PLoS ONE: Alkylering af Tumor suppressor PTEN Aktiverer Akt og β-Catenin Signaling: En mekanisme Sammenkædning Inflammation og oxidativt stress med Cancer

Abstrakt

PTEN, en phosphoinositid-3-phosphatase, tjener både som en tumorsuppressor og regulator af cellulær anabolske /katabolisk metabolisme. Tilpasning af en redox-sensitive cysteinyl thiol i PTEN for signaltransduktion af hydrogenperoxid kan have overlejret en sårbarhed over for andre mediatorer af oxidativt stress og inflammation, især reaktive carbonylforbindelser, som er almindeligt forekommende biprodukter af arachidonsyre peroxidering. Brug af MCF7 og HEK-293-celler, rapporterer vi, at flere reaktive aldehyder og ketoner, f.eks elektrofil α, p-enals (acrolein, 4-hydroxy-2-nonenal) og α, p-enoner (prostaglandin A

2, Δ12-prostaglandin J

2 og 15-deoxy-Δ-12,14- prostaglandin J

2) kovalent ændre og inaktivere cellulær PTEN, med deraf følgende aktivering af PKB /Akt-kinase; phosphorylering af Akt substrater; øget celleproliferation; og øget nuklear β-catenin signalering. Alkylering af PTEN af α, β-enals /enoner og indblanding i dens tilbageholdenhed af cellulære PKB /Akt signalering kan forstærke hyperplastiske og neoplastiske lidelser forbundet med kronisk inflammation, oxidativt stress, eller ældning

Henvisning:. Covey TM, Edes K, Coombs GS, Virshup DM, Fitzpatrick FA (2010) Alkylering af Tumor suppressor PTEN Aktiverer Akt og β-Catenin Signaling: En mekanisme Sammenkædning Inflammation og oxidativt stress med kræft. PLoS ONE 5 (10): e13545. doi: 10,1371 /journal.pone.0013545

Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: Juli 8, 2010; Accepteret: August 30, 2010; Udgivet 21. oktober, 2010

Copyright: © 2010 Covey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af National Institutes of Health Research Project Grant R01 AI 26.730 (Frank A. Fitzpatrick), forskningsprogram Projekter PA1 CA73992 Projekt 4 (David M. Virshup) og Projekt 5 (Frank A. Fitzpatrick), og Small Grant Program R03 MH082387 -01 (Gary S. Coombs, David M. Virshup og Frank A. Fitzpatrick). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inflammation og kræft er uløseligt forbundet [1], [2]. ‘Smoldering’ inflammation [3], også kaldet para-inflammation [4], forekommer i mange typer af præmaligne og maligne tumorer, f.eks colorektalt adenom og adenocarcinom, hvor indholdet af inflammatoriske leukocytter og inflammatoriske enzymet cyclooxygenase-2 (COX-2) indflydelse progression, prognose og overlevelse [5], [6]. Ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID’er), som inhiberer COX-2 kan forhindre visse, men ikke alle, cancere [7]; og nogle NSAID, såsom sulindac sulfon, handle uafhængigt af COX og prostaglandin E

2 (PGE

2) hæmning [8]. Andre NSAID-præparater, f.eks celecoxib, kan paradoksalt nok forbedre tumor progression i APC

Min /+ mus, hvilken model tarm tumorigenese [9]. Mens COX-2 og dets metabolit PGE

2 er uden tvivl vigtigt, kan para-betændelse forbedre tumorigenese af mekanismer, som er ufuldstændigt forstået. Medfødte immun mekanismer er prime kandidater til undersøgelse.

Normalt medfødte immunforsvar inflammation består af en “såret” fase at tilintetgøre patogener, og en “healing” fase til at reparere og regenerere beskadiget vært væv [10]. Overgangen mellem faserne afhænger gradvis udtømning af inflammatoriske mediatorer og ombygning af visse pro-inflammatoriske mediatorer, f.eks PGD ​​

2, i anti-inflammatoriske metabolitter, Δ12-PGJ

2 [11], [12], [13]. Elementer af selve det betændte sted, f.eks reaktive ilt arter (ROS), albumin, fibroblaster og neutrofiler, orkestrere denne konvertering [14], [15], [16], [17]. For eksempel, reaktive oxygenarter (ROS) forårsage ikke-enzymatisk peroxidation af essentielle fedtsyrer, som arachidonsyre (AA) [18]. AA hydroperoxider omdanne let til reaktive produkter indeholdende et α, β-umættet carbonyl [19], [20] at optage acrolein (2-propenal) [21], [22], 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) [23], og cyclopentenon prostaglandiner (cyPGs), PGA

2 og Δ12-PGJ

2 [24]. Kovalent modifikation af NFKB og IKKα /p proteiner ved disse a, ß-umættede carbonylgrupper metabolitter (dvs. protein alkyleringsprocesser) synes at være en “switch” til at afslutte inflammation [25]. Efter denne præcedens, vi hypotese, at alkylering også kan fungere som en “switch” at indlede reparation og regenerering af væv beskadiget af inflammation.

PTEN (fosfatase tensin homolog på kromosom 10) er en phosphoinositid-3-phosphatase med to fysiologiske roller: tumor suppressor og regulator af anabolske /katabolisk cellesignalering.

PTEN

gen ofte muteret eller inaktiveret i fremskredne kræftformer [26]. Brug MCF7 og HEK-293 celler, rapporterer vi, at reaktiv α, ß-umættede carbonyler (acrolein, 4-HNE, og Δ12-PGJ

2) inaktivere PTEN protein – ikke genet – ved alkylering. Inaktivering af PTEN med a, ß-umættede carbonyler fører til øget Akt signalering, forbedret nuklear β-catenin signalering, og augmented cellulær proliferation. Redox signalering ved PTEN kan have udviklet sig til at aktivere celler (tissue) at stratificere deres reaktion på oxidativ stress. For eksempel, forbigående hæmning af PTEN ved reaktiv oxygen eller carbonylforbindelser, og den tilsvarende signalering gennem Akt /GSK3p /β-catenin /TCF4 /LEF1 kunne drage værten via øget spredning og regenerering af væv ødelagt ved akut inflammation eller oxidativt stress. Vildfaren og vedvarende PTEN inaktivering ved den samme molekylære mekanisme kan begunstige tumorprogression og give en ætiologisk forbindelse mellem “ulmende” inflammation og visse kræftformer, især colorectal cancer, hvor både PTEN og APC tumorsuppressorer begrænse nukleare β-catenin signalering [27] .

Resultater

Det α, ß-umættede carbonyler acrolein, 4-HNE og Δ12-PGJ

2 kovalent rediger cellulære PTEN

Vi udsatte MCF-7 celler til repræsentative α, ß-umættet carbonyl (figur 1C) eller H

2O

2, derefter selektivt mærkede nogen proteiner, der havde oxiderede eller carbonylerede thioler under anvendelse NEM-biotin (figur 1A). Vi derefter afsondret proteiner med en biotin epitop på NEUTRAVIDIN (NA) perler og identificeret carbonyleres PTEN ved SDS-PAGE og immunoblotting. MCF-7-celler behandlet med 10 pM Δ12-PGJ

2, 4-HNE eller acrolein indeholdt carbonyleres PTEN i mængder sammenlignelige med celler behandlet med 100 pM H

2O

2 (figur 1A, NA pulldown) . Denne metode skelner ikke mellem oxiderede og carbonyleres thioler på PTEN. Men elektroforese under ikke-reducerende betingelser, efterfulgt af western blotting, viste, at PTEN vandrede som en diskret isoform grundet en oxideret disulfid [28], [29], som kun forekom i celler behandlet med 100 pM H

2O

2, men ikke i celler behandlet med α, ß-umættet carbonyl (Δ12-PGJ

2, 4-HNE, acrolein) eller 15-HPETE, en lipidhydroperoxid (figur 1B).

(A) Diagram af proceduren for at identificere PTEN med en oxideret eller alkylerede thiol i celler udsat for ROS eller α, ß-umættede carbonyler. Den anti-PTEN immunoblot viser oxideret eller carbonylerede PTEN (NA Pulldown) i forhold til den samlede PTEN (cellelysat) isoleret fra MCF-7-celler behandlet i 30 minutter med vehikel (DMSO), 10 uM Δ12-PGJ

2 eller 4-HNE versus 10 min med 100 uM H

2O

2; et immunoblot fra et separat eksperiment viser oxideret, carbonyleres og total PTEN i celler behandlet i 30 min med vehikel eller 20 pM acrolein versus 10 min med 100 uM H

2O

2. (B) Anti-PTEN immunoblot af MCF-7 cellelysater fraktioneret ved SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser. PTEN oxideret til en Cys

124-Cys

71 disulfid vises som en hurtigere migrerende arter (PTEN oxideret disulfid) kun i celler behandlet med H

2O

2. Denne art var ikke målbart i MCF-7cells behandlet 30 min med DMSO køretøj eller 20 pM hver Δ12-PGJ

2, 4-HNE, acrolein eller 15-HPETE. (C) Kemiske strukturer af typiske α, ß-umættede carbonylgrupper. Acrolein og 4-HNE er a, p enals; Δ12PGJ

2 er en α, β enon. Elektrofile p carbonatomer er betegnet med δ

+. Blots er repræsentative for resultater opnået i mindst tre uafhængige forsøg.

Cyclopenteneone PG-biotin analoger er model a, Ø-enoner der alkylere PTEN

cysteinyl thiolat i PTEN aktiv websted (-HC (X

5) RT-) er tilbøjelig til oxidation, fordi det er en stærk nukleofil, pKa -5. Denne egenskab bør også lette alkylering af PTEN ved α, ß-umættede carbonyler. Vi anvendte CyPG-biotin-analoger, som har en elektrofil β-carbon stand til nukleofil addition (Michael-reaktion), som kemiske modeller til at teste denne hypotese [30]. Alkylering af eventuelle cellulære proteiner ved disse analoger ville indføre et biotin epitop

de novo

(figur 2A). PGA

1-biotin og Δ12 PGJ

2-biotin blev begge taget op i MCF-7-celler og dannede kovalente addukter med -20-proteiner (figur 2B). Δ12 PGJ

2-biotin (en bi-funktionel dienon) var mere reaktiv end PGA

1-biotin (mono-funktionelle enon), enig med andre, der rapporterede ~20-30 protein mål modificeret af cyPG-biotin i 3T3 celler eller mitokondrier [31], [32]. Beslaglæggelse af

de novo

biotinylerede cellulære proteiner på NA perler, efterfulgt af immunoblot med anti-PTEN antistoffer, viste, at PTEN dannet et kovalent addukt -10 gange mere let med Δ12-PGJ

2-biotin end med PGA

1biotin (figur 2C, bane 4 vs bane 3).

(a) Michael-additionsreaktion mellem PTEN og en Δ12-PGJ

2-biotin-analog. Efter behandling af celler med cyPG-biotin blev proteiner med en

de novo

biotin epitop sekvestreret på neutravidin perler (NA pulldown), derefter fraktioneret ved SDS-PAGE for immunblotting. (B) Anti-biotin immunoblot af proteiner fra lysater af MCF-7-celler behandlet med DMSO (bane 1), 10 uM PGA

1-biotin (bane 2), og 10 uM Δ12PGJ

2-biotin (bane 3). Δ12-PGJ

2 biotin dannes en kovalent addukt med proteiner lettere end PGA

1-biotin (pilespidser). (C) Anti-PTEN immunoblot af cellulær PTEN som dannede en kovalent addukt med cyPG-biotin (NA Pulldown) i forhold til den samlede PTEN (cellelysat) fra MCF-7-celler behandlet med DMSO (bane 1), 1 eller 10 uM PGA

1-biotin (bane 2, 3), og 1 eller 10 uM PGJ

2-biotin (bane 4, 5). Blots er repræsentative for resultater opnået i mindst tre uafhængige forsøg.

Den α, ß-enon, Δ12-PGJ

2, forstyrrer PTEN undertrykkelse af Akt-kinase

vækstfaktorer, insulin og andre stimuli prompt PI3-K at gøre PIP

3, som rekrutterer PKB /Akt-kinase til cellemembranen hvor PDK1 /2 phosphorylerer Akt Thr

308 og Akt Ser

473 rester, henholdsvis [33], [34], [35]. PTEN nedregulerer PKB /Akt aktivering ved metaboliske PIP

3 til PIP

2 [36]. α, kan ß-umættede carbonyler at alkylere cellulære PTEN forstyrrer undertrykkelse af Akt kinase. En repræsentativ α, ß-enon, Δ12-PGJ

2, forårsagede en koncentration og tidsafhængig stigning i phospho- (T

308) Akt i MCF-7 celler. Så lidt som ca. 2 uM Δ12-PGJ

2 forårsagede en halv-maksimal respons (figur 3A). Stigninger i cellulær phospho- (T

308) Akt var påviselige ved 10 min, maksimal ved 30 minutter og holdbare i 120 min (figur 3B). Δ12-PGJ

2 øget dannelse af phospho- (T

308) Akt uden at ændre dannelsen af ​​phospho- (S

241) PDK1 (den kinase, der phosphorylerer T

308 Akt), og uden ændring PTEN-proteinekspression (figur 3C). Disse data antyder, at Δ12-PGJ

2 forstyrret PTEN evne til at begrænse aktivering af Akt kinase. I overensstemmelse med denne fortolkning, co-behandling af celler med cyPGs plus 50 pM LY294002, sænkede niveauer af phospho- (T

308) Akt ved at hæmme PI3-K, i spidsen af ​​PI3-K /→ PDK1 /2 → akt kinase kaskade (figur 3C, bane 3 vs 2 og 6 vs. 5). Endvidere 1 uM af forskellige PGA og PGJ isomerer, og andre α, ß-enoner direkte inhiberede isoleret PTEN enzym [Tabel 1]. Den elektrofile β kulstof af cyPGs er afgørende for hæmning, da et strukturelt ligner, men ikke-elektrofil cyPG, PGB

1, var inaktiv.

(A) Immunoblots af phospho- (T

308 ) Akt forhold til den samlede Akt i lysater fra MCF-7-celler behandlet i 30 minutter med 0-20 uM Δ12-PGJ

2. Søjlediagrammet viser stigningen i phospho- (T

308) Akt /total Akt (gennemsnit ± sem) fra n≥3 separate eksperimenter. (B) Immunoblot af phospho- (T

308) Akt forhold til den samlede Akt i lysater fra MCF-7-celler behandlet med 20 pM Δ12-PGJ

2 for 0-120 min. Søjlediagrammet viser stigningen i phospho- (T

308) Akt /total Akt (gennemsnit ± sem) fra n = 4 separate eksperimenter. (C) immunoblotter af total Akt, phospho- (T

308) Akt, PTEN, phospho- (S

241) PDK1 fra lysater af MCF-7-celler behandlet i 30 minutter med 20 uM Δ12-PGJ

2 (bane 2, 3) og 20 uM PGA

1 (bane 5, 6) i nærvær af PI3-K-inhibitor 50 uM LY294002 (bane 3, 6) eller DMSO-vehikel (bane 2, 5). (D) Immunoblot af phospho- (T

308) Akt forhold til den samlede Akt i lysater fra MCF-7-celler behandlet 4 timer med bærer, de cyclopentenones – PGJ

2, Δ12-PGJ

2, og 15-deoxy-Δ12-PGJ

2 eller deres forløber PGD

2. Til (C) og (D), klatter er repræsentative for resultater opnået i tre uafhængige forsøg.

Struktur-aktivitet viste, at forskellige J-serien cyPGs, herunder PGJ

2 , Δ12 PGJ

2 og 15-deoxy- Δ12, 14-PGJ

2, forhøjet phospho- (T

308) Akt i MCF-7 celler, i forhold til køretøjet eller deres forløber PGD

2 (figur 3D). PGA

1 havde en beskeden effekt på cellulær Akt phosphorylering (figur 3C, bane 5), som svarer til dens svagere covalent modifikation af cellulært PTEN (figur 2C, bane 3).

Aktiveret phospho- (T

308 /S

473) Akt-kinase kan phosphorylere forskellige proteinsubstrater, som regulerer celleproliferation og skæbne [35]. Phosphorylering af Akt substrater med en RxRxx-phospho-S /T-epitop, faldt sammen med øget phospho- (T

308) Akt i MCF-7 celler blev behandlet med 10 pM Δ12-PGJ

2 (figur 4A). Akt kinase aktivering faldt også sammen med Akt-afhængig proliferation i MCF-7-celler behandlet med 1-10 uM Δ12-PGJ

2 (figur 4B). Dette fund er i overensstemmelse med rapporterede tofasede handlinger cyPGs, hvorved de øger spredningen af ​​dyrkede celler på ~ 1 uM [37], [38], mens de nedbringer proliferation eller forårsage apoptose ved at ændre andre protein mål på -50 uM [39 ].

(A) Immunoblots af phospho- (T

308) Akt, total Akt, og flere phosphoproteiner med (K /R) X- (K /R) -XX- (S /T), et motiv genkendes og phosphoryleres af aktiv phospho- (T

308) Akt, i lysater fra MCF-7-celler behandlet 0 og 10 uM Δ12-PGJ

2. (B) Relativ proliferation af MCF-7-celler (gennemsnit ± sem, n = 4) behandlet med 0, 1, og 10 uM Δ12-PGJ

2 alene (▪), eller i nærvær af 10 uM inhibitor IV (▪), en Akt kinase inhibitor. (C) Immunoblots af phospho- (S

473) Akt, total Akt; phospho (S

9) GSK3p, alt GSK3p; og β-catenin og tubulin i lysater fra HEK 293-celler efter behandling for 0,1, 3, 6 og 16 timer med 6 uM Δ12PGJ

2, 6 pM 4-HNE eller 20 uM acrolein. For (A) og (C), blots er repræsentative for resultater opnået i tre uafhængige forsøg.

α, ß-umættede carbonyler forårsage en tidsafhængig akkumulering af cellulær phospho- (S

473) Akt kinase (aktiv) → phospho- (S

9) GSK3p (inaktiv) → β-catenin og en stigning i den nukleare β-catenin signalering

GSK3p konverterer β-catenin at phospho- (S

33/37 /T

41) β-catenin, som hurtigt elimineres ved 26S proteasomet [40]. GSK3p handler i koncert med tumor suppressor APC. I celler med mutant APC, eller når Wnt-ligander stimulerer celler med vildtype APC, GSK3p ikke phosphorylere β-catenin, som gør det muligt at akkumulere, associeret med andre nukleare transkriptionsfaktorer og give udtryk for sine målgener (fx

c-myc

,

cyklin D1

) [41]. PTEN kan blokere β-catenin akkumulering /signalering ved at begunstige retention af aktive GSK3p og inaktive PKB /Akt kinase i ca. [42], [43], men ikke alle eksperimentelle systemer [44], [45]. Derfor bør inaktiveret PTEN forøge β-catenin signalering ved at begunstige tilbageholdelse af inaktive phospho- (S

9) GSK3p og aktiv phospho- (S

473) Akt kinase. Vi hypotese således at disse elektrofile mediatorer kan påvirke ß-Catenin signalering gennem denne mekanisme. For at undersøge dette nærmere, anvendte vi HEK 293 celler, som har en intakt ß-Catenin signalvejen. Vi fandt, at de forskellige a, ß-umættede carbonyler at alkylerede PTEN (6 uM Δ12 PGJ

2, 6 uM 4-HNE og 20 uM acrolein) alle forårsagede en tidsafhængig stigning i phospho- (S

473 ) Akt (dvs. aktiv Akt kinase), med en tilsvarende stigning i phospho- (S

9) GSK3p (dvs. inaktiv GSK3p) og β-catenin (figur 4C). At afgøre, om a, P-umættede carbonyler forbedre den nukleare β-catenin signalering, vi brugte HEK 293 celler konstrueret til stabilt at udtrykke Wnt3a og SuperTopFlash (STF) reportergen [46]. Disse celler, kaldet STF3A celler, således hemmelige Wnt3a, en autokrin /parakrin stimulus for FZD receptorer, der forsinker APC-afhængig nedbrydning af β-catenin (figur 5A). Nuklear β-catenin signalering i STF3A celler er proportional med deres luciferaseekspression (aktivitet), og de reagerer på DKK1, en WNT antagonist der inhiberede β-catenin signalering i STF3A celler i en koncentrationsafhængig måde (figur 5B).

(a) STF3A celler huser en stabilt integreret transgen som udtrykker Wnt3a (). Når udskilles, Wnt3a fremkalder autokrin /parakrin stimulering af FZL receptorer (), som inhiberer APC-afhængig omsætning af β-catenin (). Hvis β-catenin ikke phosphoryleres af GSK3p, kan det ophobes som en β-catenin: LEF dimer () og binder til promotorer på stabilt integreret β-catenin: luciferasereportergen (SuperTop Flash) (). Luciferaseaktivitet i cellelysater er proportional med nuklear β-catenin signalering. (B) Nuclear β-catenin signalering (luciferase luminescens) i STF3A celler (2 x 10

4 celler /brønd) dyrkes i 24 timer i medium indeholdende 0, 10 eller 30 ng /ml DKK1 (gennemsnit + SD, n = 3). DKK1, en wnt antagonist, inhiberede β-catenin signalering (C) Nuclear β-catenin signalering i STF3A celler (2 x 10

4 celler /brønd) dyrkes i 24 timer i medium indeholdende 20 uM cyPGs; α, β-enals eller primære PG’er. Adskillige reaktive elektrofiler forbedret β-catenin signalering ved ~2-4 fold. Histogram repræsenterer middelværdien + SEM, n = 4.

Adskillige reative carbonylgrupper metabolitter, hver med et elektrofilt α, β enon eller enal substituent, forøget ekspression af β-catenin: luciferasereportergen i STF3A celler (figur 5C). Luciferase reporter aktivitet steg med -4 gange over baseline (p 0,01) i STF3A celler inkuberet med Δ12 PGJ

2 eller 4-HNE; ved -3-fold (p 0,01) i celler med andre PGJ analoger, acrolein eller 4-on; og ved ~1.5 gange (p 0,05) i celler med PGA

2. I overensstemmelse med vores mekanistiske hypotese, hverken PGB

2 eller MDA havde en påviselig effekt. PGB

2 er et cyPG, men tautomeri forhindrer ladningen udflytning kræves for at skabe en elektrofil β carbon, som er nødvendig for protein alkylering. MDA (β-hydroxy-acrolein) gennemtrænger cellemembraner dårligt, fordi det er 99% ioniseret ved fysiologisk pH ~7.4 anvendt i vores eksperimenter. Hverken PGE

2 eller andre primære PG metabolitter af COX-1 eller -2 haft nogen effekt på nuklear β-catenin signalering i STF3A celler. Vi gør opmærksom på, at ektopisk overekspression af EP-receptorer i HEK 293 celler nødvendige for at fremkalde nogen PGE

2 medieret β-catenin signalering [47]. Den svage reaktion på PGE

2 og andre PG er i figur 5C kan afspejle de konstitutive niveauer af EP, FP, DP eller IP-receptorer i STF3A celler eller hurtig metabolisme af PG’er eller begge.

Forbedret β- catenin signalering i STF3A celler var koncentrationsafhængig mellem 2-20 uM for acrolein, 4-HNE og Δ12 PGJ

2 (figur 6A). Udtømning af cellulær GSH til -10% af baseline ved behandling med 100 pM BSO potenseret β-catenin signalering, f.eks i STF3A celler behandlet med 2 og 6 uM Δ12 PGJ

2 (figur 6B). Dette stemmer overens med den rolle, reduceret glutathion i konjugeringen af ​​reaktive metabolitter, og beskyttelse af redox følsomme proteiner fra alkylering [20].

(A) Nuclear β-catenin signalering (luciferase luminescens) i STF3A celler ( 2 × 10

4 celler /brønd) dyrkes i 24 timer i medium indeholdende 0, 2, 6 og 20 pM hver af acrolein (□), Δ12 PGJ

2 (▪) og 4-HNE (▪). (B) Nuclear β-catenin signalering i STF3A celler (2 x 10

4 celler /brønd) dyrkes i 24 timer i medium indeholdende 0, 2 eller 6 uM Δ12 PGJ

2 alene (▪) eller Δ12 PGJ

2 plus 100 uM BSO. GSH-indholdet faldt med 79% og 88% efter 6 og 24 timer efter behandling af celler med BSO; 92-95% af cellerne stadig var levedygtige ved 24 timer. Barer repræsenterer middelværdien ± SEM fra n≥3 separate eksperimenter.

Diskussion

PTEN

tumorsuppressorgen ofte muteret eller inaktiveret i fremskredne kræftformer [26 ], [48]. PTEN er en phosphoinositid-3-phosphatase, der metabolizes PIP

3 til PIP

2 [36], og dermed tæller-regulerende PKB /Akt, en serin /threonin kinase proto-onkogen, der styrer anabolske vækst og specifikation af celle skæbne [33], [34], [35]. PTEN, selv, reguleres posttranslationelt ved phosphorylering [49], acetylering [50], og reversibel oxidation af dens katalytiske cystein

124 rest [28], [29]. Oxidation af cellulære PTEN kan involvere H

2O

2 afledt af NADPH-oxidase [51], superoxiddismutase [52], eller enzymatisk peroxidation af arachidonsyre (AA) ved COX-1, COX-2 eller 5-LOX [53]. Alle disse enzymer er almindeligt overudtrykt og aktiveres af inflammation eller neoplastisk transformation. PTEN oxidation, og enhver ledsagende patofysiologi, varierer med graden af ​​cellulær eksponering for reaktive oxygenarter (ROS). I disse undersøgelser vi vise, at kemi, der letter oxidation af PTEN også kan lette alkylering ved elektrofil α, ß-enals og α, Ø-enoner [19], [20].

PTEN indbegrebet tilpasningen af redox-responsive thioler til cellesignalering, samt deres sårbarhed over for biprodukter fra oxidativt stress og inflammation. PTEN inaktiveres af to markante redox-medierede processer: 1) intra- eller inter-molekylære disulfiddannelse af ROS og 2) thiolat carbonylering (Michael tilføjelse) ved elektrofil α, ß-umættede carbonyler (Figur 1-3). Hydrogenperoxid (H

2O

2), en prototypisk ROS, hæmmer cellulær PTEN ved direkte oxiderende katalytisk Cys

124 til en sulfensyre mellemliggende, som derefter danner en inaktiv, intra-molekylær Cys

124-71 disulfid [28], [29]. Vores data viser, at adskillige repræsentant, elektrofile carbonylforbindelser (α, ß-enals og α, ß-enoner), som kan forekomme endogent som biprodukter af lipidperoxidation under inflammation eller oxidativt stress, alkylat og inaktiverer PTEN. Inaktivering af PTEN ved redox-medierede processer forårsager en stigning i aktivitet af protoonkogen Akt. Hyperaktivering af Akt øger spredning og overlevelse af mange forskellige kræftformer.

Signalering af H

2O

2 indgår en bred patofysiologisk kontinuum [54] og en sammenlignelig rolle for reaktive elektrofile virker plausibelt. Reaktive carbonyl arter såsom acrolein, 4-HNE og Δ12PGJ

2 repræsenterer en undergruppe af elektrofiler almindeligt produceret under oxidativ stress og inflammation. Disse fund kan ekstrapolere til elektrofile agenter mangler en carbonyl men indeholder andre elektron tiltrækkende grupper, og vi henviser til dem generelt som “reaktive elektrofile”. Først ligesom H

2O

2, opstår reaktive elektrofile

in vivo

under inflammation og oxidativt stress [16], [18], [19], [22]. For det andet, reaktive elektrofiler covalent modulere andre proteiner, der regulerer vigtige signaleringsprocesser; dvs. LKB1 /STK11 [55], NFKB [56], og IKKβ. For det tredje, H

2O

2 og reaktive elektrofiler begge stammer fra en kombination af spontane og enzymatiske processer, som ofte falder sammen i betændte væv [57]. H

2O

2 stammer fra superoxid anion, O

2

-, den primære metabolit af NADPH oxidaser. Spontan og enzymatisk dismutation konverterer O

2

– i H

2O

2. Ligeledes spontan og enzymatisk lipidperoxidation genererer acrolein og 4-HNE [18], [57]. cyPGs stammer fra lipid endoperoxid PGH

2, den primære metabolit af COX-1 og -2. Enzymatisk og spontan opdeling af endoperoxid obligationer konverterer PGH

2 ind PGE

2 og PGD

2; albumin /serum derefter forårsager deres dehydrering i PGA

2, PGJ

2, og isomere [14], [16], [24].

Mens spekulative, fremgår det, at ROS og reaktiv elektrofile (H

2O

2, acrolein, 4-HNE, Δ12 PGJ

2) kan have begge udviklet sig til at spille forskellige roller i medfødte immunitet: 1) udslette patogener og 2) at løse inflammation. Analogt til inaktivering af NFKB og IKKαβ, midlertidig inaktivering af PTEN tumor suppressor protein ved sin alkylering, og ledsagende aktivering af PKB /Akt-kinase proto-onkogener, kan bidrage til at normalisere morfologi og histologi ved akut betændte væv ved at slippe deres begrænsning af celleproliferation, anabolske vækst og skæbne specifikation [34], [35]. I almindelige situationer reparation og opløsning skal hjælpe opsige medfødte immunforsvar inflammation (figur 7,). Dog kan denne mekanisme også give uundgåelige risici, hvis PTEN blev inaktiveret errantly eller vedvarende. Desuden reaktive elektrofiler inaktivere også andre bemærkelsesværdige tumorsuppressorer, herunder p53 [30] og LKB1 /STK11 [55]. Dette kombineret og vedvarende inaktivering af tumorsuppressorer kan bidrage væsentligt til inflammation-associerede tumorigenese og efterfølgende forlænge cyklus af tumorassocierede para-inflammation (figur 7,). Samlet set vores data og model passer med den observation, at tumorer er sår, der ikke heles [58]. I denne situation kan tumor progression udlede dels fra dårlig tilpasning af en molekylær mekanisme, der udviklede sig til at opsige og løse medfødte immunforsvar inflammation.

Inflammation er et afgørende element i tumor progression. Mange kræftformer skyldes steder med infektion, kronisk irritation og inflammation. Tumormikromiljøet, som består hovedsagelig af inflammatoriske celler, spiller en stor rolle i den neoplastiske proces, fremme proliferation, overlevelse og migration. Vi viser her, at reaktive carbonylforbindelser, der almindeligvis produceres under inflammation covalent ændre og inaktivere PTEN tumorsuppressor. Vigtigt er det, kan den mekanisme, vi beskriver også ekstrapolere til: 1) andre elektrofile arter genereret af inflammation, oxidativt eller miljøfremmede stress (dvs. andre α, ß umættede aldehyder og ketoner, allyliske eller vinyl epoxider, quinoner, chlorhydrins, chloramines, vinyl sulfoner, og 2) andre medlemmer af PTP-superfamilien, der er redox følsomme. Disse undersøgelser udvide vores forståelse af de mekanismer, som betændelse bidrager til initiering og progression af cancer.

Materialer og metoder

Materialer

Vi brugte minimum essential medium (MEM) , kosttilskud, bovint insulin, gentamicin, humane embryoniske nyre HEK-293-celler, og HEK-293-celler indeholdende Epstein Barr virus nukleært antigen 1-genet (HEK-EBNA1) (Invitrogen, Carlsbad, CA); MCF-7-celler (HTB-22, American Type Culture Collection, Manassas, VA); PG, cyPG-biotin analoger og WST spredning assay kits (# 10.008.883) (Cayman Chemical; Ann Arbor, MI); Komplet ™ proteaseinhibitor-blanding (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN); lysepuffer 0,6% Igepal CA-630 i PBS (Promega, Madison, WI); NEUTRAVIDIN konjugerede perler, NEM-biotin og geder anti-biotin polyklonale antistoffer (# 31.852) (Pierce Chemical, Rockford, IL); en PI3-K-inhibitor, LY294002 (# 9901), polyklonale antistoffer mod PTEN (# 9552), Akt (# 9271), phospho- (Thr

308) Akt (# 9375), phospho- (S

473 ) Akt (# 9271), phospho- (S

9) GSK3p (# 9336), GSK-3β (# 9332), phospho- (Ser

33/37 /Thr

41) β catenin ( # 9561S) K /RxK /RxxS /T (PO

4) epitoper (# 9614) og phospho- (S

241) PDK1 (# 3061) (cellesignalering Technologies, Danvers, MA); β-catenin (# C19220) (BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ); HRP (peberrodperoxidase) konjugerede sekundære antistoffer (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA); polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner og Western Lightning ™ kemiluminescens reagenser (Perkin-Elmer, Waltham, MA); PTEN enzym assay kits (# 17-351) (Upstate Bioteknologi, Lake Placid, NY); Akt inhibitor IV (# 124.011) (Calbiochem, San Diego, CA); acrolein (# 01.680), crotonaldehyd (# 262.668), L-buthionine-sulfoximin (BSO) (B2515), H

2O

2 30% opløsning (H-1009), malondialdehyd (Fluka Cat. # 63287) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); DKK-1 (# 1096-DK-010) (R celler blev frosset ved -80 ° C i 15 minutter; overført til vakuum og inkuberet 1 time, 25 ° C med 1 ml O

2-fri ekstraktionsbuffer (50 mM NaHPO

4, pH 7,0, 1 mM EDTA, 10 mM NEM [N-ethylmaleimid], 10 mM IAA [iodeddikesyre], 1% Triton X-100, 5 mM NaF, 50 ug /ml leupeptin og 50 pg /ml aprotinin). Denne behandling selektivt alkylerer alle reducerede thioler i PTEN, men ikke oxiderede thioler eller thioler modificeret ved Michael-addition med reaktive elektrofiler. Prøver blev vasket i 1 ml O

2-fri ekstraktionsbuffer derefter overført til en 15 ml konisk rør. Efter tilsætning SDS til en slutkoncentration på 1% v /v, blev blandingen holdt 2 timer ved 25 ° C i mørke, og proteinerne blev udfældet med TCA [trichloreddikesyre], 10% v /v i 1 time.