PLoS ONE: retinoblastoma Bindende Protein 2 (RBP2) Fremmer HIF-1α-VEGF-induceret angiogenese af ikke-småcellet lungekræft via Akt Pathway

Abstrakt

Baggrund

Patologisk angiogenese spiller en væsentlig rolle i tumor aggressivitet og fører til ugunstige prognose. Formålet med denne undersøgelse er at påvise potentielle rolle retinoblastoma bindende protein 2 (RBP2) i tumorangiogenese af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

Metoder Salg

Immunohistokemisk farvning var anvendes til at påvise ekspressionen af ​​RBP2, hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) og CD34. To par siRNA sekvenser og pcDNA3-HA-RBP2 blev anvendt til nedregulere og opregulere RBP2 ekspression i H1975 og SK-MES-1-celler. En endotelcelle rør-dannelse assay VEGF enzymkoblet immunosorbentassay, real-time PCR og western blotting blev udført for at påvise de potentielle mekanismer medieret af RBP2 i tumorangiogenese.

Resultater

fra 102 trin I NSCLC prøver analyseres, høj RBP2 proteinekspression er tæt forbundet med tumorstørrelse (P = 0,030), høj HIF-1α ekspression (P = 0,028), høj VEGF-ekspression (P = 0,048), øget tumorangiogenese (P = 0,033 ) og dårlig prognose (P = 0,037); høj MVD blev forbundet med høj HIF-1α ekspression (P = 0,034), høj VEGF-ekspression (P = 0,001) og dårlig prognose (P = 0,040). Multivariat analyse indikerede, at RBP2 havde en uafhængig indflydelse på overlevelsen af ​​patienter med trin I NSCLC (P = 0,044). Ved modulering af ekspressionen af ​​RBP2, vores resultater antydede, at RBP2 protein depletion faldt HUVEC’er rør-dannelse ved nedregulering VEGF i et konditioneret medium. RBP2 stimulerede opregulering af VEGF, som var afhængig af HIF-1α, og aktiveret HIF-1α via phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt-signalvejen. Desuden VEGF øget aktivering af Akt reguleret af RBP2.

Konklusioner

RBP2 protein kan stimulere HIF-1α ekspression via aktivering af PI3K /Akt-signalvejen under normoxi og derefter stimulere VEGF udtryk. Disse resultater viser, at RBP2 kan spille en afgørende rolle i tumor angiogenese og tjene som et attraktivt terapeutisk mål mod tumor aggressivitet for debuterende NSCLC patienter

Henvisning:. Qi L, Zhu F, Li Sh, Si Lb, Hu Lk, Tian H (2014) retinoblastoma Binding Protein 2 (RBP2) Fremmer HIF-1α-VEGF-induceret angiogenese af ikke-småcellet lungekræft via Akt Pathway. PLoS ONE 9 (8): e106032. doi: 10,1371 /journal.pone.0106032

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: April 9, 2014 Accepteret: 27 Juli 2014; Udgivet: 27 August, 2014

Copyright: © 2014 Qi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Projektet blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.571.844), Videnskab og Teknologi Development Foundation i Shandong-provinsen (Nej . 2009GG10002007), og National Natural Science Foundation i Shandong-provinsen (nr ZR2009CM090). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er blandt de mest almindelige maligne sygdomme, der fører til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Trods talrige forbedringer i kirurgiske teknikker og adjuverende kemo- og stråleterapi for NSCLC i de seneste årtier, er prognosen fortsat relativt fattige [2]. En række nye molekylære markører og eventuelle nye mål har vist sig at behandle sygdommen. Men tumorprogression er en flertrinsproces og den molekylære mekanisme bag lunge carcinogenese er stort set uklar.

Patologisk angiogenese er et relativt tidligt begivenhed i carcinogenese, og øget tumor angiogenese er korreleret med invasiv tumorvækst og metastase og en dårlig prognose [3], [4]. Det er blevet foreslået, at vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α) spiller en kritisk rolle i tumorangiogenese. VEGF, som er den mest grundigt karakteriseret endotelcellespecifikt angiogen faktor, fører til forøget vaskulær permeabilitet og spiller en betydelig rolle i fysiologisk og patologisk angiogenese [5], [6]. Akkumulere beviser har vist, at HIF-1α, et heterodimert protein bestående af HIF-1α og HIF-1β underenheder, er forbundet med forskellige aspekter af cellulær og fysiologisk proces. Under normoxi, HIF-1α er prolyl-hydroxylerede, ubiquitylated og nedbrudt i proteasomer ved binding til von Hippel Lindau (VHL) komplekset. Efter hypoxi stabilisering, HIF-1α binder til HIF-1β i kernen og initierer transskription af målgener via hypoxi-responsive element [7], [8], [9]. I de seneste år har mange undersøgelser antydet, at HIF-1α også kunne føre til forhøjede ekspression af forskellige gener involveret i forskellige biologiske funktioner i henhold normoxi, herunder celleproliferation, apoptose, migration, invasion og angiogenese [10], [11].

retinoblastoma bindende protein 2 (RBP2), et medlem af Jarid familien af ​​proteiner, er en nuklear phosphoprotein med demetylase aktivitet for lysin 4 af histon H3 (H3-K4) [12], [13], [14 ]. Det fremgik, at RBP2 udøver sin funktion dels ved at undertrykke transskriptionen af ​​målgener involveret i differentieringen og at binding til retinoblastoma protein (pRB) konverterer RBP2 fra en transkriptionel repressor til en transkriptionel aktivator [15], [16]. Nyere forskning i lungekræft har fastslået, at RBP2 er korreleret til tumor migration og invasion ved direkte binding til integrin β1 (ITGB1) initiativtagere [17]. En anden undersøgelse viste, at RBP2 opregulerer ekspressionen af ​​N-cadherin og sneglen via aktiveringen af ​​Akt signalering [18]. Desuden er ITGB1 og Akt signalering signifikant korreleret med tumorangiogenese [19], [20], [21], [22]. Taget sammen antyder disse resultater, et onkogent rolle for RBP2 i tumorangiogenese og progression.

I denne undersøgelse blev RBP2 ekspression sig at blive forøget i NSCLC cellelinier såvel som i de NSCLC væv fra patienter. For yderligere at undersøge de potentielle roller RBP2 i tumor angiogenese, giver vi beviser for, at høj RBP2 udtryk i NSCLC cellelinier væsentligt fremmer tumor angiogenese og belyse involveret i aktiveringen af ​​Akt signalering mekanisme, induktion af HIF-1α ophobning protein og VEGF udtryk under normoxi.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Qilu Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient til at offentliggøre case detaljer, og erhvervelse af vævsprøver blev udført som foreskrevet af de institutionelle retningslinier.

Patienter

I alt 102 patienter (71 mænd og 31 kvinder, gennemsnitsalder 62 ± 3,56 år) med trin i NSCLC, der blev komplet tumor resektion (lobectomy eller pneumonectomy) med regional lymfeknude dissektion mellem januar 2006 og december 2008 afdelingen for Thoracic Surgery, Qilu Hospital, blev inkluderet i Studiet. Den histologiske undersøgelse og kvalitet af kræft celledifferentiering var baseret på klassifikationssystem af World Health Organization revideret i 2004 og TNM af UICC 2009. Desuden 3 patienter (2 sager med stor celle kræft og 1 tilfælde med adenosquamøst kræft ) blev komplet tumor resektion i denne periode blev udelukket på grund af for lille stikprøve. De kliniske karakteristika for de 102 patienter er vist i tabel 1.

Immunhistokemi

Immunohistokemisk farvning for RBP2, HIF-1α, VEGF og CD34 blev udført under anvendelse af streptavidin-peroxidase metode . Kort fortalt blev 4-um-tykke snit skåret fra paraffinindlejrede blokke, og objektglassene blev inkuberet med primære antistoffer mod RBP2 (Bethyl, Montgomery, TX, USA, fortynding 1:100), HIF-1α (BD Biosciences, Pharmingen , Lexington, MA, USA, fortynding 1:100), VEGF (A-20; Santa Cruz Bioteknologi, CA, USA, fortynding 1:150) og CD34 (sc-19621; Santa Cruz Bioteknologi, CA, USA, fortynding 1: 100) natten over ved 4 ° C. Efterfølgende blev biotinylerede sekundære antistoffer og peroxidase-konjugeret streptavidin kompleks reagens anvendt, efterfulgt af modfarvning med Mayers hematoxylin. Positive og negative kontroller blev indbefattet i hvert trin. Ekspression af RBP2 protein blev evalueret ved at beregne et samlet immunfarvning score som produktet af både intensiteten score (0, negativ farvning; 1, svag farvning, 2, moderat farvning, 3, stærk farvning) og andelen score (0, ingen; 1, 10%; 2, 10-50%, 3, 51-80%, 4, 80%). Således er den samlede score varierede fra 0 til 7. De immunfarvet slides blev evalueret af to uafhængige efterforskere i en blindet måde og revurderes af disse efterforskere under en multihead mikroskop i uharmoniske tilfælde at nå til enighed. Til bedømmelse af positiv farvning af RBP2 blev mindst 3 sektioner eller områder fra hver prøve scoret.

I tumorassocieret angiogenese kvantificering, blev mikrokar densitet (MVD) evalueret ved at tælle CD34-positive immunfarvet endotelceller. CD34-positive endotelceller samt klynger af endotelceller, der var klart adskilt fra hosliggende mikrokar blev målt som tællelige mikrokar [23], [24], [25]. For at kvantificere MVD blev fem meget vaskulære områder scannet ved lav effekt til at identificere “hot spots” og talt mikroskopisk i high-power (200 × forstørrelse) felter. Den gennemsnitlige optælling af ti vision felter blev registreret som den endelige MVD (to observatører og fem vaskulære hotspots hver).

cutoff værdi for RBP2 og MVD ekspression blev bestemt på grundlag af en heterogenitet værdi målt gennem en log- rang statistisk analyse med hensyn til den samlede overlevelse [26]. Det endelige farvning score på 4 blev valgt som cutoff point for diskrimination mellem høj og lav RBP2 ekspression. Derfor tumorer med en endelig farvning score ≥4 blev defineret som overudtrykker RBP2 protein. Tumorer med mikrokar ≥57 blev klassificeret som høj MVD; tumorer med mikrokar 57 blev klassificeret som lav MVD. HIF-1α blev betragtet overudtrykt når 1% af kerner var positive som beskrevet før [27]. Tumorer med en endelig farvning score ≥3 blev defineret som overekspression VEGF-proteinet [28].

cellelinier, kultur Betingelser, transfektion og Lille interfererende RNA Behandling

Den menneskelige lunge adenocarcinom cellelinjer A549 , SPCA-1.-H1975 blev købt fra National Cancer Institute (Bethesda, MD, USA). Den humane lunge squamous cellelinie SK-MES-1 og den humane bronchiale epitelcellelinie BEAS2B blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Humane umbilical vene-endotelceller (HUVEC’er) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De BEAS2B, A549, SPCA-1 og H1975-celler blev dyrket i Roswell s Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Hyclone, Logan, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Gaithersburg, USA). SK-MES-1-celler blev dyrket i MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 20% FBS. HUVEC’er blev dyrket i endotelcellevækst-medium M199 suppleret med 15% FBS, 1 mg /ml lave serum væksttilskud og 2 mM glutamin. Alle celler blev inkuberet i 5% CO

2 ved 37 ° C. RBP2 blev overudtrykt hjælp pcDNA3-HA-RBP2, en generøs gave fra W.G Kaelin [12], og siRNA for RBP2 blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Plasmidet pcDNA3-HA-HIF-1α blev indkøbt fra Addgene (Plasmid 18949) [29], og siRNA for HIF-1α (ONTARGET plus SMART pool, L-004.018) blev indkøbt fra Dharmacon RNA Technologies (Chicago, IL, USA) . Plasmidet pcDNA3 Myr HA Akt1 blev indkøbt fra Addgene (Plasmid 9008) [30]. For den lille interfererende RNA (siRNA) behandling blev celler inkuberet i 6-brønds plader (3,0 x 10

5 /brønd) natten over og derefter transfektion blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Følgende siRNA-sekvenser blev anvendt i denne undersøgelse: RBP2 siRNA1 5′-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 ‘; RBP2 siRNA2 5’-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 ‘; kontrol siRNA 5’-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 “.

Udarbejdelse af konditioneret medium

De RBP2-siRNA1 H1975 celler, RBP2-siRNA2 H1975 celler og kontrol-siRNA H1975 celler blev dyrket under serum-frit forhold i RPMI 1640 medium i 24 t. Supernatanten blev derefter opsamlet, centrifugeret, filtreret gennem et 0,22 mm filter (Millipore, Billerica, USA) og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse i enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) og dannelse rør assay.

endotelcelle Tube formation assay

dannelsen rør assay blev udført som tidligere [31] beskrevne. Kort fortalt HUVEC’er (1 × 10

4 /brønd) blev podet i plader med 96 brønde overtrukket med Matrigel (50 pi) og derefter inkuberet ved 37 ° C i 1 time til polymerisation. HUVEC’er (1 × 10

4 celler) blev podet i brønde med forskellig konditionerede medier fra RBP2-siRNA1 H1975 celler, RBP2-siRNA2 H1975 celler og kontrol-siRNA H1975 celler. En VEGFR inhibitor (sunitinibmalat 2,5 uM) [32] blev tilsat til det konditionerede medium af kontrol siRNA H1975-celler og rekombinant human VEGF-165 (rhVEGF165, Millipore, Billerica, MA, USA, 2 ng /ml) blev tilsat til det konditionerede medium af RBP2-siRNA2 H1975 celler. De 96-brønds pladerne blev inkuberet i 6 timer, og dannelse rør blev derefter fotograferet under et inverteret mikroskop. Dannelsen rør evne blev kvantificeret ved at tælle det samlede antal af komplette rør, og gennemsnittet af tre tilfældige × 200 felter pr brønd blev registreret som værdien per brønd.

VEGF-enzymimmunanalyse (ELISA)

VEGF-niveauer i de forskellige konditionerede medier blev bestemt ved anvendelse af et ELISA-kit (R 0,05

Resultater

1. Korrelation af RBP2 protein og MVD med clinicopathologic faktorer

Immunhistokemi med RBP2 (Fig. 1A og fig. 1B) og HIF-1α (fig. 1D og fig. 1E) antistoffer viste en positiv reaktion i kernen, og VEGF antistoffer (fig. 1F og fig. 1G) viste en positiv reaktion i cytoplasmaet af tumorceller. RBP2 blev påvist som værende overeksprimeret i 52 (51%) af 102 NSCLC prøver efter de ovennævnte kriterier. Forholdet mellem RBP2 proteinekspression og clinicopathologic faktorer blev undersøgt af chi-square test og vores data viste, at RBP2 overekspression var forbundet med tumorstørrelse (

P

= 0,030), høj HIF-1α udtryk (

P

= 0,028) og høj VEGF-ekspression (

P

= 0,048). Men der var ingen statistisk signifikans i forholdet mellem RBP2 udtryk og andre clinicopathologic variabler (

P

0,05, tabel 1)

(A) Høj RBP2 proteinekspression i pladecellekræft. ; (B) høj RBP2 proteinekspression i adenocarcinom; (C) negativ RBP2 proteinekspression i NSCLC; (D) høj HIF-1α ekspression i pladecellekræft; (E) høj HIF-1α proteinekspression i adenocarcinom; (F) høj VEGF-ekspression i pladecellekræft; (G) høj VEGF i adenocarcinom; (H) høj CD34-ekspression i pladecellekræft; (I) høj CD34-ekspression i adenocarcinom.

intratumoral MVD blev kvantificeret ved at tælle CD34-positive endotelceller i den samme serie af lungekræft væv (fig. 1H og fig. 1I), og den gennemsnitlige antal mikrokar i ti områder blev talt som et mål for MVD for hver prøve. Det gennemsnitlige antal mikrokar af MVD i hver tumor prøve varierede bredt, fra 6,4 til 102. Som tidligere beskrevet, tumorer med mikrokar ≥57 blev klassificeret som høj MVD og 46 tilfælde (45,1%) viste høj MVD. Den chi-square test viste, at høje MVD var forbundet med høj HIF-1α udtryk (

P

= 0,034) og høj VEGF-ekspression (

P

= 0,001), men der blev observeret nogen signifikante korrelationer mellem MVD og andre clinicopathologic faktorer (

P

0,05, tabel 1).

immunhistokemisk farvning af de serielle sektioner af kræft væv viste, at den mediane MVD var 59,6 i den høje RBP2 udtryk gruppe (7,8 til 102) og 35,4 i den lave RBP2 ekspression gruppe (6,4 til 94). Endvidere vores statistiske analyse demonstrerede, at høje MVD blev detekteret hyppigere i tumorer med RBP2 proteinoverekspression end hos dem uden overekspression (

P

= 0,033, Mann-Whitney U test, fig. 2A). Disse data tyder på, at RBP2 kan fremme patologisk angiogenese i NSCLC progression.

(A) Sammenhæng mellem RBP2 udtryk og MVD for trin I NSCLC. NSCLC med høj RBP2 proteinekspression viste signifikant højere intratumoral MVD end med lav RBP2 proteinekspression (

P

= 0,033, Mann-Whitney U-test). (B) Kaplan-Meier kurver af samlet overlevelse viste en dårlig 5-års samlede overlevelse hos patienter med RBP2 protein overekspression (53,8% versus 72,0%,

P

= 0,037). (C) Kaplan-Meier kurver af samlet overlevelse viste en dårlig 5-års samlet overlevelse hos patienter med høj MVD (52,2% versus 71,4%,

P

= 0,040).

en Kaplan-Meier analyse af den samlede overlevelse viste også en dårlig 5-års samlede overlevelse hos patienter med RBP2 protein overekspression (53,8% versus 72,0%,

P

= 0,037;. figur 2B) og høj MVD ( 52,2% mod 71,4%,

P

= 0,040, fig. 2C). Alle statistisk signifikante variable evalueret i de univariate analyser blev medtaget i en Cox proportional hazard regressionsmodel. Den multivariate analyse viste, at kun RBP2 havde en selvstændig indflydelse på overlevelsen af ​​patienter med stadie I NSCLC (

P

= 0,044, tabel 2).

2. RBP2 overudtrykkes i humane NSCLC cellelinier

Proteinet niveau RBP2 blev opreguleret i lungekræft cellelinier SK-MES-1, A549, SPCA-1 og H1975 sammenlignet med den humane bronchiale epitelcellelinie BEAS2B (fig. 3A). Ekspressionsniveauet af RBP2 i H1975-celler var højere end i BEAS2B, SK-MES-1, SPCA-1 og A549-celler.

(A) RBP2 overudtrykkes i humane NSCLC cellelinier SK-MES-1 , A549, SPCA-1 og H1975 sammenlignet med de humane bronchiale epitelcellelinie BEAS2B celler. (B) Virkninger af RBP2 siRNA1, RBP2 siRNA2 og pcDNA3-HA-RBP2 på ekspression af RBP2 protein.

To stykker siRNAs og pcDNA3-HA-RBP2 målrettet RBP2 blev ansat for en funktionel analyse i H1975 og SK-MES-1-celler. Som vist i fig. 3B, resultaterne viste, at RBP2-siRNA1 og RBP2-siRNA2 kunne betydeligt nedregulere ekspressionen af ​​RBP2 protein i H1975 celler. Desuden er de to siRNAs viste næsten samme RNAi virkninger, hvorimod den negative kontrol siRNA ikke signifikant påvirker ekspressionen af ​​RBP2. I mellemtiden, pcDNA3-HA-RBP2 markant opreguleret ekspression af RBP2 i SK-MES-1 celler, hvorimod pcDNA3-HA ikke afgørende påvirket RBP2 udtryk. Derfor blev RBP2-siRNA1, RBP2-siRNA2 og pcDNA3-HA-RBP2 udvalgt til yderligere studere funktioner af RBP2 protein in vitro.

3. Udtømning af RBP2 protein falder HUVEC rør dannelse induceret af konditioneret medium

For at evaluere den funktionelle betydning af RBP2 i tumor angiogenese, blev RBP2 slået ned i H1975 cellelinjer. Resultaterne viste, at antallet af hele rør induceret af konditioneret medium af RBP2-siRNA1 H1975 celler (12,33 + 3,06) og RBP2-siRNA2 H1975 celler (9,67 + 1,53) signifikant reduceret sammenlignet med kontrol- siRNA H1975 celler (38,67 2,52, figur 4 A-D,

P

0,01)

Tube dannelse assay:.. (A) kontrol-siRNA H1975 celler; (B) RBP2-siRNA1 H1975 celler; (C) RBP2-siRNA2 H1975 celler. (D) Kvantitativ analyse af røret dannelse ved HUVEC’er induceret af konditioneret medium; (E) Nedregulering af RBP2 protein faldt ekspressionsniveauerne af VEGF i konditioneret medium. (F) Røret induceret af det konditionerede medium af kontrol- siRNA H1975-celler blev blokeret af VEGFR inhibitor (sunitinibmalat 2,5 uM). (G) Den reducerede rør induceret af det konditionerede medium af RBP2-siRNA2 H1975-celler blev reddet ved tilsætning VEGF-165 (2 ng /ml).

4. Nedregulering af RBP2 protein nedsætter ekspressionsniveauerne af VEGF i konditioneret medium

Da høje MVD var forbundet med høj VEGF-ekspression (chi-square test,

P

= 0,001, tabel 1), vi næste udforsket sammenhængen mellem RBP2 og VEGF proteinniveauer i konditioneret medium ved anvendelse af et ELISA-assay. Resultaterne viste, at VEGF-proteinniveauer i de konditionerede medier af RBP2-siRNA1 (0,99 ± 0,11 ng /ml) og RBP2-siRNA2 (0,94 ± 0,14 ng /ml) H1975 celler var signifikant lavere end i kontrolgruppen siRNA H1975 celler (1,87 ± 0,10 ng /ml), (fig 4E,

P

. 0,01). Derudover vores resultater foreslog, at røret induceret af det konditionerede medium af kontrol- siRNA H1975-celler blev blokeret ved tilsætning af en VEGFR inhibitor (sunitinibmalat 2,5 uM, 10.33 + 2,22,

P

. 0,01, figur 4F); den reducerede rør induceret af det konditionerede medium af RBP2-siRNA2 H1975-celler blev reddet ved tilsætning af VEGF-165 (2 ng /ml, 41.03 + 3.25,

P

0,01, figur 4G.).

5. RBP2 stimulerer HIF-1α og VEGF mRNA og proteinekspression

HIF-1α er en vigtig transkriptionel faktor og spiller en afgørende rolle i tumorangiogenese. Desuden transkriptionsfaktoren HIF-1α regulerer ekspressionen niveauet af forskellige hypoxia-responsive gener, herunder VEGF [11]. Derefter undersøgte vi, hvorvidt RBP2 kan påvirke ekspressionen af ​​HIF-1α i ektopiske RBP2-udtrykkende SK-MES-1-celler. Som vist i fig. 5A, den påtvungne ekspression af RBP2 opreguleres ekspressionen af ​​HIF-1α protein i en tidsafhængig måde under normoxiske betingelser, og spidsværdien af ​​HIF-1α ekspression fremkom ved 36 timer efter transfektion blev udført. Imidlertid HIF-1α var ustabil og nedbrydes af proteasomer under normoxi [9], og vores resultater antydede, at HIF-1α ekspression faldt efter transfektion blev udført 48 timer. Derfor, for at undersøge den mulige regulering af tumor angiogenese ved RBP2, undersøgte vi udtryk for transskription faktorer HIF-1α og VEGF i RBP2-overudtrykkende og -depleted NSCLC celler under normoxi på 36 timer efter transfektion. Som vist i fig. 5B og fig. 5C, nedreguleringen af ​​RBP2 i H1975-celler førte til nedsat ekspression af HIF-1α og VEGF, hvorimod ektopisk RBP2 ekspression i SK-MES-1-celler efter pcDNA3-HA-RBP2 førte til opregulering af HIF-1α og VEGF.

(a) RBP2 opreguleret HIF-1α protein i en tidsafhængig måde under normoxiske betingelser. (B) Udtømning af RBP2 faldt ekspressionen af ​​HIF-1α og VEGF i H1975-celler. (C) opregulering af RBP2 øgede ekspression af HIF-1α og VEGF i SK-MES-1-celler. (D) Real-time RT-PCR viste, at mRNA-ekspressionsniveauer af HIF-1α og VEGF blev signifikant reduceret i RBP2-udtømte H1975 celler sammenlignet med kontrolceller. (E) Real-time RT-PCR viste, at mRNA ekspressionsniveauerne af HIF-1α og VEGF blev øget betydeligt i RBP2-overekspression SK-MES-1 celler.

mRNA ekspressionsniveauer af HIF -1α (

P

siRNA1 = 0,006,

P

siRNA2 = 0,001) og VEGF (

P

siRNA1 = 0,000,

P

siRNA2 = 0,000) var signifikant reduceret i RBP2-udtømte H1975 celler. Endvidere HIF-1α (

P

= 0,001) og VEGF (

P

= 0,000) blev forhøjet i RBP2-overudtrykker SK-MES-1-celler sammenlignet med kontrolcellerne (fig. 5D og fig. 5E). Disse resultater antydede, at RBP2 spiller en vigtig rolle i processen med tumorangiogenese gennem opregulering af HIF-1α og VEGF.

6. RBP2 induktion af VEGF er afhængig af HIF-1α

For at bekræfte rolle RBP2 i reguleringen HIF-1α i NSCLC celler, vi moduleret HIF-1α udtryk ved transfektion af celler med et siRNA specifikt mod HIF-1α (si -HIF-1α) og et plasmid pcDNA3-HA-HIF-1α, og evalueret ekspressionen af ​​VEGF efter 36 timer. Som vist i fig. 6A og fig. 6B, knockdown af HIF-1α ekspression i ektopiske RBP2-udtrykkende SK-MES-1-celler førte til nedregulering af VEGF i forhold til scramble uspecifikke kontrol siRNA; opregulering af HIF-1α ekspression i RBP2-udtømte H1975 celler førte til opregulering af VEGF. Disse resultater indikerede, at RBP2-medierede tumorangiogenese af NSCLC-celler delvist kan reguleres via aktivering af HIF-1α.

(A) Udtømning af HIF-1α med et siRNA specifikt mod HIF-1α i RBP2- overudtrykker SK-MES-1-celler førte til nedregulering af VEGF i forhold til scramble ikke-specifik kontrol siRNA. (B) opregulering af HIF-1α udtryk i RBP2-siRNA2 H1975 celler førte til opregulering af VEGF.

7. RBP2 aktiverer HIF-1α via PI3K /Akt signalvejen

En nylig undersøgelse viser, at RBP2 regulerer N-cadherin og snegl gennem aktivering af Akt signalering [18]. Desuden under normoxiske betingelser, kan ekspressionen og aktiviteten af ​​HIF-1α og de efterfølgende udskilte angiogene faktorer i cancer være unormalt opreguleret af forskellige signalveje [34], [35], [36], der indebærer Akt og dens nedstrømseffektorer [20], [22]. Derfor vi hypotese, at RBP2 regulerer HIF-1α gennem aktivering af Akt signalering, og vi yderligere søgt at detektere signalsystemer mekanismer involveret i RBP2-medieret tumor angiogenese. Vores resultater viste, at lukke munden RBP2 udtryk med enten RBP2-siRNA1 eller RBP2-siRNA2 i H1975 celler faldt betydeligt phosphorylering af Akt, mens den tvungne udtryk for RBP2 med pcDNA3-HA-RBP2 i SK-MES-1 celler steg aktiviteten af ​​Akt (fig. 7A). Desuden, når en konstitutivt aktiv form af Akt i RBP2-siRNA2 H1975-celler blev udtrykt, ekspressionen af ​​HIF-1α og VEGF blev forøget i sammenligning med kontrollen; PI3K /Akt inhibitor LY294002 inhiberede signifikant ekspressionen af ​​HIF-1α og VEGF i pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1-celler (fig. 7B). Disse data antyder, at RBP2 fremmer tumorangiogenese gennem aktivering af PI3K /Akt-signalvejen i NSCLC-cellelinier.

(A) Silencing RBP2 ekspression i H1975 celler faldt betydeligt phosphoryleringen af ​​Akt og tvungen ekspression af RBP2 i SK-MES-1-celler forøgede aktiviteten af ​​Akt. (B) Når Akt blev konstitutivt aktiveret i RBP2-siRNA2 H1975, blev ekspressionen af ​​HIF-1α og VEGF øget sammenlignet med kontrollen. PI3K /Akt inhibitor LY294002 inhiberede signifikant ekspressionen af ​​HIF-1α og VEGF i pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1-celler. (C) Westernblots viser tidsforløbet af Akt-phosphorylering i RBP2-siRNA2 H1975 celler som følge VEGF-165 (25 ng /ml). (D) i nærvær af rekombinant human VEGF-165-stimulering, blev aktiveringen af ​​Akt steg i RBP2-siRNA2 H1975-celler og RBP2-overudtrykker SK-MES-1-celler (25 ng /ml, 30 minutter).

VEGF har vist sig at være en potent aktivator af Akt i visse tilfælde [37]. Vi næste udforskes, om VEGF kunne aktivere Akt. Som vist i fig. 7C, behandling af RBP2-siRNA2 H1975-celler med rekombinant human VEGF-165 (25 ng /ml) forøgede aktivering af Akt inden for 15 til 30 minutter. Som vist i fig.