farvet med Diff-Quik Stain Set (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Billeder blev taget fra membranen af ​​hver indsats under et mikroskop (50 ganges forstørrelse) med et digitalt kamera. Billederne blev vist på computerskærmen, og cellerne i de enkelte områder af hver indsats blev manuelt talt. Procentdelen af ​​celler invaderende blev bestemt ved at tælle antallet af celler invaderer gennem Matrigel matrix og membran i forhold til antallet af celler migrerer gennem membranen af ​​kontrol- skær uden Matrigel matrix. En invasion indeks blev beregnet på basis af forholdet mellem procentdelen af ​​invaderende celler divideret med procentdelen af ​​invaderende celler af kontrolceller. Salg

Sfæroide kultur

To dage efter miRNA transfektion, FTC-133 celler blev trypsiniseret, talt, resuspenderes i dyrkningsmedium og udplades i en Ultra Low Cluster plade (Costar, Corning, NY) ved 3,5 × 10

4 per brønd. Pladerne blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2, og mediet blev skiftet hver 2. til 3. dag. Efter 2 ugers dyrkning blev celler farvet med krystalviolet og fotograferet under et mikroskop. Det samlede areal er besat af sfæroider i et billede blev målt ved at begrænse omkredsen af ​​hver klumpformet, markerer hele området, og beregning af pixel numre ved hjælp ImageJ software (Maryland, USA).

Tumor xenografundersøgelser

FTC-133 celler transficeret med miR-20a eller miR-NC blev podet subkutant (10

5 levedygtige celler) i venstre og højre flanker af athymiske nøgne mus. Tumorer blev målt to gange om ugen med calipre, og volumener blev beregnet som længde × bredde × højde. Obduktion tumorprøver blev fotograferet for at dokumentere grov morfologi, og derefter prøver blev vejet.

Migration assay

Kræft i skjoldbruskkirtlen celle migration blev vurderet ved hjælp af en ridse-sår assay. 150.000 celler blev transficeret med miRNA (25 nM) eller siRNA’er (60 nM) og blev udpladet i seks-brønds plader og fik lov til at vedhæfte og vokse i 44 timer (miRNA) eller 72 timer (siRNA’er). Derefter blev tre lodrette sår lavet med en steril 10-pi pipettespids og en vandret linje blev foretaget på tværs af de tre linjer, så celler kunne observeres ved samme punkt. Cellerne blev inspiceret hver 12 timer og målinger op til 24 timer.

Genom-dækkende mRNA-ekspression Array

FTC-133 celler blev transficeret med MIR-20a og MIR-NC. Tre dage efter transfektion blev cellerne høstet. Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af Trizol (Invitrogen, USA). RNA kvalitet blev sikret ved brug af Agilent RNA 6000 Nano kit og Bioanalyzer 2100. One-hundrede halvtreds nanogram af total RNA blev anvendt til at udføre cDNA revers transkription, syntese, forstærkning, fragmentering, og terminal mærkning med GeneChip WT Sense Target mærkning og kontrol Reagenser (Affymetrix, Santa Clara, CA). Ca. 25 ng /pi cDNA blev hybridiseret til Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array GeneChip. De arrays blev vasket og farvet ved hjælp af fluidik protokol FS450_0007 procedure på en Affymetrix Fluidik Station 450. probe intensiteter blev scannet med GeneChip Scanner 3000. De rå data blev normaliseret og analyseret ved hjælp af Partek Genomisk Suite (Partek, Inc., St. Louis , MO). Varians-analyse blev anvendt til at bestemme de probesæt, der var signifikant forskellige mellem de to grupper. Genet liste blev filtreret med en fold-change cutoff på 1,5, hvilket resulterer i en produktion på signifikant differentiel ekspression ved p ≤ 0,05 og 1,5 gange eller flere forskelle.

Forudsigelser af mikro-RNA-mål

Targetscan 5,1 (https://targetscan.org/) blev anvendt til at identificere potentielle mål for miR-20a regulering i thyreoideavæv.

Luciferase reporter assay

1223 basepar 3 ‘ -UTR af menneskelig

LIMK1

blev klonet ind i en tom luciferase reporter vektor pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), genererer en vildtype

LIMK1

UTR luciferase reporter konstruktion (pEZX-LIMK1 -UTR). For den dobbelte luciferase assay blev FTC-133 celler udpladet tredobbelt i 12-brønds plader og co-transficeret med 0,25 ug af reporterkonstruktet og 15 pmol MIR-20a eller MIR-NC ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Efter 24 timer blev cellerne lyseret og analyseret for både ildflue og Renilla luciferase under anvendelse Luc-Pair miR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) på en SpectraMax M5E mikropladelæser (Molecular Device, Sunnyvale, CA), ifølge fabrikanterne ‘anvisninger.

Dataanalyse

data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien. For at bestemme statistisk signifikans blev variansanalyse og t-test anvendes som passende. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

MIR-20a er overudtrykt i anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen (ATC)

Vi fandt ekspressionsniveauet af miR -20a var signifikant højere i ATC end i DTC, godartede og normal thyroid væv (fig. 1). Der var ingen signifikant forskel i MIR-20a ekspressionsniveauet af

BRAF

mutation status (p = 0,62) eller sygdommens omfang (p = 0,70 for tumorstørrelse; p = 0,12 for lymfeknudemetastaser) i DTC eller PTC .

Y-aksen repræsenterer relativ miR-20a ekspressionsniveauet normaliseret til U6 (2

-ΔΔCt værdi). Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse totalt RNA fra 65 humane væv (8 ATC, 22 dobbeltbeskatningsoverenskomster, 24 godartet, og 11 normal). Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (* angiver p 0,05).

MIR-20a regulerer kræft i skjoldbruskkirtlen celleproliferation, kugleformet dannelse, og invasion

Vi overudtrykt miR-20a i fire skjoldbruskkirtlen cancercellelinier (TPC-1, XTC-1, FTC-133, og C643) under anvendelse af mIR-NC som en negativ kontrol for at bestemme dets virkning på celleproliferation. MIR-20a overekspression signifikant inhiberede celleproliferation med 24% i TPC-1-celler efter 144 timer (p 0,001), 34% i XTC-1-celler efter 144 timer (p 0,001), 22% i FTC-133-celler ved 144 time (p 0,001), og 22% i C643-celler ved 216 timer (figur 2A-D.). Vi evaluerede effekten af ​​miR-20a på tumorvækst

in vivo

. Vi fandt, at tumorxenotransplantater afledt af FTC-133-celler transficeret med MIR-20a var signifikant mindre end tumorxenotransplantater fra MIR-NC-gruppe (p 0,01) (. Figur 2E), og tumorvægte afledt af FTC-133-celler transficeret med miR-20a var også betydeligt mindre end de tumor vægte i miR-NC-gruppen (p 0,05). (. figur 2F)

(A-D). Thyroid cancer cellelinje proliferation med MIR-20a overekspression. Y-aksen repræsenterer celleantallet. (E-F) Kræft i skjoldbruskkirtlen

in vivo

vækst,

ex vivo

tumor høst og vægt. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (* angiver p 0,05; ** angiver p 0,01)

Vi studerede også virkningen af ​​miR-20a på kræft i skjoldbruskkirtlen celle tumor klumpformet dannelse.. FTC-133 cellelinjen danner sfæroider når dyrket i ultralav adhærerende dyrkningskolbe og med MIR-20a transfektion blev antallet og størrelsen af ​​sfæroider faldt betydeligt (fig. 3).

(A) repræsentativt billede af sfæroider i kultur med mIR-20a overekspression. (B) Kvantificering af sfæroide forskel med MIR-20a overekspression. Det samlede areal, som anvendes sfæroiderne i et billede blev målt ved omgiver omkredsen af ​​hver sfæroide, mærkning hele området, og beregning af pixel numre med ImageJ software (Maryland, USA). Y-aksen repræsenterer størrelsen og antallet af sfæroiderne. Fejl søjler repræsenterer SEM (* angiver p 0,05)

MIR-20a overekspression signifikant hæmmede celle invasion med 85% i TPC-1 celler (p 0,01)., 67% i XTC-1 celler (p 0,001), 61% i FTC-133 celler (p 0,001), og 87% i C643-celler (p 0,01) (Fig. 4). Der sås ingen signifikant forskel mellem celler transficeret med MIR-20a og MIR-NC i sårhelende assay under anvendelse TPC-1-celler og FTC-133 celler.

(A) TPC-1 skjoldbruskkirtlen cancercellelinie, (B) XTC-1 thyreoideacancer cellelinie (C) FTC-133 thyreoideacancer cellelinie, og (D) C643 thyroidcancer cellelinie. Y-aksen repræsenterer invasion indeks af skjoldbruskkirtlen cancerceller. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (* angiver p 0,05; ** angiver p 0,01; *** angiver p 0,001)

MIR-20a regulerer LIMK1 udtryk i skjoldbruskkirtlen kræftceller

Da miR-20a havde en virkning på celleproliferation og invasion

in vitro

in vivo

, vi var interesserede i at bestemme target gen (er) af miR- 20a. Vi anvendte to fremgangsmåder til bestemmelse MIR-20a-mål: (1) et mål forudsigelse database og (2) genom-dækkende ekspressionsanalyse med MIR-20a overekspression. Vi fandt 3635 forudsagte målgener for MIR-20a ved hjælp af Targetscan 5.0-software. Vi fandt 58 gener med ændret ekspression upon MIR-20a overekspression hjælp genom-dækkende ekspressionsanalyse. Blandt de 45 gener, hvis ekspressionsniveau blev nedreguleret, blev 37 gener forudsagt målgener af MIR-20a (tabel 1).

LIMK1

var den mest nedreguleret gen af ​​denne analyse og forud er rapporteret at have en rolle i tumorcelleinvasion og metastase [19] – [22]. Således var vi interesserede i at afgøre, om

LIMK1

var et direkte mål for miR-20a. Vi fandt, at LIMK1 proteinekspression i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinier (C643, XTC-1, FTC-133, og TPC-1) blev nedsat med miR-20a overekspression (fig. 5A). Faldet i LIMK1 protein ekspression blev observeret i op til 14 dage efter transfektion (fig. 5B).

(A) Immunoblots for LIMK1 proteinekspression i C643, XTC-1, FTC-133, og TPC-1 cellelinjer, som blev transficeret med enten mIR-20a eller mIR-NC i 72 timer. (B) Immunoblots for endogen LIMK1 og GAPDH i FTC-133-celler transficeret med enten miR-20a eller miR-NC i 7 dage, 14 dage og 21 dage.

For at bestemme, om hvorvidt

LIMK1

var et direkte mål for miR-20a, vi brugte en luciferase reporter vektor pEZX-MT01 med 3′-UTR af menneskelige

LIMK1

klonet ind i det, generere en

LIMK1

3′-UTR luciferase-reporterkonstruktion (pEZX-LIMK1-UTR). Vi udførte luciferaseassays med pEZX-LIMK1-UTR (vektor med 3′-UTR af LIMK1) cotransficeret ind FTC-133 cellelinje med MIR-20a eller MIR-NC. Vi fandt signifikant nedsat luciferaseaktivitet med MIR-20a overekspression sammenlignet med negativ kontrol (fig. 6A), hvilket antyder, at MIR-20a direkte nedregulerer

LIMK1

ekspression. I betragtning af, at miR-20a overekspression nedreguleret

LIMK1

i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer og den mest fremtrædende effekt af miR-20a på thyreoidea kræftceller var hæmning af cellulære invasion, vi undersøgt, om

LIMK1

har en effekt på cellulær invasion og migration. Vi fandt, at knockdown af

LIMK1

resulterede i nedsat cellulær invasion men ikke migration (Fig. 6B og C).

(A) luciferaseaktivitet af pEZX-LIMK1-UTR i FTC-133 celler når cotransficeret med miR-20a eller miR-NC. Alle luciferase målinger er udført i tre eksemplarer og aflæsninger blev udført ved 24 timer efter transfektion. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (* angiver p 0,05). (B)

LIMK1

siRNA knockdown i FTC-133 kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinje. LIMK1 mRNA-ekspression ved kvantitativ RT-PCR (øverste panel). LIMK1 proteinekspression ved Western blot (nederste panel). Der vises data for 72 timer efter siRNA transfektion. (C) Cellular invasion med LIMK1 knockdown. Transfektion af

LIMK1

siRNA’er hæmmede FTC-133 kræft i skjoldbruskkirtlen invasion celler. Y-aksen repræsenterer invasion indeks af skjoldbruskkirtlen cancerceller. Der vises data for 72 timer efter siRNA transfektion. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (* angiver p 0,05; ** angiver p 0,01). (D) Transfektion af

LIMK1

siRNA’er har ingen effekt på migrationen af ​​FTC-133 skjoldbruskkirtlen cancerceller. Y-aksen repræsenterer såret afstand. Der vises data for 72 timer efter siRNA transfektion. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien.

Diskussion

I denne undersøgelse fandt vi miR-20a blev overudtrykt i ATC i forhold til DTC, godartet og normal skjoldbruskkirtel væv. Ektopisk overekspression af miR-20a betydeligt hæmmet kræft i skjoldbruskkirtlen celledeling

in vitro

in vivo

, og væsentligt hæmmede tumor klumpformet dannelse og invasion i flere kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer. Dette antyder, at MIR-20a har en tumor undertrykkende funktion, når den er opreguleret i kræft i skjoldbruskkirtlen. Vi fandt også, at miR-20a regulerer

LIMK1

udtryk, hvilket tyder på, at

LIMK1

er et target gen, der kan mægle de undertrykkende effekter af miR-20a på vækst og invasion af skjoldbruskkirtlen kræftceller. Men en begrænsning af vores studie er det lille antal ATC tumorprøver analyseret, men det er en sjælden malignitet.

MIR-20a og MIR-17 (også kaldet MIR-17-5p) er placeret sammen i mIR-17-92 klynge, og de har samme frø sekvens, AAAGUG. Dette frø sekvens deles af tre andre modne menneskelige miRNA (miR-106a, -106b, og -20b), som er placeret i kromosom 7 og kromosom X. MIR-20a mål mange gener, herunder

VEGFA

,

TGFBR2

,

CCND1

,

IL-8

,

MAPK14

,

PCAF

,

RUNX1

,

STAT3

, og

E2F1

[11] – [14], [23] – [26]. Mange af disse gener spiller vigtige roller i reguleringen af ​​celleproliferation, cellecyklus, apoptose og cellulære migration og invasion. MIR-20a kan fungere som enten en tumor suppressor eller et kræftpsykologisk miR, afhængigt af den specifikke celletype og ekstracellulære faktorer [11] – [13]. Faktisk har MIR-20a overekspression blevet observeret at inhibere cellulær proliferation, invasion, og tumormetastase i brystcancercellelinier [11], [12], hvilket tyder på en tumor suppressor rolle for MIR-20a overensstemmelse med vores data i skjoldbruskkirtlen cancercellelinier og det bliver opreguleret i ATC (15, 16). I modsætning hertil har tidligere undersøgelser vist, at MIR-20a kan fremme proliferation i humane ovariecancerceller [27], og migration og invasion i humane cervikale cancerceller, ovariecancerceller og osteosarcomceller [27] – [29], hvilket antyder, at miR-20a fungerer som en kræftpsykologisk miR

Takakura og associerede rapporterede, at miR-17-92 klynge (miR-17-3p, -17-5p, -18a, -19a, -20a,. – 19b, og -92-1) blev overudtrykt i ATC-cellelinjer [16]. Brug kvantitativ RT-PCR, viste de, at miR-17-3p og miR-17-5p blev overudtrykt i tre af seks ATC vævsprøver sammenlignet med normale vævsprøver. De rapporterede, at transfektion af inhibitorer af MIR-17-5p undertrykt ekspressionsniveauet af MIR-17 familie (MIR-17-5p, MIR-20a, og MIR-106a og b) i ARO-celler, hvilket resulterer i reduktion af cellevækst. Men vores undersøgelse af funktionen af ​​miR-20a i kræft i skjoldbruskkirtlen var anderledes end den undersøgelse, som Takakura og kolleger. Først vi specifikt overudtrykt miR-20a til at forstå dens virkning på tumor cellebiologi i både udifferentierede og differentierede kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer, og vi brugte ikke hæmmere af flere medlemmer af miR-17-92 klynge med mulige off target effekter, som kan ikke kun være selektiv til mIR-20a. For det andet, har vi bemærket, at Takakura et al. brugte celler behandlet kun med transfektionsreagens som den negative kontrol stedet for at bruge scrambled oligonukleotider, og vi brugte krypteret oligonukleotider som den negative kontrol. Derudover cellelinjer vi brugte (C643, TPC-1, FTC-133 og XTC-1) var anderledes end de anvendte cellelinier (ARO og tilbage) af Takakura og kolleger. Endelig ARO cellelinjer, der anvendes i den undersøgelse, som Takakura og partnere må ikke have været bekræftet kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer [18].

Vi fandt, at miR-20a regulerer

LIMK1

udtryk i skjoldbruskkirtlen cancercellelinjer.

LIMK1

er reguleret af Rho signalvejen, og det modulerer actin dynamik ved at regulere aktiviteten af ​​cofilin familie proteiner [30], [31]. Tidligere undersøgelser har vist, at

LIMK1

spiller en central og vigtig rolle i tumorcelleinvasion og metastase [19] – [22].

LIMK1

overekspression øger invasiv af brystkræft og prostatakræft celler

in vitro

in vivo

, og bankede ned af

LIMK1

undertrykker bryst og prostata cancercelleinvasion

in vitro

in vivo

[19] – [22], [32]. På baggrund af resultaterne fra vores genom-dækkende genekspression og target forudsigelse analyser, vi spurgte, om miR-20a overekspression påvirker

LIMK1

udtryk i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer. Vi fandt faktisk, at

LIMK1

i alle kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinier (C643, XTC-1, FTC-133, og TPC-1) blev hæmmet med miR-20a overekspression, hvilket tyder på, at den undertrykkende effekt af miR -20a på cellulær proliferation og invasion kan medieres af dens virkning på

LIMK1

. Faktisk direkte knockdown af

LIMK1

havde de samme effekter på cellulær invasion og migration som observeret med overekspression af miR-20a.

I betragtning af den tumor undertrykkende effekt af miR-20a i skjoldbruskkirtlen kræftceller vi observerede

in vitro

in vivo

, er det muligt, at en vellykket levering af miR-20a kan resultere i tumor undertrykkelse /regression uanset celletype og eller basal miR-20a niveauer [ ,,,0],33]. Tumoren undertrykkende effekter af miR-20a kunne også være medieret af andre gener end

LIMK1

. Vi valideret

LIMK1

som et mål, fordi det havde den laveste ekspression med MIR-20a overekspression men som anført i Tabel 1 mange kandidat målgener blev ændret med MIR-20a overekspression og således kunne også mediere sine tumor undertrykkende virkninger.

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at karakterisere effekten af ​​miR-20a på kræft i skjoldbruskkirtlen celle fænotyper og vise, at miR-20a regulerer

LIMK1

udtryk. Vores resultater tyder på det opreguleret ekspressionen af ​​miR-20a i anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen modvirker kræft i skjoldbruskkirtlen progression og kan have terapeutisk potentiale [34].

Støtte oplysninger

tabel S1.

Supplerende Tabel

doi:. 10,1371 /journal.pone.0096103.s001

(DOC)