PLoS ONE: fedtsyreestere af phloridzin inducere apoptose af Human Liver Cancer Cells gennem Altered Gene Expression

Abstrakt

phloridzin (phlorizin eller phloretin 2 ‘-

O

glucosid) er kendt for blokerer tarm glukose absorption. Vi har undersøgt anticarcinogenic effekt af phloridzin og dets nye derivater hjælp menneskelige kræftceller. Vi har syntetiseret nye acylerede derivater af phloridzin med seks forskellige langkædede fedtsyrer ved regioselektiv enzymatisk acylering bruge

Candida Antarktis

lipase B. antiproliferative virkninger af de nye forbindelser blev undersøgt i forhold til forældre-forbindelser, phloridzin, aglycon phloretin, de seks frie fedtsyrer og kemoterapeutiske lægemidler (sorafenib, doxorubicin og daunorubicin) ved anvendelse af humant hepatocellulært carcinom HepG2-celler, humant brystadenocarcinom MDA-MB-231-celler og akutte monocytisk leukæmi THP-1-celler sammen med normale humane og rottehepatocytter. De fedtsyreestere af phloridzin inhiberede signifikant væksten af ​​de to carcinom og leukæmiceller mens lignende doser behandling ikke var toksiske for normale humane eller rottehepatocytter. Den antiproliferative styrke af fede estere af phloridzin var sammenlignelig med styrken af ​​de kemoterapeutiske lægemidler. De fedtsyreestere af phloridzin inhiberede DNA topoisomeraser IIα aktiviteter, der kan inducere G

0 /G

1 fasen, induceret apoptose via aktivering af caspase-3, og faldt ATP-niveau og mitrokondriemembranen i HepG2-celler. Baseret på den høje selektivitet på kræftceller, decosahexaensyre (DHA) ester af phloridzin blev valgt til genekspression analyse under anvendelse RT

2PCR cancer drug target human array. Antiproliferativ virkning af DHA ester af phloridzin kunne relateres til den nedregulering af anti-apoptotisk gen (BCL2), vækstfaktorreceptorer (EBFR familie, IGF1R /IGF2, PDGFR) og dets nedstrøms signalering partnere (PI3K /AKT /mTOR, Ras /Raf /MAPK), cellecyklus maskiner (CDK, TERT, TOP2A, TOP2B) samt epigenetik regulatorer (HDAC’er). Disse resultater antyder, at fede estere af phloridzin har potentielle kemoterapeutiske virkninger medieret gennem den svækkede ekspression af flere vigtige proteiner involveret i cellecyklusregulering, DNA topoisomeraser IIα aktivitet og epigenetiske mekanismer efterfulgt af cellecyklus og apoptose

Henvisning.: Nair SVG, Ziaullah, Rupasinghe HPV (2014) fedtsyreestere af phloridzin inducere apoptose af human Liver Cancer Cells gennem ændret genekspression. PLoS ONE 9 (9): e107149. doi: 10,1371 /journal.pone.0107149

Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA

Modtaget: Marts 21, 2014 Accepteret: August 12, 2014; Udgivet: 17 September, 2014

Copyright: © 2014 Nair et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: HPVR:. Discovery Grant program for naturvidenskab og Engineering Council (NSERC; Grant Number 327.056; https://www.nserc-crsng.gc.ca) af Canada og programmet Atlantic Innovation Funds (AIF) i Atlantic Canada Opportunities Agency (ACOA; Grant Number 192.020, https://www.acoa-apeca.gc.ca). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC), den mest almindelige form for leverkræft, repræsenterer den femte verdensomspændende malignitet og tredje årsag til dødelighed blandt kræft dødsfald [1]. I Canada, er forekomsten af ​​HCC været stigende i de seneste årtier [2]. HCC udgør 71,9% af leverkræft hos mænd og kvinder i Canada. Ifølge canadiske Cancer Statistik i 2013, har forekomsten af ​​leverkræft i Canada er steget med 3,6% om året, og dødeligheden er steget med 2,2% om året. De medvirkende faktorer af HCC omfatter kontakt med hepatocarcinogens især aflatoxin [3], hepatisk virusinfektion og levercirrhose [4]. De potentielle helbredende behandlingsmuligheder er kirurgisk resektion, levertransplantation, og ablation eller transarterial embolisering [1]. Den kemoterapi, oral multikinasehæmmer, sorafenib (Nexavar) er den mest almindeligt anvendte lægemiddel til HCC behandling, men gevinsten i overlevelse er beskeden [5]. Manglende adgang til effektive behandlinger og høj prævalens har ført til søgning af nye tilgange velegnet til forebyggelse og behandling af leverkræft. Som følge heraf har mange fytokemikalier blevet udforsket som potentielle kemoforebyggende midler, der kan vende eller undertrykke hepatocarcinogent progression.

Flavonoider, en af ​​de store klasser af polyfenoler, har vist nogle kemoforebyggende egenskaber mod HCC i et stort antal i vitro [6], [7] og in vivo undersøgelser [1], [8]. Phloridzin (phlorizin eller phloretin 2 ‘-

O

glucosid), et dihydrochalcon, er en af ​​de store phenoliske flavonoid glykosider fundet i æble [9]. Den største farmakologiske virkning phloridzin er hæmning af natrium-afhængig glucose bundet transportører (SGLT1 og SGLT2), som blokerer intestinal glucose absorption og producere renale glukosuri [9]. Ud over deres antidiabetiske ejendom, phloridzin har andre biologiske aktiviteter, såsom inhibering af lipidperoxidation [10], forebyggelse af knogletab hos rotter [11] og forbedring af hukommelse i mus [12]. Phloridzin stimulere melanogenese ved at øge tyrosinase genekspression gennem cAMP-signalvejen [13]. Phloretin, aglyconen af ​​phloridzin, er blevet rapporteret at have potent antioxidant aktivitet i peroxynitrit skylning og inhiberingen af ​​lipidperoxidation [14]. Glycosylering ved 2-OH faldt antioxidant aktiviteter af phloridzin med 18 gange i forhold til phloretin [14]. Phloretin på koncentrationerne af 100 uM augmented TNFa-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) -induceret apoptose og cytotoksicitet i LNCaP-prostatacancerceller [15]. Der er imidlertid ingen rapport om cancer kemoforebyggende virkninger af phloridzin. I antitumoraktivitet undersøgelse af æble polyfenoler, havde phloridzin ikke påvirke proliferation af enten transplanterede B16 musemelanomceller eller BALB-MC.E12 musebrysttumor celler [16].

I vores laboratorium, phloridzin blev regioselektivt acylerede med en serie af langkædet, mættet, mono- og poly-umættede, fede syrer ved anvendelse af immobiliseret lipase B, fra

Candida antarctica

(Novozyme 435) [17]. Lipase katalyseret forestring og transesterificering af flavonoidglycosider er blevet rapporteret at øge lipofilicitet og forbedret anticancervirkning af stamforbindelsen [18]. Derfor i denne undersøgelse undersøgte vi cytotoksiske potentiale af fedtsyreestere af phloridzin på celleproliferation af faste tumorer, såsom hepatocellulært carcinom HepG2 celler og brystadenocarcinom MDA-MB-231 celler samt akut monocytter leukæmi THP-1-celler. Normale humane hepatocytter HP-F og rottehepatocytter RTCP10 blev også anvendt til at bestemme specificiteten af ​​estere på kræftceller. Det er første gang disse hidtil ukendte fedtsyreestere af phloridzin er blevet testet for antiproliferativ virkning af cancerceller. Ud at belyse de cellulære og molekylære mekanismer i fedtsyreestere af phloridzin på HepG2-celler, DNA-topoisomeraser IIα aktivitet, cellecyklusstandsning, mitochondriemembranpermeabilitet, caspase 3-aktivitet og associerede apoptotiske processer blev også undersøgt. Derudover analyserede vi effekten af ​​decosahexaensyre (DHA) ester af phloridzin på ekspressionen af ​​84 gener, at målene for anticancer lægemidler og lægemiddeludvikling. Vores resultater er eksperimentelle beviser til støtte yderligere undersøgelse af fedtsyreestere af phloridzin især DHA ester af phloridzin som en effektiv og sikker kemoterapeutiske kandidat.

Materialer og metoder

Test forbindelser og kemikalier

fedtsyreestere af phloridzin (Pz) nemlig. stearinsyre ester af Pz (Pz-stearinsyre), oliesyre ester af Pz (Pz-oliesyre), linolsyre ester af Pz (Pz-linolsyre), α-linolensyre ester af Pz (Pz-α-linolensyre ), blev DHA ester af Pz (Pz-DHA) og eicosapentaensyre ester (EPA) i Pz (Pz-EPA) syntetiseres i vores laboratorium som tidligere rapporteret [17].

phloridzin, phloretin, caspase 3 kolorimetrisk assaykit, propidiumiodid, fedtsyrer nemlig oliesyre, stearinsyre, linolsyre, α-linolensyre, blev EPA og DHA indkøbt fra Sigma-Aldrich Canada. Celle Titer 96 Aqueous One opløsning celleproliferation (MTS) assay CytoTox 96 ikke-radioaktiv cytotoksicitet (LDH) assay og CellTiter-Glo luminescerende assaykits blev indkøbt fra Promega, Madison, WI, USA. Steril dimethylsulfoxid (DMSO) (ATCC), GFP-certificeret apoptose /nekrose afsløring kit til mikroskopi fra Enzo Life Sciences, Brockville, ON, Canada; ApoTarget Quick Apoptotisk DNA Ladder Detection kit fra Invitrogen, Burlington, ON, Canada; DCFDA-Cellular reaktiv ilt arter afsløring assay kit formular Abcam, Toronto, ON, Canada; og 5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid (JC-1) fra Cayman Chemicals, Burlington, ON, Canada blev også anvendt til undersøgelsen.

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Humane hepatocellulært carcinom celler (HepG2) og THP-1 akutte monocytiske leukæmi celler blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA (Dalhousie University biosikkerhed certifikat nummer til anvendelse af cellelinjer er af 2013-10). HepG2 celler blev dyrket i Eagles modificerede minimale essentielle medier (EMEM) suppleret med 10% FBS (ATCC) og 1% penicillin-streptomycin (ATCC). THP-1-celler blev dyrket i RPMI-1640-medier suppleret 0,05 mM 2-mercaptoethanol og 10% føtalt bovint serum til en slutkoncentration på 10%. MDA-MB-231 brystcancerceller (ATCC HTB-26) blev opnået fra Cedarlane, Berlington, ON, Canada) og blev opretholdt i DMEM-medium (Sigma-Aldrich Canada) suppleret med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin , 2 mM L-glutamin, 5 mM HEPES (pH 7,4) og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Invitrogen, Burlington, ON, Canada). Kryopræserverede normale humane hepatocytter (HP-F) blev hepatocyt plating medium og hepatocyt vedligeholdelse medium købt fra Zen-Bio, Forskning Tiangle Park, NC, USA. Normale humane hepatocytter udpladet på 96 brønds collagen 1 overtrukne cellekulturplader (Life Technologies) og opretholdt i hepatocyt vedligeholdelsesmedium i 24 timer for at tillade celleindvinding og fastgørelse. Rottehepatocytter (RTCP10), optøning medier og inkubering medier blev købt hos Life Technologies. Rottehepatocytter udpladedes i kollagen 1 coatede plader med 96 brønde (Life Technologies, Burlington, ON, Canada) ved hjælp af optøning medier og vedligeholdes i inkubation medium. Alle celletyper blev opretholdt ved 37 ° C i en inkubator under 5% CO

2/95,% luftatmosfære ved konstant fugtighed.

Celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer (Lys-Linje hæmocytometer, Sigma-Aldrich Canada) og blev udpladet i forhold til antallet af celler for hvert forsøg i 6, 24 eller 96 brønds format i 24 timer før tilsætning af testprøver. Alle de prøver blev solubiliseret i sterilt filtreret DMSO ( 0,5% i dyrkningsmediet) før tilsætning til dyrkningsmediet. Kontrol celler blev også kørt parallelt og udsat for de samme ændringer i medier med 0,5% DMSO

Cell Proliferation assay

Cell levedygtighed blev bestemt ved hjælp af MTS-analysen.. Kort fortalt blev HepG2-celler (5 x 10

3 celler /100 pl /brønd), MDA-MB-231 (5 x 10

3 celler /100 pl /brønd), THP-1 (25 × 10

3/100 uL /​​brønd), normale humane og rottehepatocytter (1 × 10

4 celler /100 pi /brønd) blev udpladet i tre eksemplarer, i en 96 brønds sterile fladbundede vævskulturplader. Efter 24 timers inkubation, phloridzin fedtestere, phloridzin, phloretin blev frie fedtsyrer af respektive estere eller sorafenib fremstillet i medier og 100 pi af hver behandling blev tilsat til hver brønd, hver behandling i tre gentagelser. Derved blev cellerne udsat for forskellige koncentrationer (0,1, 1, 10, 25, 50, 75, 100 uM) af hver behandling. Kontroller består af celler med medier indeholdende DMSO ( 0,5%), test blanke brønde indeholdt testforbindelsen i medier uden celler og blanke brønde indeholdt medier uden celler. Efter yderligere 3, 6, 12, 18 eller 24 timer, 20 pi MTS-reagens i kombination med elektronen koblingsmiddel blev phenazinmethosulfat tilsat til brøndene, og celler blev inkuberet i en fugtig inkubator i 3 timer. Absorbans ved 490 nm (OD490) blev målt ved anvendelse af en Flurostar Optima mikropladelæser (BMG Labtech, Cary, NC, USA) for at opnå antallet af levedygtige celler i forhold til kontrolgruppen befolkning. Procentdel af levedygtigheden af ​​testforbindelsen behandlede celler udtrykkes som procent sammenlignet med kontrol ( 0,5% DMSO). EF

50 værdier (koncentration, der kræves for at nedsætte levedygtigheden celler med 50% i sammenligning med kontrolceller) for hver forsøgsforbindelse blev analyseret under anvendelse af Graphpad Prism software, La Jolla, CA, USA. Den selektive indeks (SI) af fedtsyren estere af phloridzin er defineret som forholdet mellem cytotoksicitet (EF

50 værdier) på normale HP-F-celler til god cancer HepG2, MDA-MB-231-celler (SI = EF

50 på HP-F celler /EF

50 på solide kræftceller). Prøver med SI-værdier større end tre blev anset for at have høj selektivitet mod kræftceller.

cytotoksicitet assay

Laktat dehydrogenase (LDH) er en stabil cytosolisk enzym, der frigives ved skader membran i apoptotisk /nekrotiske celler. LDH-aktivitet blev målt ved anvendelse CytoTox 96 Non-Radioactive cytotoksicitetsanalyse (Promega, Madison, WI, USA), hvori LDH frigivet i kultursupernatanter måles med et koblet enzymatisk assay, hvilket resulterer i omdannelse af et tetrazoliumsalt til et rødt formazanprodukt. HepG2-celler (5000/100 pi /brønd) blev podet og behandlet med 100 pM af phloridzin fedtsyreestere, phloridzin, phloretin, frie fedtsyrer af respektive estere eller sorafenib fremstillet i serumfri medier og inkuberet (37 ° C, 5% CO

2) i 6 timer. Efter centrifugering blev supernatanten fjernet til en analyseplade, og LDH frigives fra cellerne ind i dyrkningsmediet blev målt. Den maksimal frigivelse blev opnået efter behandling kontrolceller med 1% Triton X-100 i 30 minutter ved stuetemperatur. Den apoptotiske /nekrotiske procentdel blev udtrykt ved hjælp af formlen: (prøve-værdi /maksimal frigivelse) x 100%. Tidligere undersøgelser af leverandøren havde klart, at i HepG2-celler, LDH aktivitet maksimal koncentration er på 1 til 6 h inkubationer fordi LDH aktivitet frigivet fra celler har en halveringstid på ca. 9 timer [19]. MTS assayresultater viste, at alle fedtsyreestere af phloridzin inhiberede 70-80% celleproliferation i 6 timer, derfor, analyserede vi LDH-aktivitet efter 6 timers inkubering.

Morfologisk observation af apoptose i HepG2-celler

2.5.1. Morfologisk observation under inverteret fasekontrastmikroskop.

HepG2-celler blev ligeledes podet i 24-brønds fladbundede vævskulturplader behandlet plader (BD Biosciences), og derefter behandlet med 100 pM af fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, phloretin , sorafenib og DMSO ( 0,5%) kontrol. Efter 24 timers behandling blev morfologi HepG2-celler observeret under et omvendt fasekontrast mikroskop (Nikon Eclipse E 100, Nikon, Mississauga, ON, Canada) og blev taget til fange ved 400X forstørrelse med anvendelse Infinity digital mikroskopi kamera (Lumenera corporation, Ottawa, ON, Canada).

2.5.2. Bestemmelse af Apoptose /nekrose ved fluorescensmikroskopi.

HepG2-celler blev podet i Nunc Lab-Tek to kammer objektglas (Sigma-Aldrich Canada) ved en densitet på 1 x 10

6 celler /kammer. De vedhæftede celler blev derefter behandlet med enten 100 uM fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, phloretin, sorafenib eller DMSO-vehikel (som kontrol) i 24 timer. Objektglassene blev vasket med fortyndet phosphatbufret saltvand. Efter fjernelse af kammeret, blev hver slide tilsat med 50 uL af Dual Detection Reagent indeholdende apoptose afsløring reagens (Annexin V-EnzoGold) og nekrose detektionsreagens (7-AAD) i 1X bindende buffer. Prøverne blev inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter i mørke. Efter farvning blev cellerne vasket med bindingsbuffer og dækket med et dækglas. De farvede celler blev observeret under et fluorescens Zeiss Axiovert 200 m inverteret mikroskop (Carl Zeiss, Toronto, ON, Canada) ved forstørrelse på × 40 med et filter sat til Annexin V-EnzoGold (Ex /Em: 550/570 nm) og 7 -AAD (Ex /Em: 546/647 nm).

Analyse af apoptose ved DNA-fragmentering

HepG2 (1 × 10

5) celler blev podet i 24-brønds dyrkningsplader og fik lov til at adhærere natten. Herefter blev celler behandlet enten med 100 uM fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, phloretin, sorafenib eller DMSO-vehikel (som kontrol). Pladerne blev inkuberet igen i yderligere 24 timer. DNA-fragmentering blev påvist under anvendelse ApoTarget Quick Apoptotisk DNA Ladder Detection Kit (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ifølge producentens protokol. Princippet involverer detektering af de internukleosomal DNA-fragmenter dannet under apoptose. Kort beskrevet flydende døde celler og trypsinerede adhærente celler blev opsamlet og centrifugeret ved 1.000 rpm i 10 min. Efter vask med fortyndet phosphatbufret saltvand blev cellerne lyseret med 35 pi TE lysepuffer (et kit komponent). Til lysatet blev 5 pi enzym A (et kit komponent) tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 10 min. Derefter blev 5 pi Enzyme B (et kit komponent) tilsat, forsigtigt blandet og inkuberet ved 50 ° C i 30 minutter. DNA’et blev udfældet med ammoniumacetat og absolut ethanol ved -20 ° C. Efter centrifugering (10 minutter ved 12.000 rpm) og lufttørring blev DNA-pelleten opløst i 30 pi af DNA suspension buffer. Til detektering af DNA-stige, blev de ekstraherede DNA-prøver kørt på en 1,2% agarosegel indeholdende 0,5 ug /ml gel rød i Tris-Borat-EDTA (TBE) buffer. Efter elektroforese blev gelen billedet taget med Gel Doc 100-systemet (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada).

Analyse af caspase-3 aktivitet

Aktiviteten af ​​caspase 3 enzym var målt ved anvendelse caspase 3 kolorimetrisk assay-kit indkøbt fra Sigma-Aldrich. HepG2-celler (2 x 10

6 celler /brønd) dyrket i plader med 6 brønde blev behandlet med enten 100 uM fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, phloretin, sorafenib eller DMSO-vehikel (som kontrol). Cellerne blev lyseret, og indholdet af cellelysat-protein blev kvantificeret ved BCA-proteinassay (Thermo Fisher Scientific Inc., Ottawa, ON, Canada). Caspase-3-aktivitet blev målt i 200 ug cellelysat under anvendelse af caspase-specifikke peptid-substrat, DEVD (Asp-Glu-Val-Asp), konjugeret til reporter p-nitroanaline (ρ-NA) molekyler. Spaltning af dette peptid ved caspase frigiver kromofor, som måles kolorimetrisk ved en bølgelængde på 405 nm som beskrevet i leverandørens protokol.

Cell Cycle Analysis

HepG2-celler blev udpladet med 5 x 10

5 ml i en seks-brønds plade. Efter 24 timers inkubation (37 ° C, 5% CO

2), blev cellerne behandlet med 100 pM fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, phloretin, sorafenib eller DMSO ( 0,5%) kontrol fremstillet i medier og inkuberet i yderligere 24 timer. Efter trypsinisering blev cellerne vasket og centrifugeret ved 2000 x g i 10 min, og pelleten resuspenderet i 0,5 ml PBS. Fiksering blev afsluttet ved tilsætning af 1,2 ml 70% kold ethanol i 2 timer. De fikserede celler blev vasket med PBS og centrifugeret ved 2000 x g i 10 min. Man suspenderede celler i 0,3 ml PBS, 8 pi af DNAase fri RNAse (10 mg /ml) blev tilsat og inkuberet i 1 time. Efter tilsætning, 15 pi af propidiumiodid (0,5 mg /ml), celler blev inkuberet i 4 ° C i 30 minutter. Cellerne blev analyseret for cellecyklus hjælp flowcytometer FACS Calibur (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) med en excitationsbølgelængde på 488 nm og emission ved 670 nm. DNA-indhold blev bestemt ved ModFit software (Verity Software House, Topsham, ME, USA), som gav histogrammer at evaluere cellecyklusfordeling.

mitokondrie Energy Metabolism Assays

ATP niveau assay.

Cellular ATP-niveauer blev målt med CellTiter-Glo luminescerende assaykit opnået fra Promega i overensstemmelse med producentens anvisninger. HepG2-celler udpladet på en sort walled klar bundplade med 96 brønde blev inkuberet med 100 pM fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, phloretin, sorafenib, frie fedtsyrer eller DMSO ( 0,5%) kontrol i medierne. Efter 24 timer, til CellTiter-Glo Reagent svarende til volumenet af celledyrkningsmediet stede i hver brønd og blandet indhold i 2 minutter på en orbitalryster inducerer cellelyse. Luminescens blev optaget på Flurostar Optima mikropladelæser (BMG Labtech) efter inkubation ved stuetemperatur i 10 min for at stabilisere luminescerende signal. Niveauet af ATP i en prøve blev præsenteret som procent sammenlignet med ubehandlede kontrol.

mitochondrial membranpotentiale (MMP).

HepG2-celler blev podet i en sort walled klar bund med 96 brønde sterilt flad bottom vævskulturplader (BD Biosciences, USA) ved en densitet på 5 x 10

4 celler /brønd (100 pi) og inkuberet i en CO

2 inkubator i 24 timer ved 37 ° C. Celler blev behandlet med 100 pM fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, phloretin, sorafenib, frie fedtsyrer eller DMSO ( 0,5%) kontrol fremstillet i medier og inkuberet i 24 timer. Farvningsopløsningen JC-1 blev fremstillet med PBS og 5 uM blev tilsat til hver brønd. Cellerne blev yderligere inkuberet i et CO

2 inkubator ved 37 ° C i 1 time. Efter vask af pladen med PBS to gange, blev fluorescensen målt med en Fluostar Optima mikropladelæser (BMG Labtech) ved 535 nm for JC-1-monomerer og ved 590 nm for JC-1 aggregater.

human Topoisomerase IIα ( Topo IIα) katalytisk aktivitet

topo IIα katalytiske aktivitet blev overvåget via elektroforese hjælp topoisomerase II drug screening kit (TopoGEN, Inc., Columbus, OH, USA). Kort fortalt, 20 pi reaktionsblandinger indeholdt 0,5 M Tris-HCI, pH 8,0, 1,5 M NaCl, 100 mM MgCl

2, 20 mM ATP, 300 pg BSA /ml og 5 mM dithiothreitol. Supersnoede DNA (pHOT1 DNA), supersnoet tilvejebragt i kittet blev bestemt til at være ideel til dette assay, fordi det er lille og let at håndtere og har et stort antal topo IIα genkendelseselementer. Efter 2 pi (0,25 ug) af pHOT1 DNA blev tilsat, efterfulgt af tilsætning af 100 uM fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, phloretin, sorafenib eller DMSO ( 0,5%) kontrol i opløsningsmiddel blev reaktionen initieret ved at tilsætte 4 enheder (2 pi) af humant DNA topo IIα og udført ved 37 ° C i 30 min. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 2 pi 10% natriumdodecylsulfat (SDS) efterfulgt af fordøjelse med 2 pi proteinase K (50 ug /ml) ved 37 ° C i 15 minutter til nedbrydning af enzymet. Efter tilsætning af 2 pi ladningsbuffer (0,25% bromphenolblåt og 50% glycerol) blev tilsat til blandingen, blev prøver påsat på 1% agarosegel. Elektroforese blev udført ved 66 V (2 V /cm) i 5 timer i TBE-buffer ved anvendelse af Biorad elektroforesegel System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Supersnoede DNA (pHOT1 DNA) og afslappet DNA blev inkluderet i elektroforese kørt som markører for DNA-topologi. Geler blev derefter farvet i 0,5 pg /ml gel rød i TBE i 30 minutter og affarvet i 15 minutter i destilleret vand før digital erhvervelse billede ved hjælp Gel Doc 100-systemet (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

En enhed af topoisomerase II-aktivitet blev defineret som den mindste mængde enzym, der kræves for at opnå fuldstændig afslapning på 0,5 mg superspiraldensitet pHOT1 DNA i 30 minutter ved 37 ° C. Inhibering af topoisomerase II afslapning aktivitet blev undersøgt ved den samme procedure under anvendelse af fire enheder enzym og 100 uM testforbindelser. Procenten af ​​inhibering blev beregnet ved følgende formel: hvor S

kontrol er procenten af ​​supersnoet DNA i kontrolgruppen bane (uden enzym og testforbindelser), S

0 er procenten af ​​supersnoede DNA i lane uden testforbindelserne og S er procenten af ​​supersnoet DNA i lane med testforbindelser og enzym.

Real Time RT-PCR-analyse

genekspressionsprofiler blev opnået fra HepG2 celler behandlet med DHA-estere af phloridzin eller sorafenib eller DMSO behandlede kontrolceller. Total RNA-ekstraktion blev udført under anvendelse Arum Total RNA MINIKIT (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). RNA-koncentrationen og renheden blev bestemt ved måling af absorbansen ved anvendelse af en NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). RNA integritet blev vurderet ved formaldehyd-agarose-gelelektroforese. RNA (400 ng) blev anvendt til at syntetisere cDNA under anvendelse RT

2 First Strand kit (SABiosciences, Frederick, MD, USA). RT

2 RNA QC PCR arrays (SABiosciences, Frederick, MD, USA) blev anvendt til at vurdere kvaliteten af ​​cDNA prøver før karakterisering med human cancer lægemiddelkandidater RT

2 profiler PCR array (SABiosciences, Frederick, MD, USA). Genekspressionsprofiler af 84 gener blev undersøgt ved anvendelse af de humane kræftbehandlingstargets RT

2 profiler PCR array (PAH’er-507ZD) på en Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) under anvendelse RT

2 realtid SYBR green PCR Master mix (SABiosciences, Frederick, MD, USA). Grupperingen har også fem referenceværdier gener (beta-2-mikroglobulin (B2M), hypoxanthin-phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1), ribosomalt protein L13a (RPL13A), glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), og actin beta (ACTB), tre reverse transskription kontroller (RTCer), tre positive PCR-kontroller (PPC), og en genomisk DNA-kontrol (GDC) og tage op til 96 assays. efter normalisering med RPL13A henvisning gen, genekspressionsniveauer blev individuelt bedømt ved hjælp tærskelcyklen (Ct) værdier ved hjælp af RT

2 profiler PCR array-dataanalyse software (Microsoft Excel-baseret program af SABiosciences, Mississauga, ON, Canada) Den beregner: 1) ACt af hvert gen = Ct af gen af ​​interesse – gennemsnitlig Ct af valgte reference. gener 2) ΔΔCt for hvert gen på tværs af to grupper; ΔΔCt = ACt (Pz-DHA ester eller sorafenib) – ACt (kontrol) 3) fold-ændring for hvert gen fra kontrolgruppen til Pz-DHA ester behandlede gruppe som 2

(- ΔΔCt). RT

2 RNA QC PCR-data viste ingen genomisk DNA-kontaminering (Ct 35 vil indikere mindst GDC) eller tilstedeværelsen af ​​urenheder i RNA-prøver baseret på Ct værdien af ​​PPC (Ct skal være 20 ± 2 på hver array) og viste ingen hæmning af revers transkription baseret på Ct-værdier på RTC og PPC. Reproducerbarhed blev opretholdt ved hjælp af tre biologiske gentagelser fra tre individuelle eksperimenter.

statistiske analyser

EF

50 værdier blev beregnet ved hjælp af Graphpad Prism 6 software (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Statistical Analysis System (SAS, Version 9.2). En-vejs ANOVA med Tukey indlæg hoc sammenligninger på P 0,001 blev anvendt til statistiske sammenligninger. Alle data præsenteres som en middelværdi med sin standardafvigelse angivet (Mean ± SD).

Resultater

antiproliferativ virkning af fedtsyreestere af phloridzin i forskellige kræft og normale celler

i den foreliggende undersøgelse blev de potentielle cytotoksiske virkninger af fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, frie fedtsyrer og phloretin såvel som standard kommercielle cancerlægemidler undersøgt på human hepatocarcinoma (HepG2), brystadenocarcinom (MDA-MB-231) og akut monocytisk leukæmi (THP-1) cellelinjer, primære normale humane hepatocytter og rotte hepatocytter ved hjælp MTS assay. Assayet viste, at fedtsyreestere af phloridzin dræber HepG2, MDA-MB-231 og THP-1-celler i et tilsvarende omfang og på en dosis- (figur 1) og tidsafhængig måde (tabel 1). Efter 24 timers inkubation, i HepG2-celler, antiproliferative EF

50 for stearinsyre, oliesyre, linolsyre, α-linolensyre, DHA og EPA estere af phloridzin var 37,8, 31,5, 29,2, 53,1, 51,9 og 26,8 uM henholdsvis . EF

50 var 35,2, 37,9, 32,3, 63,8, 55,5, og 26,5 uM i MDA-MB-231-celler. EF

50 værdier for disse estere på THP-1-celler var 40,7, 2,1, 6,2, 35,7, 27,3, og 14,8 uM. Selvom fedtsyreestere af phloridzin viste høj styrke som antiproliferativt middel, ingen af ​​forælder molekyle, phloridzin og individuel fedtsyrer viste nogen effekt på cellernes levedygtighed (EF

50 100 uM) af HepG2, MDA-MB-231 eller THP -1 celler. Interessant nok viste aglycon phloretin en signifikant antiproliferativ virkning (EF

50 39,6 uM) i THP-1-celler (tabel 1).

hepatisk carcinoma (HepG2-celler) og normale humane hepatocytter (HP-F) og rottehepatocytter (RTCP10) celler blev udsat for at teste forbindelser ved 1, 10, 50, 100 uM i 24 timer. Cellelevedygtigheden blev bestemt under anvendelse MTS assay. De data, der præsenteres som den procentvise levedygtighed i forhold til køretøjet kun behandlet kontrolgruppe. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3) er repræsentative for mindst tre separate uafhængige forsøg. * P 0,05 signifikant forskellig fra køretøjet kun styre gruppe (Tukey HSD, P 0,01).

For at vurdere specificiteten af ​​fedtsyreestere af phloridzin til kræftceller, narkotika effekt på cellelevedygtighed i normale hepatocytter blev kvantificeret ved cytotoksicitet assay i både normale menneskelige (HP-F) og rotte (RTCP10) hepatocytter. HP-F-celler blev behandlet med 100 pM og lavere koncentrationer af alle fedtsyreestere af phloridzin, phloridzin, fedtsyre, sorafenib og phloretin i 24 timer (tabel 1). Fedtsyreestere af phloridzin påvirkede ikke levedygtigheden af ​​normale humane hepatocytter med EF

50 100 uM og er mere specifikke for kræft cellelinier (tabel 1, figur 1). I 100 uM behandling af fedtsyreestere af phloridzin i 24 timer, fedtsyreestere af phloridzin viste mindst toksicitet ( 90% levedygtighed) i rottehepatocytter også (figur 1). De mest lovende og mest selektive cytotoksiske aktiviteter blev detekteret i Pz-DHA og Pz-EPA estere. Fedtsyreestere af phloridzin undtagen Pz-stearinsyre (ca. 50% levedygtighed) viste også meget mindre aktivitet ved inhibering af cellelevedygtighed ( 80% levedygtighed) af rottehepatocytter end det cancercellelinjer. Disse resultater antyder, at fedtsyreestere af phloridzin kan have moderat til minimale bivirkninger. De mest lovende og mest selektive cytotoksiske aktiviteter blev detekteret med Pz-DHA ester. EF

50 (uM) og SI-værdier af Pz-DHA i HepG2, MDA-MB-231, THP-1 var 51,9 (SI = 11,2), 55,5 (SI = 10,5), og 27,3 (SI = 21,38) (tabel 1). DHA er en fælles kosten omega-3-fedtsyre og det besidder også antiproliferative egenskaber [20]. Derfor blev Pz-DHA ester valgt til genekspression undersøgelse under anvendelse af human lægemiddelmål RT

2-PCR array som det viste den stærkeste cytotoksisk virkning på cancerceller og var den mindst toksiske på normale celler sammenlignet med andre fedtsyreestere af phloridzin