PLoS ONE: oncogen CagA Fremmer Gastric Cancer Risk via Aktivering ERK signalveje: En nested case-Control Study

Abstrakt

Baggrund

CagA cellulære interaktion via aktivering af ERK signalvejen kan være et udgangspunkt for udviklingen af ​​mavekræft. Denne undersøgelse havde til formål at vurdere, om gener involveret i ERK nedstrøms signalveje, der aktiveres af CagA er modtagelige genetiske markører for gastrisk cancer.

Metoder

I opdagelsen fase, i alt 580 SNPs inden for + /-5 kbp 30 kandidatgener blev genotype for at undersøge en forening med mavekræft risiko i den koreanske Multi-center cancer Kohorte (100 hændelse mavekræft case-kontrol sæt). De væsentligste SNPs (rå eller permuterede

s

værdi 0,02) identificeret i opdagelsen analyse blev revurderet i forlængelse fase ved hjælp af ubetinget logistisk regressionsmodel (400 gastrisk kræft case-kontrol sæt). Kombineret analyser herunder pooled- og meta-analyse blev udført for at opsummere alle resultaterne.

Resultater

24 SNPs i otte gener (ERK, Dock180, C3G, Rap1, Src, CrkL, Mek og CRK) var signifikant associeret med mavekræft risiko i enkelte SNP-analyser i opdagelsen fase (

s

0,05). I forlængelse analyser, ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 viste marginalt signifikante effekter gen-dosis for mavekræft. Konsekvent, sidste kombineret analyse præsenterede SNPs som signifikant associeret med mavekræft risiko (OR = 1,56, [95% CI: 1,19-2,06], OR = 0,61, [95% CI: 0,43-0,87], OR = 0,59, [95 % CI: 0,54-0,76], henholdsvis)

konklusioner

Vores resultater tyder på, at ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 er genetiske determinanter i gastrisk carcinogenese

Henvisning.. : Yang JJ, Cho LY, Ma SH, Ko KP, Shin A, Choi BY, et al. (2011) onkogenisk CagA Fremmer Gastric Cancer Risk via Aktivering ERK signalveje: en indlejret Case-Control Study. PLoS ONE 6 (6): e21155. doi: 10,1371 /journal.pone.0021155

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Modtaget: Juli 22, 2010; Accepteret: 21. maj 2011; Udgivet 16. juni, 2011

Copyright: © 2011 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi [KRF-2007-313-E00175] og [NRF-2009 til 0.066.258]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Helicobacter pylori (

H. pylori

) er en gennemprøvet årsag til gastrisk carcinogenese [1]. Ikke desto mindre kan den absolutte virkning ændres af individuelle modtagelighed risikofaktorer såsom genetiske varianter og

H. pylori

virulente egenskaber [2], [3]. Cytotoksin-associeret antigen (CagA), en

H. pylori

immunoprotein, er en afgørende faktor for den enkeltes modtagelighed og er forbundet med alvorlige kliniske resultater, herunder gastrisk kræft [4], [5], [6]. I gastriske epitelceller, CagA forstyrrer diverse signaltransduktionsbaner, såsom Dock180-Rac1-WAVE-ARP2 /3, C3G-Rap1-BRAF-MEK, Sos1-HRas-Raf1, og Ras-Raf-MEK-ERK signalering [3 ], [7], [8], [9]. Signaler modificeret af CagA fremkalde cellulære ændringer såsom apoptose, proliferation og dødelighed celle, og stimulere gastrisk carcinogenese [10], [11], [12].

Blandt flere downstream veje aktiveret af CagA, den ekstracellulære signal -regulated kinase (ERK) kaskade er en central vej, da det spiller en vigtig rolle i gastrisk carcinogenese. CagA cellulære interaktioner med Src, SHP2, Crk, CrkL eller Grb2 er signifikant associeret med ERK-aktivering, og andre forskellige proteiner involveret i CagA signalering er intimt forbundet til Erk signalveje [10], [11], [12], [13] . Proteiner kan reguleres ved deres værtsgener; derfor kan gener, der koder proteiner relateret til CagA og ERK-signalering proces være vigtig for gastrisk carcinogenese men kun få undersøgelser har fokuseret på disse genetiske polymorfier.

CagA onkogenicitetsstudie kan være et udgangspunkt for udviklingen af ​​mavekræft via aktivering af ERK signalvejen. Disse signal transduktioner synes at være ændret af værtens genetiske varianter. Således har vi den hypotese, at gener involveret i ERK nedstrøms signalveje, der aktiveres af CagA kan være modtagelige genetiske markører for gastrisk cancer. For at evaluere denne hypotese, gennemførte vi en etapevis genetiske forening undersøgelse, der omfattede 1) opdagelse fase: en kandidat gen analyse, der fokuserede på 30 gener, CRK, CrkL, CSK, Grb2, c-Met, NFATC4, PTPN11, sms, SOS1 , Src, ERK, FAK, PLCγ, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, BRAF, RAF1, MAP2K1, MAP2K3, MAP2K4, MAP2K5, MAP2K6, p21, Dock180, Rac1, RAP1, WAVE, ARP2, Arp3 og C3G, involveret i CagA og ERK-signal transduktion pathway, og 2) udvidelse fase, undersøgte de væsentligste SNPs identificeret i opdagelsen analyse.

Metoder

studiepopulation

Discovery fase.

opdagelsen kandidat gen-analyse var en populationsbaseret nested case-kontrol undersøgelse inden den koreanske Multi-center Cancer Kohorte (KMCC). Fra 1993 til 2004 KMCC rekrutteret i alt 19,688 deltagere fra fire by- og landområder i Korea. Alle deltagere gennemført detaljerede standardiserede spørgeskemaer ved personlig samtale efter informeret samtykke. Blod- og urinprøver blev også opsamlet. Gennem rekord forbindelser til det nationale dødsattesten, sygesikring medicinske journaler databaser og nationale cancer register, blev alle deltagere passivt fulgt op, og nydiagnosticerede tilfælde blev konstateret. Detaljerede oplysninger om KMCC er beskrevet andetsteds [14]. I december 2005, 249 gastric kræfttilfælde defineret i henhold til den internationale statistiske klassifikation af sygdomme og sundhedsproblemer 10. Revision (ICD-10, C16) blev identificeret. Sager diagnosticeret før ansættelsen (n = 52), uden blodprøver (n = 35) eller utilstrækkelig DNA-niveau under 50 ng /ul (n = 62) blev udelukket. Kræft-fri kontroller blev modsvaret af alder (± 5 år), køn, bydel, og indskrivning år. Endelig blev 100 sæt af gastrisk kræfttilfælde og matchede kontroller defineres.

Extension fase.

1) I december 2008 95 nye kræfttilfælde gastrisk blev desuden konstateret fra KMCC. Disse sager og 116 sager, der blev udelukket i opdagelsen kohorte skyldes forekomsten status eller utilstrækkelig DNA-koncentration blev inkluderet i forlængelse fase (n = 211). Ved hjælp af samme matchende metode som opdagelsen fase, blev 211 kontroller valgt. 2) Gastric kræfttilfælde blev opnået fra to universitetshospitaler i Korea, der var Chungnam Universitetshospital og Hanyang University GURI Hospital. Fra marts 2002 til september 2006 blev i alt 490 mavecancerpatienter nyligt diagnosticeret på sygehusene. Deres epidemiologiske data og venøse fuldblodsprøver blev indsamlet på tidspunktet for diagnosen eller før mavekræft kirurgi. Blandt dem, blev 189 tilfælde med tilstrækkelige DNA-prøver og informerede samtykke også inkluderet i forlængelsen sæt. Også, blev 189 community-baserede kontroller modsvares af alder (± 5 år) og køn fra KMCC emner indskrevet efter 2000.

Etik Statement

Studieprotokollerne til KMCC undersøgelsen, hospitalet -baseret undersøgelse og den nuværende nested case-kontrol undersøgelse blev godkendt af de institutionelle anmeldelse boards (IRB) i Seoul National University Hospital og National Cancer center of Korea (H-0110-084-002 og C-0603-161-170) og af den institutionelle gennemgang bestyrelse Hanyang Universitetshospital (IRB nr. 2003-4).

Gene og SNP udvælgelse

Gennem litteratur, vi identificeret 30 kandidatgener, der kan være involveret i CagA signaltransduktionsvejen knyttet til Erk nedstrøms signalering ved direkte interaktion med CagA eller sekundær kærlighed i CagA genetiske sekvenser [3], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. De 30 kandidatgener er som følger: v-Crk sarcomavirus CT10 onkogen homolog (

CRK

); v-Crk sarcomavirus CT10 onkogen homolog (aviær) -lignende (

CRKL

); c-Src-tyrosinkinase (

CSK

); vækstfaktor receptor-bundet protein 2 (

Grb2

); Met proto-onkogen (c-

MET

); nuklear faktor af aktiverede T-celler, cytoplasmisk, calcineurin-afhængige 4 (

NFATC4

); proteintyrosinphosphatase, ikke-receptortype 11 (

PTPN11

); spermin syntase (

SMS

); søn af sevenless homolog en (

SOS1

); v-Src sarkom (Schmidt-Ruppin A-2) viral onkogen homolog (

SRC

); elg-relaterede tyrosinkinase (

ERK

); omdrejningspunkt vedhæftning kinase 1 (

FAK

); phospholipase C-gamma (

PLCγ

); v-Ki-ras2 Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (

KRAS

); neuroblastom RAS viral (v-ras) onkogen homolog (

NTM

); v-raf musesarcoma viral onkogen homolog B1 (

BRAF

); v-raf-1 murin leukæmi viral onkogen homolog 1 (

RAF1

); mitogenaktiveret proteinkinase kinase 1 (

MAP2K1

); mitogenaktiveret proteinkinase kinase 3 (

MAP2K3

); mitogenaktiveret proteinkinase kinase 4 (

MAP2K4

); mitogenaktiveret proteinkinase kinase 5 (

MAP2K5

); mitogenaktiveret proteinkinase kinase 6 (

MAP2K6

); cyclin-afhængige kinase inhibitor 1A (

p21

); dedicator af cytokinese 1 (

Dock180

); ras-relaterede C3 botulinumtoksin substrat 1 (

Rac1

); RAP1A medlem af RAS onkogen familie (

RAP1

); WAS protein familie, medlem 1 (

WAVE

); ARP2 actin-relateret protein 2 homolog (

ARP2

); ARP3 actin-relateret protein 3 homolog (

Arp3

); Rap guanin nukleotid udveksling faktor (GEF) 1 (

C3G

).

Genotypning

Discovery fase.

Genotypning blev udført ved hjælp af hele genomet menneske SNP Array 5,0 i henhold til standarden protokol anbefalet af producentens anvisninger [15]. Før genotypebestemmelse, blev koncentrationer af genomisk DNA for alle forsøgspersoner målt ved anvendelse af et spektrofotometer (NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies). For hver enkelt analyseret, blev 250 ng af genomisk DNA fordøjet med et restriktionsenzym (Nsp I eller Sty I). Selvom vi screenede i alt 580 SNPs inden for +/- 5 kbp af de 30 mål gen steder, blev 103 polymorfier udelukket på grund af en SNP opkald på mindre end 95% eller en HWE værdi mindre end 0,0001. Fordi genomet hele menneske SNP Array 5,0 blev fremstillet på grundlag af en kaukasisk population, har 115 SNPs ikke opfylder kriterierne i MAF 0,05 i asiater og blev også udelukket. Derudover blev 20 sager og 14 kontroller udelukket på grund af utilstrækkelig genomisk DNA ( 250 ng), køn uoverensstemmelse eller dårlig genotype ( 90%). Endelig blev 362 SNP’er i 30 gener (genotypebestemmelse på 99,5%) genotype i 81 tilfælde og 85 kontroller. Klyngen billeder af signal intensitet blev gennemgået for alle SNPs

Extension fase

Seven SNPs med rå eller permuteret

s Drømmeholdet værdi. . 0,02 (rs5999749, rs9418677, rs4635002, rs10901081, rs7853122, rs530801, rs747182) identificeret i opdagelsen analyse blev genotypebestemt ved anvendelse af Illumina VeraCode GoldenGate Assay med BeadXpress ifølge fabrikantens protokol (Illumina, San Diego, CA, USA) [16]. For at sikre pålideligheden af ​​de to genotypebestemmelsesmetoder blev 135 prøver (59 sager og 76 kontrol) genotype to gange af både genomet hele menneske SNP Array 5,0 og Illumina VeraCode GoldenGate Assay, og konkordansen lå 98,2%. Af de 7 SNPs blev rs9418677 udelukket på grund af en SNP takst 95%. To tilfælde og 40 kontroller med lav DNA tilgængelighed (n = 15) eller genotype takst 90% (n = 27) blev også udelukket i analysen. Endelig blev seks SNPs i fem gener (genotype på 99,1%) analyseret i 398 tilfælde og 360 kontroller i forlængelse fase.

H. pylori

CagA afsløring

H. pylori

infektion status og CagA seropositivitet blev evalueret ved hjælp immunoblotassay, helico Blot 2,1 ™ (MP Biomedicals Asia Pacific, Singapore). Helico Blot 2,1 ™ kits har rapporteret en følsomhed på 99% for både

Helicobacter pylori

CagA seropositivitet og en specificitet på 98% for

H. pylori

og 90% for CagA seropositivitet [17].

Statistisk analyse

Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) i kontrolgruppen blev evalueret ved Fishers eksakte test med en cut- off niveau af HWE. 0,0001

i den primære scanning i opdagelsen sæt, sammenhængen mellem de enkelte SNPs og gastrisk kræftrisiko blev vurderet på grundlag af både rå og permuteret

s

-værdier ved hjælp af LRT med 1 frihedsgrad i tendensen (additiv) model. Tendensen test forudsætter en dosis-respons effekt med et stigende antal variant alleler. Permuteret

p

-værdier blev estimeret ved 100.000 permutation tests. Baseret på den additive model var mavekræft risiko beregnet som odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CIS) ved hjælp af ubetinget logistisk regressionsmodel justering for risikofaktorer, der var rygning status (nogensinde

vs.

Aldrig) ,

H. pylori

infektion (positiv

vs.

negativ) og CagA seropositivitet (positiv

vs.

negativ). Den Benjamini-Hochberg falsk opdagelse sats (BH-FDR) korrigeret

s

-værdier for hver SNP blev beregnet til at undgå falske association med falske positive resultater [18].

I forlængelse fase de væsentligste SNPs med rå eller permuteret

s Drømmeholdet værdi 0,02 identificeret i opdagelsen fase blev revurderet. Baseret på den additive model var mavekræft risiko estimeres som yderste periferi og 95% CIs hjælp ubetinget logistisk regressionsmodel justering for risikofaktorer, der var rygning status (nogensinde

vs.

Aldrig),

H. pylori

infektion (positiv

vs.

negativ) og CagA seropositivitet (positiv

vs.

negativ). For at opsummere resultaterne fra opdagelse og udvidelsen analyser, data-pooling og metaanalyse blev udført. De sammenfattende yderste periferi og 95% CIs blev beregnet ved hjælp af en fast effekt model og heterogenitet blev evalueret af Cochran Q statistikker [19].

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SAS-software-version 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina) og Plink softwareversion 1,06 (https://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink) [20]. Meta-analyser blev udført ved hjælp af STATA version 10 (Stata, College Station, TX).

Resultater

Tabel 1 opsummerer grundlæggende karakteristika af undersøgelsens deltagere i hver fase. Gastric kræfttilfælde viste signifikant højere CagA seropositivitet (

s

= 0,03 i discovery fase,

s

= 0,09 i forlængelse fase og

s

= 0,02 blandt de samlede emner) .

H. pylori

infektion, VacA seropositivitet og rygning status var også højere blandt gastrisk kræfttilfælde (tabel 1).

I den primære scanning af opdagelsen sæt, af de 362 SNPs valgt fra CagA-relaterede gener i signaltransduktionsvejen blev 24 SNPs i otte gener, ERK, Dock180, C3G, Rap1, Src, CrkL, Mek og CRK, signifikant associeret med mavekræft risiko i det indre SNP analyse (

s

0,01). Disse SNPs viste signifikante gen-dosis effekter i den lineære trend test og var signifikant associeret med en øget risiko for mavekræft (OR = 2,83, [95% CI: 1,42-5,65] for ERK rs5999749, OR = 1,90, [95% CI : 1,18-3,05] for Dock180 rs9418677). Bortset Dock180 rs9418677 og Rap1 rs17028287, var de fleste SNPs nedstrøms fra CagA-Crk signalering (Dock180, C3G, Rap1 og Mek) signifikant associeret med en nedsat risiko for mavekræft (tabel 2).

I udvidelse fase, alle associationer mellem de valgte SNPs og gastrisk kræftrisiko blev relativt svækket. ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 viste signifikant gen-dosis effekt for mavekræft (OR = 1,40, [95% CI: 1,04-1,89]; OR = 0,65, [95% CI: 0,44-0,94]; OR = 0,61, [95% CI: 0,46-0,81], henholdsvis). I sidste kombineret analyse, der omfattede opdagelsen og udvidelse analyser blev estimater af ERK rs5999749 risiko signifikant associeret med mavekræft i både den samlede analyse og meta-analyse (OR = 1,57, [95% CI: 1,20-2,07]; OR = 1,56, [95% CI: 1,19-2,06], henholdsvis). Desuden viste Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 signifikant nedsat risiko for mavekræft i begge analyser (OR = 0,60, [95% CI: 0,42-0,84], OR = 0,61, [95% CI: 0,43 til 0,87] for Dock180 rs4635002 ELLER = 0,59, [95% CI: 0,45-0,77], OR = 0,59, [95% CI: 0,45-0,76] for C3G rs7853122). Der var ingen heterogenitet på tværs af studier (Cochran Q test,

s

0,05) med undtagelse af rs10901081 (

s

= 0,040) (tabel 3)

Discussion

i vores etapevis genetisk analyse, tre SNP’er, ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 viste stærke associationer med mavekræft og kan være vigtige regulatoriske faktorer i CagA signaltransduktionsvejen.

Ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK), også kendt som mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), er et vigtigt integration punkt for flere cellulære signaler, der regulerer forskellige oncogene responser. ERK signalvej interagerer med en lang række substrater, herunder proteinkinaser, phosphataser, cytoskeletale komponenter, apoptose regulatorer, og en række andre signalsystemer-relaterede molekyler [21]. CagA signalering er en af ​​de involverede i ERK signal kaskaden streams. Talrige undersøgelser har rapporteret, at CagA-positive

H. pylori

kan aktivere ERK i gastriske epitelceller at fremme uhensigtsmæssige cellulære funktioner [11], [21], [22], [23]. Desuden samspillet mellem CagA og signaltransduktion proteiner fremmer ERK signalering sammen med Ras, Mek og NF-kB, overtalelse gastrisk carcinogenese. I cellulære mekanismer synes ERK at være involveret i en lang række forskellige cellulære processer. Således kan værten genet af ERK-protein være en vigtigere rolle for proteinekspression og kapacitet. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at ERK rs5999749 primært er valgt i SNP-baseret analyse og bevarer sin stærke association med gastrisk cancer i de endelige kombinerede analyser. Dette understøtter, at dens genetiske effekt kan spille en afgørende rolle i gastrisk carcinogenese lig med dens protein aktivitetsniveauet på celleniveau stadie.

Dock180, synonymt med en dedicator af cytokinese 1, er et 180 kDa protein nedstrøms-kombinere molekyle af Crk og up-regulator af Rac1 [24]. Det modulerer forskellige funktioner, herunder celle spredes, celle migration, og actin cytoskeletorganisation gennem aktivering af Rac1 [24], [25], [26], [27], [28]. Dette protein er en af ​​de Crk-downstream proteiner involveret i den kaskade af CagA og Crk signalering gennem Crk-Codk180-elmo pathway [9]. Tilsvarende C3G kendt som Rap guanin nukleotid udveksling faktor (GEF) 1 (RAPGEF1) også interagerer med Crk [29]. Tidligere undersøgelser viste, at Crk-C3G-Rap1 signalering kan aktivere ERK kaskade og inducere apoptose, cellevækst, migrering, adhæsion og dødelighed [30], [31], [32]. I human carcinogenese, den C3G genet synes at spille en afgørende rolle i sig selv. Ændring af C3G genetisk aktivitet via amplifikation eller methylering er forbundet med adskillige cancertyper såsom lunge-, mave- og gynækologisk cancer [33], [34]. Selv om det ikke er præcis velkendt, om de genetiske varianter af Dock180 og C3G genet er forbundet med gastrisk carcinogenese, vores undersøgelse tyder adskillige SNPs i disse gener, især rs4635002 og rs7853122, er signifikant associeret med risiko for mavekræft, og kan således være en modtagelig gen i udviklingen af ​​mavekræft.

Baseret på de foreliggende resultater og gennemgang af cellulære mekanismer [3], [9], [11], [21], [22], [23], [24], [30], kan CagA onkogenicitetsstudie induceret ved aktivering af ERK signalvejen blive infered (figur 1). Den CagA interaktion med bindende molekyler, såsom Src, Crk, Grb2 og SHP-2 stimulerer downstream signaler i ERK kaskade forbundet med afvigende cellulære funktioner, der fører til gastrisk carcinogenese. Under denne proces kan de genetiske virkninger af ERK, Dock180 og C3G spille kritiske roller lig med deres protein aktiviteter. Disse resultater giver støtte til den genetiske og cellulære betydning af disse molekyler.

CagA interaktion kan stimulere de efterfølgende signaler i ERK kaskade forbundet med afvigende cellulære funktioner, der fører til gastrisk carcinogenese. I denne proces, de genetiske virkninger af ERK, Dock180 og C3G spiller kritiske roller svarende til deres protein aktivitetsniveau på celleniveau stadie.

Vores genetisk analyse præsenteret plausibel dokumentation om genetiske varianter af ERK signaltransduktion pathway aktiveret af CagA, men adskillige begrænsninger bør bemærkes. Det første er antallet af forsøgspersonerne var utilstrækkelig til at sikre statistisk styrke til at vurdere den nøjagtige sammenhæng mellem udvalgte SNP’er og mavekræft risiko. For det andet, på grund af den lille stikprøvestørrelse og mangel på hjerte-mavecancerpatienter (mindre end 5%), kunne vi ikke foretage stratificeret analyse efter mavekræft typen, hjerte

vs.

Ikke-kardial. Derfor bør resultaterne fortolkes med forsigtighed.

Denne undersøgelse viser, at gener involveret i ERK signaltransduktionsvejen aktiveret af CagA kan ændre risikoen for mavekræft. ERK, kan Dock180 og C3G gener spiller vigtige roller i udviklingen af ​​mavekræft. Replication studier i andre populationer vil tillade os at belyse gastrisk kræft patologiske mekanismer. Yderligere biologiske undersøgelser fokuserede på disse gener kan afklare deres roller i gastrisk carcinogenese.