PLoS ONE: mitogen-aktiveret protein kinase kinase 4 (MAP2K4) Fremmer human prostatakræft Metastase

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) er den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA. Døden fra PCa resultater primært fra metastaser. Mitogenaktiveret proteinkinase kinase 4 (MAP2K4) overudtrykkes i invasive PCA læsioner i mennesker, og kan inhiberes af småmolekyle- lægemidler, der demonstrerer gunstig aktivitet i fase II-undersøgelser. Men MAP2K4 rolle i reguleringen af ​​metastatisk adfærd er kontroversiel og ukendt. For at undersøge, vi manipuleret humane PCA cellelinier, som overudtrykker enten vildtype eller konstitutiv aktiv MAP2K4. Orthotopisk implantation i mus demonstrerede MAP2K4 øger dannelsen af ​​fjerne metastaser. Konstitutiv aktive MAP2K4, men ikke vildtype, øger tumorstørrelse og cirkulerende tumorceller i blodet og knoglemarv. Supplerende

in vitro

undersøgelser etablere stabile MAP2K4 overekspression fremmer celle invasion, men påvirker ikke cellevækst eller migration. MAP2K4 overekspression øger ekspressionen af ​​varmechokprotein 27 (HSP27) protein og protease produktion, med den største virkning ved matrixmetalloproteinase 2 (MMP-2), både

in vitro

i muse tumorprøver. Endvidere MAP2K4-medierede stigninger i celleinvasion afhænger varmechokprotein 27 (HSP27) og MMP-2, men ikke på MAP2K4 umiddelbare downstream mål, p38 MAPK eller JNK. Vi viser, at MAP2K4 øger human PCa metastase, og langvarig overekspression inducerer langsigtede ændringer i celle signalveje, der fører til uafhængighed fra p38 MAPK og JNK. Disse resultater giver en mekanistisk forklaring på humane undersøgelser forbinder stigninger i HSP27 og MMP-2 til progression til metastatisk sygdom. MAP2K4 valideres som en vigtig terapeutisk mål for at hæmme humane PCa metastaser

Henvisning:. Pavese JM, Ogden IM, Voll EA, Huang X, Xu L, Jovanovic B, et al. (2014) mitogenaktiveret proteinkinase kinase 4 (MAP2K4) Fremmer human prostatacancer metastaser. PLoS ONE 9 (7): e102289. doi: 10,1371 /journal.pone.0102289

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

Modtaget: May 1, 2013; Accepteret: 17 Juni 2014; Udgivet: 14 juli 2014

Copyright: © 2014 Pavese et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) til RCB, CA122985 og prostata SPORE CA90386, og JMP, NIH T32 AG000260 “Drug Discovery Træning i aldersbetingede lidelser”, og af Walter S. og Lucienne Driskill Graduate Program i Life Sciences ved Northwestern University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret kræft i USA mænd, og den anden mest almindelige form for kræft død [1]. Mens over 90% af personer med lokaliseret PCa ikke vil dø af deres sygdom, dem med metastatisk sygdom har en terminal diagnose og langt de fleste vil dø af PCa [2]. Forstå, hvordan det metastatiske spredning af menneskelig PCa reguleres er af afgørende biologisk betydning. Denne viden vil give os mulighed for at identificere patienter med risiko, og dermed behov for indgreb, og vil danne grundlag for udviklingen af ​​målrettede terapeutiske strategier.

mitogen-aktiveret protein kinase kinase 4 (MAP2K4, også kendt som MKK4, MEK4 eller SEK1) er en dobbelt-specificitet proteinkinase, der phosphorylerer serin og threonin, samt tyrosinrester. MAP2K4 er et medlem af mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) signalvejen og typisk aktiverer to mål nedstrøms, p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK p38) og c-Jun N-terminal kinase (JNK) [3]. Rolle MAP2K4 i human PCa cancer progression, og udvikling af metastase i særdeleshed, er kontroversiel. MAP2K4 ligger på kromosomale segment 17p11.2, som kan tabes ved en hastighed på ca. 7-10% i humane epiteliale cancere, især ovarie- og brystcancer [4], [5] Af denne grund var det oprindeligt formodes at være en tumorsuppressor. I en rotte PCa-modellen ved anvendelse celler, der mangler en kromosomal segment indeholdende MAP2K4, specifik restaurering af MAP2K4 protein reduceret PCa metastase til lungen efter flanke injektion af disse celler [6]. I denne model, øget MAP2K4 også forsinket vækst metastatiske celler ankommer til lungerne, sandsynligvis på grund af G1 cellecyklusstop [7].

Men andre undersøgelser viser, at MAP2K4 formidler en pro-metastatisk fænotype, og støtte forestillingen om, at det ville øge metastase. MAP2K4 aktiverer p38 MAPK, som driver mange trin i den metastatiske kaskade, herunder epitelial til mesenkymale overgang (EMT), cellulær invasion, og metastatisk kolonisering (revideret i [8]). MAP2K4 ekspression forøges højkvalitets prostata intraepitelialneoplasi (HGPIN) læsioner i både den murine-baserede TRAMP model af spontan PCa, såvel som i humane prøver [9]. Desuden er MAP2K4 ekspression forøges i tidlig invasiv, dvs. PCa, læsioner i mennesker, og forøget MAP2K4 ekspression korrelerer signifikant med højere patologisk stadium [9]. Interessant nok i disse undersøgelser og andre, niveauer af MAP2K4 blev derefter reduceret i sent stadium metastase, hvilket indikerer, at MAP2K4 stigning er kritisk for de tidlige stadier af den metastatiske kaskade [10]. Denne indflydelse på tidlige trin bekræftes i

in vitro

studier. Brug af flere forskellige humane normale og cancer prostata cellelinjer og forbigående manipuleret udtryk for MAP2K4, vores gruppe viste, at MAP2K4 øger celle invasion, en kritisk indikation af metastatisk progression

in vitro

[11]. Vi identificerede også MAP2K4 som et vigtigt terapeutisk mål af små sammensatte hæmmere. Konkret har vi demonstreret, at MAP2K4 var det terapeutiske mål af den lille forbindelse, 4 ‘, 5,7-trihydroxyisoflavone (genistein), for sine virkninger på invasion inhibition [11], [12], og at genistein hæmmer human PCa metastase i en orthotopisk murin model [13]. Gennem en række beslægtede undersøgelser identificerede vi vejen, transformerende vækstfaktor (TGF) β → MAP2K4 → p38 MAPK → varmechokprotein 27 (HSP27) → matrixmetalloproteinase type 2 (MMP-2) → human PCa celleinvasion, og at det inhiberes af genistein [11] – [16]. Vi påviste også, at potentielle genistein indgivelse til mennesker med lokaliseret PCa nedsætter MMP-2-ekspression i prostatavæv [11]. Brug

in vivo

dyremodeller, ændret MAP2K4 udtryk kan ændre metastaser i andre menneskelige epiteliale kræftformer. Især har andre grupper vist MAP2K4 knockdown falder metastatisk tumorvækst i musemodeller for brystkræft og kræft i bugspytkirtlen [17], [18].

Da MAP2K4 s ændrede udtryk og prognostisk relevans i mennesker, dens

in vitro

virkninger på humane prostata celler og en varieret reaktioner på rotter og humane epiteliale cancer cellelinjer, er det vigtigt at specifikt bestemme MAP2K4 rolle i reguleringen af ​​metastatiske adfærd human PSA. Selvom MAP2K4 er et terapeutisk mål for genistein, genistein udøver mange forskellige effekter. Derfor trods genistein s hæmning af human PCa metastaser, ikke kan bestemmes rolle MAP2K4 i reguleringen metastase dannelse fra disse resultater. Usikkerheden på MAP2K4 rolle i reguleringen af ​​human prostatacancer metastaser øges yderligere ved undersøgelser på tværs af flere forskellige typer kræft, som understøtter enten en metastase suppressor [6], [7], [19] – [21], eller stimulerende rolle [9], [11], [17], [18]. Vigtigere, har ingen undersøgt MAP2K4 rolle i reguleringen af ​​metastatisk adfærd human PCa.

I den aktuelle undersøgelse, vi demonstrere flere nye fund. Første, MAP2K4 øget menneskelig PCa metastase. MAP2K4 øget tumorvækst

in vivo

, men ikke

in vitro

. Under trykket af kronisk udtryk, der emulerer den kliniske situation, MAP2K4 førte til en ny ledningsføring af celle signalveje. Dette resulterede i en bypass af umiddelbare downstream signalering proteiner, p38 MAPK og JNK. Vi identificerede en unik mekanisme for kompensation, hvorved MAP2K4 førte til en opregulering i ekspressionen af ​​HSP27 totalt protein. Dette vil til gengæld resulterede i højere absolutte niveauer af phosphoryleret HSP27, og stigninger i downstream MMP-2. Den MAP2K4-drevne metastatisk fænotype blev vist at være afhængig af HSP27 og dets nedstrøms effektor, MMP-2. Disse resultater viser, at MAP2K4 er en vigtig drivkraft for menneskelig PCa metastase, og de derved validere det som en terapeutisk mål for at hæmme PCa metastaser. De giver også en mekanistisk forklaring på kliniske studier forbinder stigninger i MAP2K4, HSP27 og MMP-2 udtryk for den fremtidige udvikling af metastaser.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Northwestern University (PHS Assurance # A3283-01). Alle operation blev udført under isofluran anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Cell Kultur og transfektion

PC3-M og LNCaP-celler blev holdt i RPMI 1640 medium suppleret med 2 mM L -glutamine, 10 mM HEPES-buffer, 50units /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (Life Technologies) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% carbondioxid. 1542CPTX celler blev holdt i keratinocyt SFM medium suppleret med 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES-buffer, 50units /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 10% føtalt bovint serum, 5 ng /ml EGF human rekombinant, 50 ug /ml oksehypofyseekstrakt (Life Technologies) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% carbondioxid.

MAP2K4 stabil transficerede celler blev skabt ved transfektion PC3-M, LNCaP, eller 1542CPTX celler, hvis oprindelse er tidligere beskrevet [22], med transit-LT1 transfektionsreagens (Mirus Bio LLC), og plasmid-DNA ifølge producentens anvisninger. Celler blev dyrket under G418-selektion betingelser, individuelle kolonier høstet og ekspanderet, som beskrevet tidligere af os [23]. I angivne eksperimenter blev resulterende individuelle klonale cellelinier derudover transficeret som ovenfor med GFP-ekspressionsplasmid, valgt under blasticidin vækstbetingelser, og derefter oprenset under anvendelse af sterilt cellesortering baseret på GFP-status. Cellelinier blev autentificeret ifølge fremgangsmåder beskrevet i American Type Culture Collection (ATCC) Technical Bulletin No. 8, cellelinie Verification Test Anbefalinger [24]. Specifikt celler fra lav passage (dvs., 15 passager) frosne stamopløsninger blev anvendt og blev genopfyldes efter 20 passager, celler undergik rutine mikroskopisk undersøgelse for at bekræfte ensartet og standard cellulær arkitektur og ingen mikrobiel infektion, og cellerne blev testet og fundet negative for mycoplasma infektion.

For knockdown eksperimenter, Dharmacon ON-Targetplus SMARTpool siRNA målrettet MAP2K4 (L-003574-00-0005), HSP27 (L-005269-00-0005), MMP-2 (L-005959- 00-0005), eller ikke-targeting siRNA (D-001810-10-05) blev transficeret ind i celler ved anvendelse Dharmafect Duo (T-2010, alle fra Thermo Scientific), sammen med pCMV-β-galactosidase (Agilent Technologies), og anvendes efter 48 timer, som beskrevet af os [11]

Reagenser og plasmider

følgende var købt:. antistoffer, SEK1 /MKK4 (# 9152), phospho-p38 MAPK (T180 /Y182) (# 4631), p38 MAPK (# 9212), phospho-SAPK /JNK (T183 /Y185) (# 4668), SAPK /JNK (# 9258), phospho-HSP27 (# 2401), HSP27 (# 2402) og GAPDH (# 2118), alle fra Cell Signaling Technology, og peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse og anti-kanin, fra GE Healthcare Biosciences; plasmider, vildtype og konstitutiv aktiv MAP2K4 (# 14615 og # 14813; Addgene) og GFP (Vivid farver pcDNA 6,2 /N-EmGFP-GW /TOPO, Invitrogen); kemiske inhibitorer, p38 MAPK inhibitor, SB203580 (Sigma-Aldrich) og tilhørende negativ kontrol, SB202474, og JNK Inhibitor II (SP600125), og JNK Inhibitor II Negativ kontrol (N

1-methyl-1,9-pyrazoloanthrone), alle fra EMD Millipore.

murin model for human Prostata Cancer metastase

Celler blev implanteret og fjernmetastaser kvantificeret som tidligere beskrevet af os, med modifikationer [13], [25]. Kort fortalt 2,5 × 10

5 celler blev implanteret i den ventrale prostata på 6-8 uger gamle Balb /c athymiske mus, fodret Harlan Teklad 2016S chow og vand

ad libitum

, og har til huse i en barriere facilitet med 12 timers lys /mørke-cykler. Efter 6 uger blev tumorvæv lynfrosset, lunger blev formalinfikseret /paraffinindlejret, og blod og knoglemarv blev dyrket i komplet RPMI 1640-medier med G418 i 10 dage, og tilstedeværelse af CTCs registreres.

Med 45 micron step-sektioner blev tilstødende 4-micron lunge vævssnit immunfarvet for GFP og med hematoxylin og eosin (H 15 gange sammenlignet med VC, i både WT-MAP2K4 og CA-MAP2K4 celler. MMP-9 havde markant øge 2-fold, men kun i WT-MAP2K4 celler. MMP-10 og MMP-13 var upåvirket. Derfor MAP2K4-medierede stigninger i invasion ikke skyldes ændringer i cellemigrering, men er associeret med ændringer i protease-ekspression, MMP-2 i særdeleshed. Dette er klinisk relevant, da MMP-2 kan nedbryde kollagen IV, en vigtig komponent i prostata væv, og er blevet forbundet med dårlig prognose, herunder udvikling af metastaser (revideret i [31]).

Vi næste undersøgt den forøgede tumorstørrelsen observeret i CA-MAP2K4 mus, fig 1E, for at bestemme om vækst ændres

in vitro

, fig 2E-F. I en fem dages

in vitro

MTT assay, sås ingen forskelle i cellevækst mellem grupperne, Fig 2E. I et 14-dages blød agar kolonidannelse assay, CA-MAP2K4 celler voksede lidt langsommere end VC og WT-MAP2K4 celler, men denne ændring var ikke signifikant, Fig 2F. Disse resultater viser, at under

in vitro

vækstbetingelser, hverken WT-MAP2K4 eller CA-MAP2K4 påvirker cellevækst.

MAP2K4 overekspression specifikt ændrer HSP27 phosphorylering og total protein udtryk

ovenstående resultater viser, at MAP2K4 relativt specifikt øger MMP-2. Forbigående modifikation af MAP2K4 regulerer MMP-2 og celleinvasion ved phosphorylering og aktivering af p38 MAPK [12]. Foruden p38 MAPK, kan MAP2K4 også enten aktivere JNK, eller begge proteiner, afhængig af modelsystemet [32]. JNK er ofte forbundet med ændringer i proliferation og apoptose som reaktion på stress i human PCa [33] – [35], men også med ændringer i cellulær migration og invasion [36], [37]. Vores hypotese derfor, at kronisk MAP2K4 ekspression ville øge aktivering af p38 MAPK og /eller JNK. Vi testede denne teori ved at undersøge phospho-p38 MAPK, -JNK1 og -JNK2 niveauer ved Western blot i MAP2K4 end udtrykke cellelinjer, hjælp phosphoprotein specifikke antistoffer. Men vores resultater ikke støtte vores hypotese som overekspression af MAP2K4 steg ikke enten phospho- eller totale protein niveauer af enten p38 MAPK eller JNK, figur S2.

Vores resultater støttede den hypotese, at under forhold med vedvarende MAP2K4 overekspression, som forekommer i det kliniske scenarium kompenserende pathways kan omgå mål umiddelbart nedstrøms for MAP2K4, hvorved der efterlades dem i en inaktiveret tilstand. HSP27, en nedstrøms af p38 MAPK, øger både MMP-2 ekspression og celleinvasion i human PCa, under forhold med transient transfektion [12], [15]. Vi har derfor undersøgt status HSP27, Fig 3A-B. Overordnede niveauer af både phospho- og total HSP27, sammenlignet med GAPDH, blev forøget. Phospho- og total HSP27 steg med 3,4 (signifikant) og 2,7 (kun en tendens; 2-sidet p-værdi = 0,065), henholdsvis for WT-MAP2K4 celler, og begge signifikant med 3,1 og 3,0 gange for CA-MAP2K4 celler . Phospho-HSP27 /samlede stigning HSP27 forholdet var lille, og kun signifikant for WT-MAP2K4 celler. Disse resultater viser MAP2K4 fører til øgede niveauer af total og phospho-HSP27 protein. Der var ingen forskel i HSP27 genekspression mellem MAP2K4 overudtrykkende og VC-celler, fig 3C, hvilket indikerer, at forskelle i proteinekspression skyldtes ændringer i oversættelse og /eller proteinnedbrydning. Samlet set viser disse resultater fastslå, at kronisk MAP2K4 overekspression fører til forøget HSP27-protein ekspression, mens udenom aktiveringen af ​​p38 MAPK og JNK.

Ekspressionen af ​​total og phosphorylerede former af Hsp27-proteiner blev vurderet ved Western blot i angivne cellelinier, AB. Data fra tre separate blots er grafisk afbildet INB, som middel ± SEM. C), blev Hsp27 transkriptniveauer målt ved QRT /PCR, normaliseret til GAPDH og udtrykt som middelværdien ± SEM procentdelen af ​​VC.