PLoS ONE: M-HIFU Hæmmer tumorvækst, Undertrykker STAT3 Aktivitet og Forbedrer Tumor specifik immunitet i en transplantation Tumor Model af prostata Cancer

Abstrakt

Målsætning

I denne undersøgelse har vi udforsket brug af mekanisk høj intensitet fokuseret ultralyd (M-HIFU) som en neo-adjuverende behandling inden kirurgisk resektion af den primære tumor. Vi undersøgte også den rolle signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) i M-HIFU fremkaldte anti-tumor immunrespons ved hjælp af en transplantation tumor model af prostatakræft.

Metoder

RM- 9, en mus prostatacancer-cellelinie med konstitutivt aktiveret STAT3, blev inokuleret subkutant i C57BL /6J-mus. De tumorbærende mus (med en maksimal tumor diameter på 5~6 mm) blev behandlet ved M-HIFU eller sham eksponering to dage før kirurgisk resektion af den primære tumor. Efter nyttiggørelse, hvis ingen tumor tilbagefald blev observeret i 30 dage, blev tumor fornyet behandling udført. Væksten i genoptage behandlingen tumor, overlevelsesrate og anti-tumor immunrespons af dyret blev evalueret.

Resultater

Ingen tumor tilbagefald og fjernmetastaser blev observeret i begge behandlingsgrupper anvender M-HIFU + kirurgi og kirurgi alene. Men sammenlignet med kirurgi alene, blev M-HIFU kombineret med kirurgi fundet, signifikant at hæmme væksten af ​​genoptage behandlingen tumorer, nedregulere intratumoral STAT3 aktiviteter, øge cytotoksiske T-celler i milt og tumor drænende lymfeknuder (TDLNs), og forbedre værten overlevelse. Endvidere blev M-HIFU kombineret med kirurgi fundet til sænke niveauet af immunosuppression med samtidig øget antal og aktiviteter af dendritiske celler, sammenlignet med kirurgi alene.

Konklusion

Vores resultater viser, at M -HIFU kan hæmme STAT3 aktiviteter, og når de kombineres synergistisk med kirurgi, kan tilvejebringe et nyt og lovende strategi til behandling af prostatakræft

Henvisning:. Huang X, Yuan F, Liang M, Lo HW, Shinohara ML , Robertson C, et al. (2012) M-HIFU Hæmmer tumorvækst, Undertrykker STAT3 Aktivitet og Forbedrer Tumor specifik immunitet i en transplantation Tumor Model af prostatakræft. PLoS ONE 7 (7): e41632. doi: 10,1371 /journal.pone.0041632

Redaktør: Mitsunobu R. Kano, University of Tokyo, Japan

Modtaget: 24. februar, 2012; Accepteret: 22 Juni 2012; Udgivet: 24 juli 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health gennem tilskud #: 5R21CA135221-02 (https://www.nih.gov/), af en prostatakræft Pre-SPORE bevilling fra Duke Comprehensive Cancer center, af en bevilling fra DoD ( PC100266), af en bevilling fra den bekymring Foundation, og ved en bevilling fra Morris Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige kræftform hos mænd med omkring 230.000 sager diagnosticeres årligt i USA [1] Stater. Blandt forskellige behandlingsmetoder strategier, der anvendes klinisk, prostectomy fortsat den første helbredende mulighed for patienter med prostatacancer [2], [3]. Kirurgi er imidlertid ikke egnet til behandling af fjerne metastaser og er således ofte anvendes i forening med stråling og /eller kemoterapi i patienter med fremskredne prostatakræft. Mens stråling og kemoterapi efter operationen er ofte nyttigt, kan de ikke være gældende for alle patienter, afhængigt af kræft scene og patientens tolerance. Desuden er tilstedeværelsen af ​​blod-prostata-barrieren hindrer levering af kemoterapeutiske midler til prostatacancerceller [4]. Hvad vigtigere er, den lave specificitet af stråling og kemoterapi i at målrette kræftceller ofte føre til væsentlige bivirkninger. Derfor er det meget ønskeligt at kombinere operation med en lokalt målrettet terapi, såsom høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU, også kendt som høj intensitet terapeutisk ultralyd, hitu), som tåles godt af patienter, for at udrydde den primære tumor samtidig give den ekstra fordel i at undertrykke tumor tilbagefald og fjernmetastase.

i det seneste årti, HIFU har vist sig som en lovende non-invasiv behandling modalitet for lokaliserede godartede og ondartede faste tumorer [5]. Omfattende dyr og kliniske undersøgelser har vist, at HIFU er velegnet til termisk ablation af lokaliserede tidlige fase tumorer, bjærgning behandling efter fiasko forudgående behandling med stråling eller kemoterapi [6] – [8]. Ved at fokusere en høj intensitet ultralyd stråle på en veldefineret region inde i en patient, kan den konvergerende akustiske energi absorberes af målet tumorvæv, hvilket resulterer i en hurtig temperaturforøgelse over 65 ° C i et par sekunder, hvilket fører til koagulerede cellenekrose [9] – [11]. Desuden, når HIFU anvendes i en pulserende modus med lav arbejdscyklus ( 2%) gennem en proces kendt som mekanisk HIFU (M-HIFU), kan det producere ikke-termisk, mekanisk beskadigelse af tumorvævet gennem akustisk kavitation [ ,,,0],12]. Disse egenskaber gør HIFU en ifølge sagens natur ikke-invasive, ikke-ioniserende terapi, der generelt tolereres godt af patienterne. I modsætning stråling og kemoterapi, kan HIFU behandling administreres gentagne gange uden at øge risikoen for systemisk toksicitet [5].

Ud over termisk ablation af tumorvæv, HIFU har vist sig at udløse en anti-tumor immunrespons både i mus, der bærer neuroblastom [9] og hos patienter med sene solide tumorer [13]. Det er blevet foreslået, at HIFU-ablateret tumor debris og resterende tumor-associerede antigener kan stimulere dendritiske celler (DC’er) og efterfølgende T-celle-aktivering, fører til udvikling af anti-tumor immunrespons [14], [15]. Denne hypotese understøttes af flere kliniske undersøgelser, der viser øget lymfocyt cytotoksicitet, forbedret overlevelse, og reduceret tumor tilbagefald og fjernmetastaser [16].

Sammenlignet med konventionel HIFU, der bygger primært på termisk ablation, vi har vist tidligere, at M-HIFU kan fremkalde stærkere frigivelse af endogene faresignaler [17], forbedre DC og cytotoksisk T-lymfocyt (CTL) aktiviteter [12] med reduceret fjernmetastaser [18]. Trods disse opmuntrende bemærkninger, den samlede immunrespons anti-tumor fremkaldt af HIFU er stadig utilstrækkelig, formodentlig på grund af immuntolerance udviklet under tumorigenese [19], i hvilket signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) er blevet vist at spille en kritisk rolle [20] – [22]. STAT3 vides at blive aktiveret af immunosuppressive cytokiner, såsom IL-10, hvilket igen kan yderligere forbedre ekspression af IL-10. Desuden aktiveret STAT3 (p-STAT3 /Y705) inhiberer ekspressionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, såsom IL-12 [23] og inducerer ekspressionen af ​​Foxp3, en væsentlig transkriptionsfaktor for regulatoriske T-celler (Treg) udvikling [24] . Selv STAT3 er blevet vist at spille en afgørende rolle i tumorigenese og i immuntolerance, dens rolle i M-HIFU fremkaldte anti-tumorale responser er ikke blevet undersøgt.

I denne undersøgelse vi udforsket strategien med M -HIFU som en neo-adjuverende behandling før kirurgisk resektion af den primære prostatatumor at vurdere virkningerne af denne hidtil ukendte kombinationsterapi på tumor lokalt recidiv og fjernmetastase. Især fokuserede vi på den rolle, STAT3 ved modulering HIFU-induceret anti-tumor immunrespons. Vores resultater viste, at sammenlignet med kirurgi alene, kunne kombinationen af ​​M-HIFU og kirurgi signifikant hæmme tumor tilbagefald, undertrykke væksten af ​​tumorer genoptage behandlingen samtidig forbedre overlevelsesraten. Desuden blev disse iagttagelser bekræftes af den reducerede p-STAT3 aktivitet med samtidig øget anti-tumor respons. Alt i alt, vores resultater tyder på, at M-HIFU i kombination med kirurgi kan give en ny behandlingsmulighed i forvaltningen af ​​prostatakræft.

Resultater

M-HIFU opløses RM-9 tumorvæv, hæmmer tumorvækst, og forbedrer Host Survival

Figur 1A viser repræsentative B-mode ultralyd billeder af RM-9 tumor under M-HIFU behandling. Fokus for HIFU transducer blev fremhævet af en cross symbol. M-HIFU behandling blev påbegyndt i midten og skred med 1 trin mm mod tumor grænse. En sikkerhedsmargin på mindst 1 mm blev anvendt under HIFU behandling for at undgå beskadigelse tilgrænsende hud, muskler og knogler. Efter hver eksponering, kan et lyspunkt af hyperechogenicity observeres (angivet med pile i de øvre paneler), svarer til en produktion af inertial kavitationsbobler i tumorvævet [12]. Fordi pulseret HIFU med en cyklus lav duty på 2% blev anvendt i M-HIFU, den resulterende temperatur i tumorvævet var mindre end 45 ° C efter en 20-eksponering. Derfor termisk effekt var ubetydelig. En gennemgang af de udskårne tumorvæv afsløret desintegration af tumorvæv og dannelse af hulrum, der er karakteristiske for mekanisk lysis produceret af inertial bobler i HIFU behandlede region (nederste højre panel i figur 1A).

A,

Ultralydsscanning guidede M-HIFU behandling. Kavitation aktiviteter induceret af M-HIFU inden tumorvævet er vist i områder med hyperechogenicity, angivet med pile i billeder de B-mode (øvre panel) og i de udskårne tumorer (nederste panel Venstre:. Hud oven på tumoren var intakt efter M-HIFU behandling midten: fjernet tumor viser intakt ydre overflade efter M-HIFU behandling højre:. gennemskæres tumor viser mekaniske læsioner i det indre område efter M-HIFU behandling

B

, tumor vækstkurve indlæg genbehandling . 2 × 10

4 RM-9 celler blev subkutant injiceret i den kontralaterale bagbenet 30 dage efter M-HIFU behandling, når musene blev helt efter kirurgisk resektion af den primære tumor. Volumen af ​​de genoptage behandlingen tumorer blev beregnet på grundlag af caliper måling af tumorstørrelse på 3-dages intervaller startende fra dag 7 efter tumor genbehandling * p. 0,05, ** p. . 0,01

C,

Samlet overlevelse kurve efter tumor revurdering Mus nå den humane endpoint var aflivet. Der var 10 mus i kirurgi-gruppen og 12 i HIFU + kirurgi gruppe. P-værdi på 0,019 blev bestemt ved log-rank test. Data blev opnået fra tre uafhængige forsøg.

To dage efter M-HIFU behandling, de primære tumorer blev resekteret fra musene i begge grupper. Denne tidsforsinkelse blev valgt baseret på vores tidligere observation, at M-HIFU 2 dage før kirurgisk resektion af den primære tumor kan reducere risikoen for fjernmetastaser i en murin melanom-model [18]. Opfølgning observation i de næste 30 dage viste ingen lokal tumor recidiv, formentlig som følge af den strenge og omfattende fjernelse af tumorvæv ved operation. På dette tidspunkt var tumor genbehandling udføres, og væksten af ​​de genoptage behandlingen tumorer blev fulgt op med yderligere 30 dage. Som vist i figur 1B, er der en klar adskillelse i vækstkurverne med de genoptage behandlingen tumorer i M-HIFU + kirurgi gruppe signifikant mindre end dem i kirurgi gruppen. Væsentlige forskelle i tumor volumen mellem de to grupper blev observeret startende fra dag 10 til udgangen af ​​den følgende op periode.

Efter genbehandling, ingen dyr døde. Musene med de igen fik tumorer blev kun aflivet, når de humane endepunkter for tumorvækst blev draget. Lungevæv blev høstet og undersøges under et dissektion mikroskop, men ingen metastatisk knude blev observeret. Når kirurgi blev udført, blev fundet RM-9 tumorknuder at være godt omgivet af en kapsel af bindevæv, hvilket indikerer en mulig årsag til fraværet af fjernmetastaser. Den kumulative overlevelse i M-HIFU + kirurgi gruppe blev fundet at være statistisk højere end i kirurgi gruppen (fig 1C), hvilket indikerer et potentiale tumor undertrykkende virkning af M-HIFU i kombination med kirurgisk resektion af den primære tumor.

Prostata Cancer RM-9 Cells udtrykker konstitutivt p-STAT3, som kan reduceres ved M-HIFU behandling

Phospho-STAT3 (Y705), den aktiverede form af STAT3, spiller en central rolle i at fremkalde immunovervågning, tumorudvikling og tumormetastase [20], [22], [25]. Derfor inhibering eller nedrivning aktiv STAT3 er af interesse for både direkte anti-tumorbehandling og tumor specifik immunterapi. Før belyse den rolle, M-HIFU på STAT3-aktivering, undersøgte vi adskillige tumorcellelinier for STAT3-aktivitet og fandt, at et højt niveau af p-STAT3 blev udtrykt i RM-9-celler. Som vist ved IF-farvning og fluorescensmikroskopi (figur 2A), blev næsten alle RM-9 celler farvedes positivt for p-STAT3, som angivet ved de lyserøde flettede signaler (pile). Denne

in vitro

observation blev yderligere bekræftet

in vivo

. Som vist i figur 2B, undersøgte vi RM-9 tumorer høstet ved tre forskellige tidspunkter (10-, 15-, og 20-dage) efter inokulation for p-STAT3 hjælp IHC og resultaterne viser konstitutiv STAT3-aktivering i RM-9 tumorer i løbet af de 20 dage fra tumorudvikling. Disse observationer indikerer også, at RM-9 celler og tumorer er ideelle til at undersøge effekten af ​​M-HIFU på STAT3 aktivitet.

A,

Expression af p-STAT3 i RM-9 celler. RM-9-celler blev underkastet IF farvning for p-STAT3 og DAPI farvning for kerner. Under fluorescerende mikroskopi, blev p-STAT3 markeret med rød fluorescens mens kerner blev mærket med blå signaler. De p-STAT3-positive kerner blev indikeret ved fusionerede lyserøde signaler. Solid pile peger på repræsentative p-STAT3-positive kerner mens den stiplede pil markerer en p-STAT3-negativ kerne.

B,

Expression mønster af p-STAT3

in vivo.

RM-9 tumorer blev fjernet ved tre forskellige udviklende tidspunkter som angivet og underkastes IHC-farvning for p-STAT3. Efter modfarvet ved hematoxylin blev p-STAT3-positive kerner angivet med mørkebrune signaler (pile), mens p-STAT3-negative kerner var i blåt.

C,

Nedsat p-STAT3-niveauer i RM-9 tumorer efter M-HIFU behandling. To dage efter M-HIFU behandling blev RM-9 tumorer fjernet og udsat for IHC-farvning for p-STAT3. Tre tumorer i hver gruppe blev analyseret, og de repræsentative tal vises. Den IHC blev uafhængigt udført tre gange. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Den studerendes

t

-test blev udført for at bestemme p-værdier. * P 0,05.

D,

Expression nedregulering af tre STAT3 nedstrøms målgener af M-HIFU behandling. To dage efter M-HIFU behandling, RM-9 tumorer blev fjernet, og mRNA blev isoleret. RT-PCR derpå for at afsløre niveauer af cyclin D1t Bcl-xL IL-10 og β-actin. Band signaler blev kvantificeret ved anvendelse af NIH ImageJ software. Repræsentative billeder fra tre uafhængige forsøg er vist.

Næste, vi evaluerede effekten af ​​M-HIFU på STAT3-aktivering ved hjælp af RM-9 tumor-bærende mus. To dage efter M-HIFU behandling blev RM-9 tumorer fjernet fra musene og udsat for p-STAT3 IHC (n = 3 pr gruppe). Som vist i figur 2C, blev p-STAT3 niveau faldt betydeligt med 1,8-fold efter M-HIFU, hvilket indikerer, at administration af M-HIFU effektivt kan inhibere STAT3-aktivering i RM-9 tumorer. Endvidere overensstemmelse med den observerede reduktion af p-STAT3 af M-HIFU, ekspressionsniveauer af tre STAT3 målgener blev signifikant reduceret med M-HIFU samt, som indikeret af resultaterne af RT-PCR i figur 2D. Alt i alt viser disse resultater, der kan detekteres STAT3-aktivering i RM-9 prostatacancerceller

in vitro

in vivo,

og at M-HIFU reducerer niveauerne af STAT3-aktivering og STAT3- målrettede gener i RM-9 tumorer.

M-HIFU øger Tumor-specifikke cytotoksicitet

for at undersøge om M-HIFU behandling resulterer i en forøgelse af CTL-responser [26], vi analyserede ændring i hyppigheden af ​​CD8

+ T-celler og deres IFN-γ produktion, både i M-HIFU + kirurgi gruppe og i kirurgi alene gruppen. Vi fandt, at 2 dage efter kirurgi antallet af CD8

+ T-celle blev forøget i M-HIFU + kirurgi gruppe (figur 3A og B), sammenlignet med den gruppe, der havde kirurgi alene. Tumorspecifik IFN-γ-produktion i de tumorbærende værter blev yderligere verificeret ved ELISpot-assay. Splenocytter blev høstet 12 dage efter kirurgi fra tre mus per gruppe, og prøverne blev puljet og co-dyrket med enten RM-9 eller irrelevante EL-4 tumorceller (splenocytter vs. tumorceller på 10:01 forhold), analyseres derefter for at bestemme IFN-γ-produktion. M-HIFU behandling signifikant forøget IFN-γ producerende CTL til 4 gange af den ikke-HIFU kontrol (p 0,001) (figur 3C, D). Denne forhøjede respons blev ikke observeret i EL-4 celler, hvilket indikerer, at IFN-γ-produktionen var RM-9 tumorspecifik af tumorbærende vært. Disse resultater antyder, at M-HIFU behandling kan fremme dannelsen af ​​IFN-γ producerende CTL, en af ​​de mest kritiske faktorer i anti-tumor-immunitet.

A, Salg 2 dage efter behandling, milte fra tre mus behandlet med eller uden M-HIFU blev opsamlet og poolet. Andel af milt-CD8

+ T-celler blev bestemt ved flowcytometri. Repræsentative resultater fra tre uafhængige eksperimenter er vist.

B,

Statistisk signifikans af stigningen af ​​CD8

+ cellepopulation ved at kombinere HIFU med kirurgi. * P 0,05

C

, Tolv dage efter operation eller M-HIFU plus kirurgi behandling, tre mus fra hver gruppe blev aflivet, og deres milte blev opsamlet og samlet. IFN-γ ELISpot-assay blev udført med de puljede splenocytter. Mitomycin-C-behandlede RM-9-celler blev tilsat som stimulatorer i forholdet 1:10 (RM9: splenocytter). EL-4-celler blev anvendt som et irrelevant cellekontrol. Repræsentative resultater fra tre uafhængige eksperimenter er vist.

D

, Tælling af IFN-y-positive celler og, og statistisk analyse baseret på ELISPOT analyseresultater. *** P. 0,0001

M-HIFU behandling Øger Population af CTL og DCS i Milt og TDLNs

udviklingslandene er de eneste professionelle antigen-præsenterende celler, som kan prime naive T-celler, og spiller en kritisk rolle i dannelsen af ​​tumorspecifikke CTL’er. DC’er kan identificeres med ekspressionen af ​​CD11c som en celleoverflademarkør. Da p-STAT3 er en central suppressor af DC-aktivering [27], [28], vi evaluerede hyppigheden af ​​CD11c

+ cellepopulation i milt og TDLNs 6 dage efter M-HIFU behandling i mus bærer RM-9 transplanterede tumorer . Som vist i figur 4A til 4D, andele af CD11c

+ -celler blev signifikant forøget i milte og TDLNs til mere end 3 gange og 1,2 gange for kontrolgruppen uden HIFU behandling henholdsvis (i begge tilfælde, s 0,001 ). Vi evaluerede også den andel af CD11c

+ -celler til tiden af ​​2 dage efter M-HIFU behandling, men det syntes at være for tidligt at observere en forøgelse af DC populationen (data ikke vist). Desuden M-HIFU behandling forøget ekspression af co-stimulerende molekyle, CD80 og CD86, på DC’er (figur 4E og 4F). Kollektivt, vises M-HIFU behandling for at forbedre rekruttering og /eller udvidelse af DC’er, foruden DC modning.

Tre mus fra hver gruppe blev aflivet seks dage efter operation eller HIFU plus kirurgi behandling. Enkelt cellesuspension blev fremstillet fra de samlede milte eller TDLNs; og CD11c

+ cellepopulation blev bestemt ved flowcytometri. Repræsentative resultater fra tre uafhængige eksperimenter er vist.

En

,

C

, Repræsentative strømningsmønstre i påvisning CD11c

+ celler i milten (

A

) og TDLNs (

C

).

B

,

D

, Statistisk signifikans i stigningen af ​​DC befolkning i milten (

B

) og TDLNs (

D

) baseret på resultaterne af

A

og

C,

hhv.

E

,

F

, Evaluering af DC stimulation ved at registrere CD80-positive (

E

) og CD86-positive (

F

) CD11c

+ celler i milt og TDLNs. * P 0,05, *** p. 0,0001

M-HIFU Enhanced Anti-tumor respons er, i del, Forårsaget af bekæmpelse af treg Cell Generation

STAT3 også spiller en vigtig rolle i at forbedre udviklingen af ​​CD4

+ regulatoriske T-celler (tregs) [24]. Tregs inhiberer immunresponser og har været impliceret i induktion af tolerance i anti-tumor-immunitet. Her har vi forsøgt at afgøre, om M-HIFU behandling undertrykker generation eller udvidelse af tregs i tumor-transplanterede mus. Splenocytter og TDLNs celler blev høstet 6 dage efter M-HIFU behandling som tidligere nævnt at evaluere frekvensen af ​​tregs. Den i figur 5 viste resultat afslørede, at M-HIFU behandling fremkaldte en væsentlig nedsættelse af Treg population med ca. 50% i milt (p 0,001), og ca. 10% i TDLNs (p 0,001). Svarende til observation fra DC’er, var ændringer i Treg population ikke signifikant 2 dage efter M-HIFU behandling (data ikke vist). Disse resultater viser, at ud over at udvide DC befolkning og øge DC modning, M-HIFU behandling reducerede populationsstørrelse tregs, som vides at nedregulere udviklingen af ​​anti-tumor-immunitet.

Enkelt celle suspension blev fremstillet fra de samlede milte eller TDLNs. Befolkning af CD4

+ Foxp3

+ celler blev derefter bestemt som Treg ved flowcytometri. Tallene viste er repræsentanter fra tre uafhængige farvning og efterfølgende flow analyse.

En

,

C

, Repræsentative strømningsmønstre i påvisning tregs i milt (

A

) og TDLNs (

C

).

B

,

D

, Andel af treg befolkning i milten (

B

) og TDLN (

D

) baseret på resultaterne vist i

A

og

C

hhv. ** P 0,01, *** p. 0,0001

Diskussion

Denne undersøgelse blev udført for at få en bedre forståelse af de mekanismer, som M-HIFU fremkalder anti- tumor effekter og til at undersøge strategier for optimal anvendelse af M-HIFU i prostatakræft behandling. Vores langsigtede mål er at etablere rationaler for at bruge M-HIFU baseret kombinationsbehandling som en forbedret behandling modalitet for patienter med prostatacancer. Samlet tyder vore resultater, at M-HIFU kan inhibere STAT3-aktivering, som fører til et anti-tumor respons gennem to potentielle mekanismer. Først, reduktion af p-STAT3 i tumorerne direkte inhiberer tumorvækst. For det andet, en reduktion af STAT3-aktivitet fører til et øget antal tumorspecifikke CTL’er og DCS, samt et reduceret antal Treg, og derefter en forøgelse af anti-tumor-immunitet.

Konstitutiv aktivering af STAT3 observeres hyppigt i mange humane tumorer, herunder melanom, brystcancer, hoved- og halscancer, gliom og prostatacancer [20], [22], [25]. Det er velkendt, at vedvarende aktiveret STAT3 fungerer som en central regulator af molekylære og biologiske begivenheder der fremmer tumorigenese [29]. Aberrant STAT3-aktivitet spiller en central rolle i dysreguleret væksten og overlevelsen af ​​tumorceller såvel som til at fremme angiogenese. Desuden afvigende STAT3 fremmer invasion og metastase og dermed bidrage til tumor progression [20], [22], [30]. Under tumorigenese, er aktiviteten af ​​STAT3 også forhøjede i tumorassocierede lymfocytter [31], [32]. Inhibering STAT3 i enten tumorceller eller tumor-infiltrerende myeloide celler fremkalder Th1-anti-tumor immunrespons, samtidig med et forøget antal af CTL’er og nedsat tregs [33]. Således undertrykker aktiveringen af ​​STAT3 ved fysisk (

dvs

HIFU) eller farmakologiske tilgange er af stor interesse for både direkte anti-tumor behandling og tumor specifik immunterapi.

På baggrund af ovennævnte forståelse om STAT3, forsøgte vi at bestemme virkningen af ​​M-HIFU på STAT3-aktivering i en

in vivo

transplantation model af prostatacancer. Faktisk blev niveauet for intratumoral p-STAT3 væsentligt faldet med behandlingen af ​​M-HIFU. I en tidligere undersøgelse af B16 melanom transplantation model blev p-STAT3 niveau ligeledes vist sig at være væsentligt nedreguleret af M-HIFU behandling [34], hvilket tyder på virkningerne af M-HIFU på STAT3 aktivering kan være almindeligt blandt forskellige tumorer.

den funktionelle nedregulering af p-STAT3 blev yderligere bekræftet af den reducerede udtryk for dens downstream målgener. Cyclin D1, som opreguleres af aktiverede STAT3, er en allosterisk regulator af cyclinafhængige kinaser 4 og 6 (CDK4 /6) og fremmer G1 /S overgangen gennem CDK4 /6-medieret phosphorylering og inaktivering af retinoblastoma protein [ ,,,0],32], [35]. Inhibering af ekspressionen af ​​cyclin D1 vil forsinke cellecyklussen i G1-fasen fra at indgå S-fasen, og derfor signifikant nedsætter tumorcelleproliferation [36] – [40]. Bd-XL, også en væsentlig STAT3 målgen, er et anti-apoptotisk molekyle af bcl-2-familien og fremmer tumorprogression [32], [41], [42]. Bd-XL overekspression findes hyppigt i et bredt spektrum af cancere, herunder prostatacancer [43], [44]. Udtømning af den fremherskende Bd-XL-ekspression reducerer levedygtigheden af ​​tumorceller efter apoptotiske stimuli [45]. I denne undersøgelse vore resultater fra RT-PCR viste klart, at nedregulering af p-STAT3 blev ledsaget af reduceret ekspression af cyclin D1 og Bd-XL i tumorvæv efter M-HIFU behandling. Disse resultater indikerede, at M-HIFU kan inhibere den afvigende STAT3 aktivitet og dermed kan inducere vækststandsning og apoptose af tumorceller, samt regression af prostatacancer

in vivo

.

Ud over den intratumoral onkogene rolle, p-STAT3 er involveret i immunsuppression gennem interfererende DC stimulering ved inhibering af ekspressionen af ​​proinflammatoriske cytokiner og kemokiner, som stimulerer DC [28]. Alternativt p-STAT3 fremmer tumorceller til at producere flere onkogene cytokiner, såsom IL-10, som igen aktiverer STAT3 signalering gennem en positiv feedback loop og hæmmer funktionel DC stimulation [28], [32], [33]. DC stimulation er afgørende for effektiv antigenpræsentation og udvikling af anti-tumor immunrespons af T-celler. Vores tidligere undersøgelser under anvendelse af MC38 tumormodel har vist, at HIFU-genereret mekanisk beskadigelse af tumorceller kan føre til DC-stimulering [17], og efterfølgende forøgede CTL aktiviteter [12]. I denne undersøgelse, vi yderligere bekræftet, at M-HIFU kan øge funktionen af ​​DCs

in vivo

, som det fremgår af signifikant øget befolkning af DC’er med samtidigt opreguleret udtryk for co-stimulerende molekyler såsom CD80 og CD86.

En anden immun undertrykkende funktion af p-STAT3 er relateret til dets rolle i styrkelsen generering af tregs, der undertrykker immunresponser på selv-antigen, herunder tumor associeret antigen. STAT3 spiller også en vigtig rolle ved at orkestrere flere kritiske aspekter af T-celle funktion i inflammation og homeostase. Især ekspressionen af ​​Foxp3, som er afgørende for de regulatoriske funktioner af Treg, afhænger af STAT3-aktivering [24]. Inhiberende STAT3 aktivitet reducerer omdannelse af Foxp3-negative T-celler til tumorassocieret tregs og øger CD8

+ T-celle infiltration i tumor – en strategi, der er blevet anvendt til at inhibere primær tumorvækst [46]. Ligeledes i vores undersøgelse blev M-HIFU behandling fundet til sænke andelen af ​​treg i både milt og TDLNs, samtidig med undertrykkelsen af ​​STAT3 aktivitet i disse væv. Derfor er vores resultater tyder på, at M-HIFU kan reducere Treg-fremkaldte immun tolerance i RM-9 model.

Sammenfattende vi har afsløret en særlig mekanisme til M-HIFU inducerede immunrespons anti-tumor, som er medieret gennem hæmning af STAT3-aktivering

in vivo

. Vi har desuden fundet, at M-HIFU udføres på et passende tidspunkt (dvs. 2 dage for RM-9 model) før kirurgisk fjernelse af den primære tumor kan forbedre beskyttelsen af ​​værten mod tumortilbagevenden, og derfor kan øge overlevelse patienter fra malignitet af prostatacancer. Selv om der i denne undersøgelse fokuserede vi på den mekanisme forbundet med STAT3, involvering af andre mekanismer for M-HIFU inducerede anti-tumor immunitet er også muligt, og vil blive undersøgt i fremtiden. Alt i alt har vi vist, at M-HIFU er en lovende neo-adjuverende behandling, der kan kombineres synergistisk med kirurgi for prostatakræft behandling.

Materialer og Metoder

Animal Model

C57BL /6J mus, 6~8 uger gamle, blev erhvervet fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) og huset i Duke Vivarium før og efter M-HIFU behandling og /eller kirurgi. Alle dyr blev håndteret i overensstemmelse med den etablerede dyr pleje politik, og alle dyreforsøg blev godkendt af Duke University Institutional Animal Care Brug udvalget.

Cell Line og Cell Culture

Murin prostatakræft cellelinje RM-9, blev oprettet ved Dr. Thompson i Baylor College of Medicine, var en gave fra Dr. Mouraviev. EL4 muselymfom cellelinje blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alle cellelinierne blev opretholdt i komplet Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 2 mM L-glutamin, 50 IE /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ° C med 5% CO

2.

Antistoffer, Kits og kemiske reagenser

følgende kit og antistoffer blev indkøbt fra eBiosciences (San Diego, CA, USA): Mouse regulatoriske T-celle farvningssæt (FJK-16 s), PE-konjugeret anti-muse CD8 antistof og anti-muse CD16 /32-antistof. APC-konjugeret anti-muse CD11c-antistof, FITC-konjugeret anti-muse CD80, og PE-konjugeret anti-muse CD86 var fra BD Bioscience (San Jose, CA, USA). Kanin-anti-muse phospho-STAT3 (Y705) antistof blev købt hos Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Muse interferon-y ELISpot kit var fra Mabtech Inc (Cincinnati, OH, USA). Texas Red-konjugeret gede-anti-kanin-antistof blev indkøbt fra Vector Laboratories Inc (Burlingame, CA, USA). Monteringsmedium opløsning med eller uden DAPI, blokeringsopløsning, Vectastain Elite ABC Kit (kanin IgG) og AEC-kit var fra Vector Lab. SV total RNA isolation system blev indkøbt fra Promega (Madison, WI, USA). DNA syntese enzymer var fra Invitrogen medmindre andet er angivet.

Tumor Model, HIFU behandling, kirurgisk resektion, og postoperativ pleje og Målinger

RM-9 tumor model blev oprettet ved subkutan injektion 8 × 10

4 RM-9 celler i den højre bagben af ​​C57BL /6J-mus. Tumorer fik lov til at vokse i omkring 7 dage, indtil de nåede 5~6 mm i diameter.