PLoS ONE: Den 4C5 celleimpermeable Anti-HSP90 antistof med Anti-Cancer aktivitet, er sammensat af en enkelt lys kæde Dimer

abstrakt

MAb 4C5 er en celle uigennemtrængelig, anti-HSP90 murint monoklonalt antistof, der oprindeligt produceret under anvendelse af hybridomteknologi. Vi har tidligere vist, at mAb 4C5 specifikt genkender både α- og i mindre grad β-isoform af HSP90. Derudover

in vitro

in vivo Salg undersøgelser viste, at ved selektivt at inhibere funktionen af ​​celleoverflade- HSP90, mAb 4C5 væsentlig grad hæmmer cancercelleinvasion og metastase. Her beskriver vi rekonstituering af mAb 4C5 i en mus-human-kimære. Vigtigere rapporterer vi at mAb 4C5 og følgelig dens kimære modstykke er fuldstændig blottet for tung kæde og består kun af en funktionel kappa let kæde dimer. Det kimære antistof er vist at bevare den oprindelige antistofs specificitet og funktionelle egenskaber. Det er således i stand til at inhibere funktionen af ​​overfladen HSP90, fører til reduceret invasion cancercelle

in vitro

. Endelig præsenterer vi

in vivo

beviser for, at den kimære 4C5 signifikant hæmmer metastatiske depositum dannelsen af ​​MDA-MB-453 celler i lungerne af SCID-mus. Disse data antyder, at et kimært kappa-let kæde-antistof kunne potentielt anvendes som et anti-cancer middel og således indfører en hidtil ukendt type af antistoffragment med reducerede eventuelle skadelige immunogene virkninger, i kræftbehandling

Henvisning:. Sidera K, El Hamidieh a, Mamalaki a, Patsavoudi E (2011) Den 4C5 celleimpermeable Anti-HSP90 antistof med Anti-Cancer aktivitet, er sammensat af en enkelt lys kæde dimer. PLoS ONE 6 (9): e23906. doi: 10,1371 /journal.pone.0023906

Redaktør: Paul C. Driscoll, MRC nationale institut for medicinsk forskning, England

Modtaget: Maj 11, 2011; Accepteret: 28 juli 2011; Udgivet 1. september, 2011

Copyright: © 2011 Sidera et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Heat shock protein 90 (HSP90) betragtes som en meget attraktivt lægemiddel-mål for kræftbehandling, da de fleste af sine klient proteiner spiller en vigtig rolle i erhvervelse af og /eller opretholdelse af den maligne fænotype [1] – [4]. For nylig har vi og andre identificeret en pulje af HSP90 på celleoverfladen [5] – [8], hvor det viste sig at deltage i cancercelleinvasion og metastase [9] – [11]. Stigende beviser fortsætter med at styrke forestillingen om en omfattende fænomen ekstracellulær HSP90 chaperoning, impliceret i kræft progression og metastatisk spredning [12] – [16] og dermed støtte udviklingen af ​​inhibitorer som specifikt rettet mod celleoverfladen HSP90. MAb 4C5 er en celleimpermeable murint monoklonalt antistof produceret under anvendelse af hybridomteknologi [17], som specifikt genkender både α og i mindre grad β isoform af HSP90 [8]. MAb 4C5 blev oprindeligt vist at inhibere celle migrationsprocesserne

in vitro

under udviklingen af ​​nervesystemet [18], [19] ved at påvirke actin cytoskeletal omarrangering og dannelse af motile strukturer såsom lamellipodia [8], [20]. Efterfølgende beviser blev præsenteret som viser, at ved at binde selektivt til overfladen pulje af HSP90, mAb 4C5 reducerer melanom celleinvasion og metastase [11] betydeligt. Endvidere blev mAb 4C5 vist at inhibere den ekstracellulære interaktion mellem HSP90 og vækstfaktorreceptor ErbB-2 i MDA-MB-453 brystcancerceller, hvilket fører til forringet nedstrøms signalering og reduceret kræft cellemotilitet og invasion [21]. Endelig blev mAb 4C5 vist at hæmme en funktionel interaktion mellem udskilt HSP90 og de inaktive former af metalloproteinaser 2 og 9, der er nødvendige for de enzymer, ‘aktivering, som er afgørende for kræftcellen invasion og ekstravasation [14]. Disse kombinerede data antydede, at den unikke evne mAb 4C5 til specifikt at inhibere den ekstracellulære pool af HSP90 uden at påvirke den brede vifte af vigtige intracellulære roller denne chaperone kan have kliniske fordele i behandlingen af ​​humane maligniteter. Men murine mAb’er ikke udgøre ideelle terapeutiske midler, da deres potentielle immunogenicitet udgør en begrænsning for deres kliniske anvendelse. Anvendelsen af ​​muse mAb’er mod human terapi er blevet mulig ved fremkomsten af ​​rekombinante DNA-teknologier, som har ført til udviklingen af ​​kimære og humaniserede antistoffer, som udviser reduceret immunogenicitet [22] uden noget større tab i affinitet, især i tilfælde af kimære antistoffer [23], [24].

i den nuværende arbejde, vi beskriver kloningen og sekventeringen af ​​mAb’et 4C5 gener fra det afsendende hybridomcellelinje og vellykket konstruktion af et funktionelt muse-human-kimære, som er vist sig at bevare egenskaberne af det parentale antistof. Vigtigere rapporterer vi at mAb 4C5 er helt blottet for tung (H) -kæde og består af kun en funktionel kappa let immunoglobulinkæde dimer og dens egenskaber kan blive gentaget et rekombinant protein, der kun indeholder denne lette (L) -kæde polypeptid. Endelig udviser vi den potentielle terapeutiske effektivitet af denne hidtil ukendte type antistoffragment.

Resultater Salg

MAb 4C5 er et antistoffragment helt blottet for en tung kæde

Den elektroforetiske motilitet af mAb 4C5 studeret under reducerende og ikke-reducerende SDS-PAGE afslørede, at det ikke er en konventionel IgG-molekyle. Mere specifikt når oprensede mAb 4C5 blev underkastet reducerende SDS-PAGE, efterfulgt af immunblotting med et anti-Fab, vi ikke observere den typiske 25 kDa og 50 kDa bånd svarende til L- og H-kæde, henholdsvis af en konventionel IgG-antistof, men i stedet et enkelt bånd ved ca. 25 kDa (fig. 1A). Interessant en identisk 25 kDa bånd blev opnået efter immunoblotting med et anti-kappa-L-kæde-antistof (fig. 1A). Således efter ikke-reducerende elektroforese immunblotting med begge disse standard-antistoffer, viser mAb 4C5 at være betydeligt mindre end en konventionel IgG1 molekyle, da det migrerede ved ca. 50 kDa. (Fig. 1A). Endelig blev ingen immunreaktivitet detekteret efter elektroforese af mAb 4C5 under både reducerende og ikke-reducerende betingelser, efterfulgt af immunoblotting under anvendelse af et anti-Fcy (fig. 1A). Disse kombinerede data viste, at mAb 4C5 enten kan mangle en del af dens H-kæde, eller at det er fuldstændig blottet for H-kæde. For yderligere at udforske disse muligheder vi næste udført northern blot-analyse under anvendelse af et IgG1-H-kæde-sonde. RNA afledt af hybridomceller der producerer et intakt IgG1 immunoglobulin navngivet 2D10 tjente som positiv kontrol. I modsætning til den positive kontrol blev ingen radioaktivitet påvist efter hybridisering af RNA’er afledt fra mAb 4C5 hybridomet og NSO myelomaceller (negativ kontrol) (fig. 1B), hvilket indikerer, at mAb 4C5 helt kan mangle en H-kædegen. Dette blev yderligere bekræftet ved H-kæde PCR-amplifikation eksperimenter. Til amplifikation af H-kæde-cDNA af mAb 4C5, et panel af otte mus universelle primere og en polyA + primer henholdsvis rettet mod 5′- 3′-enderne af mRNA, blev testet i flere separate PCR-reaktioner. Under alle forhold testet ingen amplifikation af en specifik H-kæde produkt blev observeret (data ikke vist). Disse kombinerede data antydede at mAb 4C5 er blottet for H-kæden og derfor vi fortsatte til rekombinant ekspression af antistoffet L-kæden alene for at undersøge dens egenskaber.

A. Elektroforetisk analyse af mAb 4C5, efterfulgt af immunoblotting med et anti-muse-kappa-kæde, et anti-muse-Fab og et anti-Fcy-antistof. Intakt IgG1 immunoglobulin produceret af 2D10 hybridomaceller tjener som positiv kontrol. Under reducerende elektroforese efterfulgt af western blot med anti-Fab-antistof, observeres en enkelt 25 kDa-immunoreaktive bånd, i stedet for de 25- og 50-kDa bånd svarende til L- og H-kæde henholdsvis af et intakt IgG1 . Dette 25 kDa-båndet er identisk med båndet svarende til den kappa L-kæde som vist ved Western blot med anti-muse-kappa-kæde antistof. Under-ikke-reducerende elektroforese efterfulgt af western blot med både anti-kappa- og anti-Fab-antistoffer, er mAb 4C5 vist at migrere ved ca. 50 kDa, og ikke ved 150 kDa som forventet for et intakt IgG1 molekyle. Nr mAb 4C5 immunoreaktivitet detekteres efter elektroforese under både reducerende og ikke-reducerende betingelser efterfulgt af western blot med et anti-Fcy-antistof. I tilfælde af IgG1 immunoglobulin under de samme betingelser et 50 kDa og et 150 kDa bånd observeres, henholdsvis. B. nr radioaktiviteten detekteres efter northern blot-analyse af 4C5 hybridoma-afledt RNA med en H-kæde radiomærket probe. RNA afledt af IgG1-producerende 2D10 hybridomceller og NSO myelomaceller fungerede som positiv og negativ kontrol, henholdsvis.

Konstruktion af den kimære L- kæde antistof

Den oprindelige forstærkning af mAb 4C5 kappa-kædegen fra første streng cDNA template blev udført ved anvendelse universelle muse L-kæde-primere ifølge Barbas [25]. PCR-produktet svarende til den fulde længde mab 4C5 L-kæde, blev derefter subklonet ind i pComb3H vektoren. Sekvensanalyse af rekombinant L-kæde (rec-4C5) afslørede, at det tilhører kappakæden undergruppe I [26] (fig. 2).

Nukleotid- og aminosyresekvenserne af det L-kæde variable region af mAb 4C5.

kimære L-kæde-antistof (lm-4C5) blev konstrueret ved at erstatte musen LCκ kodende region med den tilsvarende menneskelige LCκ insert. Sekvensen analyse af flere rekombinante kloner bekræftede den vellykkede konstruktion af det kimære muse-humant antistof.

Både rec-4C5 og CH-4C5 blev udtrykt i det bakterielle periplasmatiske rum og oprenses som beskrevet i Materialer og Metoder. De elektroforetiske motilities af de oprensede antistoffer blev testet under reducerende og ikke-reducerende betingelser og blev fundet at svare til den tilsvarende motilitet af det oprindelige mAb 4C5-antistof (fig. 3A).

A.

Venstre panel:

SDS-PAGE af oprensede antistoffer under reducerende betingelser efterfulgt af Coomasie Brilliant Blue-R-farvning afslørede i alle tilfælde en cirka 25 kDa bånd svarer til L-kæden.

Right panel:

Under ikke-reducerende betingelser antistofferne er vist at migrere som en L-kæde dimer. B. Western blot af MDA-MB-453-cellelysater under anvendelse af mAb 4C5, rec-4C5, CH-4C5 og en kommerciel anti-HSP90α antistof, der tjener som positiv kontrol. I alle tilfælde er observeret en enkelt 90 kDa immunoreaktivt bånd svarende til HSP90. C. Immunfældning i MDA-MB-453-cellelysater med anti-HSP90α, efterfulgt af immunoblotting med enten det murine eller de rekombinante antistoffer. I alle tilfælde er observeret et enkelt immunoreaktivt bånd. D. Reverse immunopræcipitationsforsøg i MDA-MB-453-cellelysater under anvendelse af mAb 4C5, rec-4C5 og CH-4C5, efterfulgt af western blot med anti-HSP90α. I alle tilfælde er observeret et enkelt immunoreaktivt bånd indikerer, at begge rekombinante antistoffer genkender HSP90.

ch-4C5 specifikt genkender HSP90

For at udforske specificiteten af ​​antistofferne, western blot analysen blev foretaget i MDA-MB-453 breast cancer cellelysater under anvendelse af et kommercielt polyklonalt anti-HSP90α antistof (Chemicon International, USA), mAb 4C5, rec-4C5 og CH-4C5. I alle tilfælde blev der observeret et enkelt identisk immunreaktivt bånd (fig. 3B), bekræfter, at både rec-4C5 og lm-4C5 bevarer specificitet fædrene mAb 4C5. Dette resultat blev yderligere bekræftet ved immunopræcipitation eksperimenter udført i præ-blokerede MDA-MB-453-cellelysater under anvendelse af anti-HSP90α, efterfulgt af immunoblotting med mAb 4C5, rek-4C5 eller CH-4C5. I alle tilfælde blev der observeret en enkelt immunoreaktivt bånd, hvilket viser, at det kimære L-kæde specifikt at genkende HSP90 (fig. 3C). Det samme resultat blev opnået, når immunfældning blev udført under anvendelse mAb 4C5, rec-4C5 og CH-4C5 efterfulgt af western blot med anti-HSP90α antistof (fig. 3D). I alle eksperimenter en irrelevant muse-IgG blev anvendt som negativ kontrol.

lm-4C5 er celle-uigennemtrængeligt og påvirker ikke funktionen af ​​intracellulære HSP90

For at undersøge, om lm-4C5 binder til overfladen HSP90 blev ufikserede MDA-MB-453-celler inkuberet med enten rec-4C5 eller CH-4C5 mens i kultur. Således er antistofferne havde kun adgang til den udvendige overflade af cellerne. Efter inkubation blev cellerne behandlet til indirekte immunofluorescens ved anvendelse af en fluorescens-mærket sekundært antistof. Den observerede typiske punktformig immunfarvning bekræftet celleoverfladen mærkning (fig. 4A). Lignende resultater blev opnået, når anvendelse af anti-HSP90α og mAb 4C5 (fig. 4A). Det er bemærkelsesværdigt, at på samme måde som mAb 4C5, CH-4C5 samt rec-4C5 også anerkende den intracellulære pulje af HSP90 som påvist ved immunofluorescens efter fiksering og permeabilisering af MDA-MB-453-celler (fig. 4B). Endelig bindingen af ​​antistoffer til at leve MDA-MB-453-celler blev overvåget ved forskellige tidsintervaller. Som vist i fig. 4C, på samme måde som mAb 4C5, rec-4C5 og CH-4C5 blev ikke internaliseret og forblev bundet på celleoverfladen i op til 24 timer i kultur.

A. Immunofluorescens mærkning af MDA-MB-453 celler ved hjælp af både rec-4C5 og lm-4C5. Den punktformig immunolabeling angiver overfladen pulje af HSP90. Negative kontroller blev udført ved anvendelse af et antistof mod det intracellulære protein β tubulin (data ikke vist). Scale bar: 20 pm B. immunofluorescens detektering af intracellulær HSP90 i faste MDA-MB-453-celler, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100. I lighed med det murine antistof, rec-4C5 og lm-4C5 genkender den intracellulære pulje af HSP90. Scale bar: 20 pm C. Til påvisning af antistof-internalisering blev levende celler inkuberet med antistoffer for forskellige tidsintervaller, derefter fikseret, permeabiliseret og fluorescensmærket. Nr internalisering af mAb4C5, rec-4C5 og CH-4C5 observeres selv efter 24 timer inkubation. I modsætning kunne detekteres anti-HSP90α antistof intracellulært efter 24 timer inkubation. Målestok: 20 um D. MDA-MB-453 cellelysater, behandlet med mAb 4C5, blev rec-4C5, CH-4C5 og anti-HSP90α analyseret ved western blot med antistoffer mod ErbB2, Akt, cRaf og HSP90α. Actin tjente som en belastning kontrol. Tilstedeværelse af mAb 4C5, rec-4C5 og lm-4C5 påvirkede ikke niveauer af kinaser sammenlignet med kontroller. I modsætning cellen gennemtrængelig anti-HSP90α antistof reducerede niveauer af ErbB2, Akt og ku betydeligt.

Betydningen af ​​lm-4C5 celle-uigennemtrængelighed blev undersøgt ved at overvåge niveauet af en delmængde af intracellulær HSP90 klient proteiner. Til dato mere end 100 intracellulære HSP90 klient proteiner er blevet identificeret. Cell-permeable HSP90 hæmmere inducere nedbrydningen af ​​disse proteiner, fordi deres stabilitet afhænger af intracellulær HSP90 funktion [3]. Da vores data foreslog, at mAb 4C5 og efterfølgende rec-4C5 og lm-4C5 er celle uigennemtrængelige, vi undersøgte deres evne til at påvirke stabiliteten af ​​tre velkarakteriserede HSP90 klient proteiner, Akt, Craf og ErbB-2. Efter inkubation af MDA-MB-453 celler med forskellige koncentrationer af mAb 4C5, rec-4C5 og CH-4C5, blev niveauerne af Akt, cRaf og ErbB2 overvåges ved Western blotting. Som vist i figur 4D disse antistoffer påvirkede ikke steady state niveauer af nogen af ​​de undersøgte kinaser. I modsætning, når cellerne blev inkuberet med cellen permeable anti-HSP90α, ekspressionsniveauer af disse kinaser blev væsentligt reduceret (fig. 4D).

CH-4C5 inhiberer cancercelleinvasion

Tidligere undersøgelser har vist, at mAb 4C5 inhiberer MDA-MB-453 breast cancer og B16 F10-melanom celleinvasion i en sårhelende assay [11], [21]. For at bekræfte, at CH-4C5 udviser den samme funktionelle egenskab, udførte vi

in vitro

sårheling assays ved anvendelse MDA-MB-453 og B16 F10 cancerceller. Kontrolkulturer dyrkedes enten i dyrkningsmedium alene, eller i dyrkningsmedium indeholdende 200 ug /ml af det irrelevante BM88 antistof. Ingen statistisk signifikant forskel blev observeret mellem de to typer af kontrol anvendte. Gennemsnitsværdien for de to typer af kontrol blev betragtet som 100% af sårlukning. Som vist i fig. 5A, B tilstedeværelsen af ​​lm-4C5 i dyrkningsmediet reducerede signifikant udvide af MDA-MB-453 cancercelleinvasion inden hullet migration efter 24 timer, sammenlignet med kontrolkulturer. Mere specifikt tilstedeværelsen af ​​lm-4C5 resulterede i en 46% hæmning af sårlukning, der svarede til den, der opnås, når det anti-HSP90α, samt mAb 4C5 og rec-4C5 blev inkluderet i dyrkningsmediet (fig. 5A , B). Søjlerne i fig. 5B repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± SEM. Inden for en enkelt eksperiment blev hver betingelse testet tredobbelt. Lignende resultater blev opnået under anvendelse af B16 F10 melanomceller og stigende koncentrationer af lm-4C5 hvilket gav en dosisafhængig inhibering af celleinvasion (fig. 5C, D). Det er vigtigt at bemærke, at i sårhelende assay virkningen af ​​lm-4C5 er rettet mod celleinvasion og ikke Celleproliferation som vurderet af en uafhængig MTT assay (data ikke vist). Dette er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data, der viser, at tilstedeværelsen af ​​mAb 4C5 i dyrkningsmediet af B16 F10 [11] og MDA-MB-453 [21], ikke påvirker celleproliferation, da lav BrdU inkorporering blev observeret med nogen åbenbare forskelle i fravær eller nærvær af antistoffet.

A. Sårheling assay. Fotografier repræsenterer fase-kontrast opnået ved nul tid (venstre panel) og 24 timer (højre panel) efter scratch dannelse, viser MDA-MB-453-celle migration enten i kontrolkulturer eller kulturer, herunder anti-HSP90α, mAb 4C5, ind- 4C5 eller lm-4C5. Målestok: 200 um. B. Kvantitativ effekt af antistoffer om lukningen af ​​såret. Tilsætning af 200 ug /ml anti-HSP90α og mAb 4C5 i dyrkningsmediet resulterede i en 48% og 55% reduktion af sårlukning henholdsvis sammenlignet med kontrolkulturer, der blev anset som resulterer i 100% sårlukning. Tilsætning af 200 ug /ml rec-4C5 og CH-4C5 i dyrkningsmediet resulterede i et 46% og 46% inhibering af sårlukning hhv. Statistisk signifikans af forskelle blev vurderet ved Students t-test. Tilstedeværelsen af ​​anti-HSP90α, mAb 4C5, rek-4C5 eller CH-4C5 havde en statistisk signifikant virkning på sårlukning (p 0,01 i hvert tilfælde). C. fasekontrast billeder opnået ved tiden nul (venstre panel) og ved 24 timer efter bunden formation (højre panel), der viser B16 F10 melanomacellelinie invasion i en sårhelende assay i nærvær af 200 ug /ml CH-4C5. Målestok: 200 um. D. Kvantitativ virkningen af ​​stigende koncentrationer af lm-4C5 på invasionen niveau af B16 F10 melanomceller. Nærvær af 50 pg /ml lm-4C5 resulterede i 15% inhibering af invasion, mens tilsætning af 100 ug /ml og 200 ug /ml 4C5 ch resulterede i 21% og 43% inhibering af migration, henholdsvis i forhold til kontrolkulturer, der var betragtes som resulterende i 100% sårlukning. E. Visualisering af døde celler ved anvendelse af trypanblåt. I lm-4C5 behandlede kulturer, celledød incidens svarer til den observerede i kontrolkulturerne. I modsætning hertil i kulturer behandlet med anti-HSP90α antistof, er en meget større antal celler farvet med Trypan blå, hvilket indikerer en øget forekomst af celledød Scale bar, 30 um. F. Kontrol og lm-4C5 behandlede celler blev fikseret permeabiliseret og farvet med fluorescerende mærket phalloidin. Scale bar 40 pm G. Større forstørrelse viser phalloidin-farvning (F-actin). Ch-4C5 blokerer effektivt spredning af lamellipodia. Målestok: 16 um

På dette tidspunkt bør det bemærkes, at den inhibitoriske virkning af anti-HSP90α antistof på MDA-MB-453 invasion sats var i stor del på grund af øget celledød. som bedømt ved trypanblåt-farvning, som selektivt farver døde celler (fig. 5E). I modsætning hertil, når kulturer blev behandlet med mAb 4C5 og CH-4C5, forekomsten af ​​celledød var identisk med de observerede i kontrolkulturerne (fig. 5E). Dette resultat understøtter endvidere, at CH-4C5, i modsætning til cellen-permeable anti-HSP90α antistof, er celleimpermeable og påvirker ikke den intracellulære pulje af HSP90, hvilket er vigtigt for cellens overlevelse.

Endelig disse kulturer blev undersøgt med hensyn til actin re-arrangement dynamik ved hjælp fluorescensmærket phalloidin. MDA-MB-453 celler udsat for lm-4C5 var mindre spredning i forhold til celler i kontrolkulturer, og deres morfologi var tegn på ikke-motile celler. Når endvidere visualiseres ved en højere forstørrelse, den lamellipodia i behandlede kulturer var mindre udviklet og mindre spredt ud i forhold til lamellipodia i kontrolkulturer (fig. 5 F, G). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data vedrørende effekten af ​​mAb 4C5 på actin re-arrangement og lamellipodia udvikling [21].

ch-4C5 reducerer MDA-MB-453 metastatisk aflejring i lungerne af SCID mus

Vi næste forsøgt at undersøge

in vivo

effekt af lm-4C5 på metastatiske adfærd MDA-MB-453 cancerceller. Til dette formål, MDA-MB-453-celler blev forbehandlet med eller uden 200 ug /ml lm-4C5 og derefter mærket med det fluorescerende farvestof DiO og injiceret intravenøst ​​i SCID-mus via halevenen. Tolv timer efter injektion blev musene aflivet, og den metastatiske aflejringer af MDA-MB-453-celler blev sporet og evalueret i lungerne hos både kontrol- og lm-4C5-behandlede grupper. Som vist i fig. 6A, blev et signifikant fald i aflejringen af ​​MDA-MB-453-celler detekteret i lm-4C5-behandlede mus i sammenligning med kontroldyrene. Mere specifikt kvantificering af den metastatiske aflejringsdannelse viste en 38% inhibering i lm-4C5-behandlede mus sammenlignet med kontrolmus (Fig. 6B).

Kontrol eller CH-4C5 behandlet MDA-MB-453-celler blev mærket med det fluorescerende farvestof DiO og injiceret i SCID-mus som beskrevet i Materialer og Metoder. Evaluering af metastatiske aflejringer blev udført flere timer senere. A. Repræsentative snit af frosset lungerne af kontrol og lm-4C5 behandlede mus. Pilene viser MDA-MB-453 celler farvet med DiO stede i lungevævet. Et signifikant fald i aflejring af cancerceller blev observeret i lungerne hos lm-4C5 behandlede mus. Scale bar: 100 pm B. Kvantitativ effekt af lm-4C5 på den metastatiske aflejring af MDA-MB-453 celler i lungerne, viste en 38% hæmning i sammenligning med kontroldyr. Søjlerne repræsenterer gennemsnittet af to uafhængige forsøg ± SEM. Statistisk signifikans af forskelle blev testet ved Students t-test (p 0,01).

Discussion

I denne undersøgelse beskriver vi kloningen og sekventeringen af ​​et anti-HSP90 murine monoklonale antistof , opkaldt mAb 4C5. Endnu vigtigere er, viser vi, at mAb 4C5 er ikke en konventionel IgG-molekyle, men i stedet er det helt blottet for en H-kæde og kun består af en kappa let kæde dimer. Dette resultat blev oprindeligt støttet ved SDS-PAGE elektroforese under denaturerende og ikke-denaturerende betingelser, hvilket viser, at mAb 4C5 migrerer ukonventionelt ved ca. 26- og 50-kDa. Derudover, når totalt RNA isoleret fra mAb 4C5-producerende hybridomcellelinie blev underkastet Northern blot-hybridisering under anvendelse af et IgG1 H-kæde-cDNA radio-mærket probe, kunne påvises ingen radioaktivitet. Efter aftale med de ovenstående resultater, da vi forsøgte at forstærke H-kæde-cDNA ved hjælp universelle muse H-kæde primere vi kunne ikke isolere en H-kæde produkt i alle testede betingelser. Endelig blev den usædvanlige karakter af mAb 4C5 bekræftet over enhver tvivl, da det rekombinante kappa L-kæde udtrykt i bakterier viste sig at opretholde alle de egenskaber af faderlige antistof, herunder antigenbinding og

in vitro

hæmning af cancercelleinvasion.

Dette monoklonale antistof blev oprindeligt produceret ved immunisering af mus med en hjerne-afledt membran fraktion på 15 daggamle rotteembryoer [17], og det blev vist til specifikt at genkende og inhiberer funktionen af overflade HSP90 under celle migration processer [8]. Desuden blev mAb 4C5 vist signifikant reducere antallet af invasion og metastase af kræftceller. Mere specifikt blev det demonstreret, at dette antistof inhiberer melanom celleinvasion og metastase [11], samt interaktionen af ​​overfladen HSP90 med det ekstracellulære domæne af erbB-2, hvilket fører til forringet nedstrøms signalering og efterfølgende nedsat

in vitro

brystcancer celleinvasion [21]. Endnu senere, Stellas et al. [14], forudsat

in vitro

in vivo

beviser for, at mAb 4C5 indirekte hæmmer aktiveringen af ​​pro-gelatinaserne MMP-2 og MMP-9, der er nødvendige for kræftcellen invasion, ekstravasation og metastase. Disse kombinerede data støttede yderligere idéen om, at mAb 4C5 kunne være nyttig som en kræft terapeutisk og orienteret vores studier mod bestemmelsen af ​​aminosyresekvensen og rekombinant ekspression af dette antistof.

Det er velkendt, at murine antistoffer har begrænset bruge til

in vivo

terapi i mennesker på grund af deres immunogenicitet. I flere forekomster dette problem er blevet overvundet ved anvendelse af genteknologiske metoder til at producere kimære muse-humane og fuldt humaniserede antistoffer. Under hensyntagen til ukonventionelle karakter mAb 4C5 i kombination med det faktum, at under humanisering processen antistoffet affinitet ofte reduceres, vi næste rekonstituerede det murine mAb 4C5 til en funktionel muse-humant kimært version, der, ligesom det faderlige antistof, binder til overflade HSP90, er celle uigennemtrængeligt og hæmmer kræft celle invasion. Det kimære antistof, som blev manipuleret ved at erstatte Cκ- region af faderlige murine antistof med den tilsvarende humane CK-region blev vist at bevare specificitet og affinitet af den faderlige museantistof.

Det har været et generelt accepteret koncept, antistofmolekylet kræver både H- og L-kæder til sin fulde aktivitet [27]. Desuden er H-kæden menes at være den fremherskende bidragyder til den frie energi af antigenbinding mens bidraget fra L-kæden formodes at være begrænset [28], [29]. Sidstnævnte idé understøttes yderligere af det faktum, at cameloids besidder en klasse af fuldt funktionelle antistoffer helt mangler L-kæder, og som består af H-kæde dimerer [30], [31]. I sammenhæng med disse resultater, H-kæder alene blev vist at interagere med en række antigener på en specifik måde (omend med lavere affinitet end de intakte antistoffer), hvilket har ført til anvendelsen af ​​enkelt domæne antistoffer afledt af H-kæder [32] i forskning, bioteknologi samt humane lægemidler. I fortiden har der været sporadiske rapporter om antigenbinding ved L-kæder. De første eksempler på gratis berørte de såkaldte Bence-Jones proteiner inmmunoglobulin lette kæder. Disse blev rapporteret som L-kæde-dimerer udtrykt af myelomatose celler, der er indsamlet fra urin fra menneskelige patienter [33]. Desuden blev store mængder af L-kæder fundet at akkumulere i de ekstracellulære væsker og væv fra patienter med L-kæde-secernerende tumorer [34]. En kappa let kæde dimer med CD4 antigenspecificitet afledt fra en hybridomacellelinie blev beskrevet i 1987 af Ledbetter et al. [35], og i 1994 Mei Sun et al [36] rapporterede, at et oprenset L-kæden fra et monoklonalt antistof mod vasoaktivt intestinalt polypeptid (VIP) viste sekvens-specifik og høj affinitet binding til VIP. Følgelig Nishimura et al. [37] rapporterede produktionen af ​​et rekombinant λ let kæde udviser en signifikant højere aktivitet af binding til antigenet sammenlignet med det intakte antistof. Desuden er disse forfattere præsenterede dokumentation for, at dette rekombinante let kæde kunne tjene som et potentielt nyttigt redskab for klinisk anvendelse, såsom radio-immunoimaging og radio-immunterapi af lungekræft. Det er blevet også rapporteret at antistof L kæde dimerer produceret af en musehybridoma reagere med humant melanom væv [38]. I 1998 Pereira et al. [39] viste, at en enkelt L-kæde variable sekvens indeholder alle de determinanter nødvendige for cardiolipin binding, med en affinitet svarende til den i det intakte antistof. For nylig Dubnovitsky et al. [40] rapporterede, at det rekombinante V

L-domæne af et monoklonalt antistof mod ferritin bevaret sin antigenbindende funktion med en affinitet sammenlignelig med fuldlængde parentale antistof.

I det foreliggende arbejde vi har vist, at CH-4C5 er helt blottet for en tung kæde og består af en L-kæde dimer. lm-4C5 har en høj specifik aktivitet som påvist ved immunoblotting og immunofluorescens forsøg under anvendelse brystcancerceller. Desuden og ligeledes til den fædrene antistof lm-4C5 udviser funktion-blokerende egenskaber som bedømt af

in vitro

sårheling assay. Endelig bruger en

in vivo

assay vi har vist, at CH-4C5 reducerer metastatisk aflejring af MDA-MB-453 brystcancerceller i lungerne af SCID-mus.

Disse resultater giver en nyt perspektiv for den kliniske anvendelse af L-kæde-antistoffer i kræftbehandling. Rekombinante L-antistoffer har en række fordele i forhold til intakte antistoffer og V

H antistoffer når de er bestemt for humane lægemidler, dvs. relativt letkøbt og reproducerbar produktion, kvalitetskontrolprocedurer og hurtigere clearance fra kredsløbet. Endelig fra et klinisk synspunkt, overflade HSP90 tilvejebringer en hidtil ukendt og meget lovende ekstracellulære lægemiddelmål for effektiv behandling af metastatisk cancer. I denne sammenhæng evne lm-4C5 til selektivt at inhibere funktionen af ​​overfladen pulje af HSP90, som angivet ved

in vitro

in vivo

data præsenteret i det aktuelle arbejde, uden at forstyrre HSP90 intracellulær funktion, gør dette antistof fragment en potentiel kræft terapeutisk.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til den nationale og internationale retningslinjer og blev specifikt godkendt af Etisk Komité Hellenic Pasteur Institute (Permit No: K /533, Veterinary Directorate District of Attiki). SCID mus blev oprindeligt købt hos Jackson Laboratory, avlet og holdt under SPF forhold på Experimental Animal Unit Den Hellenske Pasteur Institute.