PLoS ONE: Cancer Cells differentielt Aktiver og trives på De Novo Lipid Syntese Veje i en lav-Lipid Miljø

Abstrakt

Øget lipogenese er kendetegnende for en bred vifte af cancerformer og er under intens efterforskning som potentiel antineoplastisk mål. Selvom der er observeret rask lipogenese i nærvær af eksogene lipider, er bevis montering, at disse lipider kan skade effektiviteten af ​​inhibitorer af lipogene pathways. Derfor fuldt ud at udnytte det terapeutiske potentiale af lipid syntese-hæmmere, en bedre forståelse af sammenhængen mellem

de novo

lipid syntese og eksogene lipider og deres respektive rolle i kræft celledeling og terapeutisk respons på lipogenese hæmmere er af afgørende betydning. Her viser vi, at udbredelsen af ​​forskellige cancer cellelinjer (PC3M, HepG2, HOP62 og T24) er svækket, når de dyrkes i lipid-reducerede forhold i en cellelinje-afhængig måde, med PC3M bliver mindst berørt. Interessant, alle cellelinier – lipogenisk (PC3M, HepG2, HOP62) samt ikke-lipogenisk (T24) – hævet deres lipogenisk aktivitet i disse betingelser, om end i forskellig grad. Celler, der opnåede den højeste lipogenisk aktivitet under disse betingelser var bedst i stand til at klare lipid reduktion på sigt af proliferativ kapacitet. Supplering af mediet med lipoproteiner med meget lav densitet, frie fedtsyrer og kolesterol vendt denne aktivering, hvilket indikerer, at den blotte mangel på lipider er tilstrækkelig til at aktivere

de novo

lipogenese i cancerceller. Derfor kræftceller dyrket i lipid-reducerede forhold blev mere afhængige af

de novo

lipid syntese veje og var mere følsomme over for hæmmere af lipogene veje, som soraphen A og Simvastatin. Kollektivt, disse data indikerer, at begrænsning af adgangen til udefrakommende lipider, som kan forekomme i intakte tumorer, aktiverer

de novo

lipogenese er kræftceller, hjælper dem til at trives under disse forhold, og gør dem mere sårbare over for lipogenese hæmmere. Disse observationer har stor betydning for udformningen af ​​nye antineoplastiske strategier rettet mod kræft cellens lipid metabolisme

Citation:. Daniëls VW, Smans K, Royaux I, Chypre M, Swinnen JV, Zaidi N (2014) Cancer Cells forskelligt Aktiver og trives på

De Novo

Lipid Syntese Veje i en lav-Lipid Miljø. PLoS ONE 9 (9): e106913. doi: 10,1371 /journal.pone.0106913

Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrig

Modtaget 11. april 2014 Accepteret: August 3, 2014; Udgivet 12. september, 2014

Copyright: © 2014 Daniëls et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra: Videnskabelig Grundforskningsfond-Flandern (FWO, https://www.fwo.be/en/) G.0691.12 (JVS), KU Leuven samordnet forskningsaktioner (GOA, https://www.kuleuven.be/onderzoek/kernprojecten/goa.htm) GOA /11/2009 (JVS), og universitetscenter Seværdighed polakker – belgiske føderale Videnskab Politik kontor (IAP Belspo, https://www.belspo.be/belspo/index_en.stm) IAP7-32 (JVS). VWD er forskningsassistent fra Den Videnskabelige Research Foundation-Flandern (FWO) og den flamske League mod kræft (VLK, https://www.tegenkanker.be/home). Medforfatternes KS, IR, MC, og NZ er ansat af Janssen Pharmaceutica NV. Janssen Pharmaceutica NV ydet støtte i form af lønninger til forfattere KS, IR, MC og NZ. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Medforfattere Karine Smans, Ines Royaux, Melanie chypre og Nousheen Zaidi er ansat af Janssen Pharmaceutica NV. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Hurtigt prolifererende cancerceller kræver en konstant tilførsel af lipider for membran Biogenese og protein modifikationer. Flere undersøgelser har vist, at for at klare disse øgede krav, kræftceller enten øge deres optagelse af lipider eller aktivere

de novo

lipid syntese [1] – [5]. Forbedret fedtsyresyntese er fundet i 20% til 90% af tumorer af mange forskellige typer og er afspejlet i opregulering af nøgleenzymer involveret i denne [1] pathway. Disse omfatter fedtsyresyntase (FASN), acetyl-CoA-carboxylase alfa (ACACA) og ATP-citratlyase (ACLY). Talrige rapporter indikerer, at aktivering af disse enzymer forekommer nedstrøms for vækstfaktorsignalering og andre onkogene begivenheder, uanset tilstedeværelsen af ​​ekstracellulære lipider [1], [6] – [12]. Også cholesterolsyntese, gennem mevalonat-vejen, er aktiv i mange cancerceller. Vigtigere, hæmning af fedtsyre syntese eller kolesterol syntese veje ved RNA-interferens eller kemiske hæmmere resulterer i vækst anholdelse af lipogene tumorceller, både

in vitro

og

in vivo

, rendering disse enzymer interessante mål for antineoplastisk terapi [1], [13] – [19]. Desværre de cytotoksiske virkninger induceret af inhibering af

de novo

lipid synteseveje tilsyneladende undgås ved tilstedeværelsen af ​​exogene lipider eller mellemliggende metabolitter [13], [20], [21]. Disse observationer antyder, at det er afhængigheden af ​​

de novo

lipidsyntese der bestemmer svaret af cancerceller til inhibering af disse veje og at ekstracellulær lipider kan kompromittere de terapeutiske fordele af disse inhibitorer.

Her at få mere indsigt i det komplekse samspil mellem eksogene lipider og

de novo

lipid syntese veje i kræftceller, og at undersøge, hvordan dette samspil kan påvirke effekten af ​​lipid-targeting antineoplastiske behandlinger, undersøgte vi virkningen af lipid deprivation på celleproliferation og reaktionen på lipogen inhibering i en række veletablerede lipogene og mindre lipogene cancercellelinie modeller. Interessant, fandt vi, at en lipid-reduceret vækstmiljø differentielt påvirker væksten af ​​kræft cellelinjer og er tilstrækkelige til at tænde

de novo

lipogenese veje selv i kræftceller, der betragtes som ikke-lipogenisk. Denne aktivering hjælper kræftceller til at opretholde deres proliferationshastighed i en lav-lipid miljø og gør dem mere følsomme over for lipogenese inhibitorer. Disse data igen understrege heterogenitet kræftceller i form af deres metaboliske krav, de understrege betydningen af ​​ekstracellulære forhold og har stor betydning for den forbedrede udformning af terapeutiske strategier baseret på manipulation af lipid krav tumorceller.

Materialer og metoder

Cellekultur og behandlinger

Alle cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellekulturreagenser blev købt hos Invitrogen medmindre andet er anført. Den PC3M cellelinie blev dyrket i HyClone MEM /EBSS medium (Thermo Scientific) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 mM natriumpyruvat, 10 mM ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 50 pg /ml gentamicin og 1X BME Vitaminer (Sigma). HOP62 celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 50 pg /ml gentamicin. HepG2-celler blev dyrket i MEM suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 50 pg /ml gentamicin, 100 mM natriumpyruvat, 0,37 g /l natriumbicarbonat, 10 mM ikke-essentielle aminosyrer. T24-cellelinien blev dyrket i DMEM-medium, suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 50 pg /ml gentamicin. Alle cellelinier blev dyrket i en atmosfære af 5% CO

2 og 37 ° C. For lipid-reducerede betingelser medierne blev suppleret med 10% HyClone lipid-reduceret FBS (Thermo videnskabelig). Forskelle i lipider og relaterede komponenter i normal versus lipid-reduceret FBS er opført i Supplerende tabel S1. Simvastatin blev indkøbt fra Merck Sharp. Soraphen A blev modtaget fra Dr. R. Jansen, Helmholtz-Zentrum f. Infektionsforschung, Mikrobielle Wirkstoffe, Braunschweig, Tyskland [22], [23]. Vandopløseligt kolesterol, glycerylmonostearat trilinoleate og glyceryl trilinolenate blev indkøbt fra Sigma. lipoproteiner med meget-lav densitet (VLDL) blev opnået fra Merck Millipore. For at dyrke cellerne i nærvær af forskellige fedtsyrer blandinger, palmitinsyre (16:00), oliesyre (18:01), linolsyre (18:02), α-linolensyre (18:03), arachidonsyre (20:04) og docosahexaensyre (22:06) syre (Sigma) blev kompleksbundet til fedtsyre-fri BSA (Sigma) som tidligere beskrevet [18], før tilsætning til dyrkningsmediet. Triglycerider blev inkuberet i normal eller lipid-reduceret FBS i 30 minutter ved 37 ° C før tilsætning til dyrkningsmediet.

Immunoblotting analyse

Lige store mængder proteiner blev påført på præfabrikerede geler (NuPAGE, Invitrogen), overført til PVDF-membraner og inkuberet med antistoffer mod ACLY (monoklonal kanin, ab40793, Abcam), FASN (monoklonalt kanin, 3180, Cell Signaling) og β-actin (monoklonalt muse-, Sigma). Membranerne blev vasket og undersøgt med gede-anti-kanin konjugeret med Alexa Fluor 680 (Invitrogen) sekundære antistoffer. Fluorescerende signal blev derefter målt under anvendelse af Licor Odyssey-system (LI-COR Biosciences).

Proliferationsassay

PC3M og HOP62 celler blev podet ved en densitet på 5 x 10

4 celler ml

-1 i 24-brønds vævskulturplader (Nunc). T24-celler blev podet ved 2 × 10

4 celler ml

-1 i en 24-brønds vævskulturplade. HepG2-celler blev podet ved 2,5 x 10

4 celler ml

-1 i Poly-D-Lysin mikroplader med 96 brønde, sort /klar (BD Bioscience). Cellerne blev podet i normalt eller lipid-reducerede medium. Vækst kurver blev konstrueret af imaging plader ved hjælp af

Incucyte systemet Hotel (Essen Instruments), hvor vækstkurverne blev bygget fra Confluence målinger erhvervet i runde-the-clock kinetiske billeddannelse. Til bestemmelse af cellerne nummererer celler flyder i dyrkningsmediet blev samlet sammen med de adhærente celler efter trypsinisering. Cell blev farvet med trypanblåt og talt under anvendelse af grevinde automatiseret celletæller (Invitrogen).

RNA isolering og Real-time kvantitativ PCR (qPCR)

Totalt RNA fra dyrkede celler blev ekstraheret og DNaseI behandlet under anvendelse af RNeasy Mini kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. 3 ug totalt RNA tjente som template til cDNA-syntese under anvendelse af oligo dT-primere og Superscript III revers transkriptase i et volumen på 20 pi i løbet af 1 time ved 50 ° C. Dette blev efterfulgt af inaktivering af enzymet ved 70 ° C i 15 minutter, i henhold til fabrikantens anvisninger (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitativ PCR (qPCR) blev udført på en ABI Prism 7900-HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) under anvendelse af en qPCR kerne kit w /o dUTP (Eurogentec). De termiske cyklusbetingelser var 10 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Validerede præ-designet Taqman genekspression assays (Applied Biosystems) svarende til husholdningsgener TFRC (Hs00951083_m1) og PGK1 (Hs00943178_g1) blev anvendt til at generere standardkurver for serielle fortyndinger af cDNA. Den relative standardkurve blev anvendt til at beregne udtrykket værdier. Efter normalisering af TFRC eller PGK1 de relative udtryk værdier blev beregnet. De andre Taqman genekspression assays anvendt i denne undersøgelse, er: ACLY (Hs00982738_m1), ACSS2 (Hs00218766_m1), FASN (Hs01005622_m1), ACACA (Hs01046047_m1), HMGCR (Hs00168352_m1)

Samlet RNA fra T24 celler var forberedt. hjælp PureLink RNA Mini Kit (Ambion). Renheden og koncentrationen af ​​RNA blev vurderet ved anvendelse af en NanoDrop DM-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies). 3 ug RNA fra hver prøve blev anvendt som template til cDNA-syntese under anvendelse af tilfældige hexamere primere og Superscript II revers transkriptase, ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen). Primere blev designet med Primer-BLAST software NCBI, hvor mulige primere spænder en exon-exon junction blev udvalgt. Specificiteten af ​​primerne blev kontrolleret ved sekvensanalyse i Primer-BLAST software og smelte kurve analyse. Kvantitative PCR-forsøg blev udført på en 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems) under anvendelse af Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). De termiske cyklusbetingelser var 20 sekunder ved 95 ° C efterfulgt af 40 cykler af 3 sekunder ved 95 ° C og 30 sekunder ved 60 ° C. De opnåede Ct-værdier blev normaliseret under anvendelse af 18S som housekeeping-gen.

Apoptose assay

Celler blev podet i normale eller lipid-reducerede vækstbetingelser og blev inkuberet og behandlet i 72 timer med soraphen A eller simvastatin. Apoptose blev vurderet ved hjælp af

Guava nexin

kit og

Guava PCA-system

(Guava Techinnologies). Guava nexin analysen anvender to pletter (annexin V og 7-amino actinomycin D [7-AAD]) at kvantificere procentdelen af ​​apoptotiske celler. Celler, som farves positivt for begge farvestoffer er i de senere faser af apoptose, før celledød. Den nexin assay blev udført ifølge producentens protokol. Data blev indsamlet og analyseret af en Guava personlig celle analyse (PCA) flowcytometer med brug af CytoSoft software (Guava Technologies). Ca. blev analyseret 2000 celler.

3D cellekultur

HepG2-celler blev podet i ultralav vedhæftede 96-brønds plader (Corning Costar) ved en densitet på 750 celler /brønd /200 pi medium . Celler blev podet og opretholdt i normal eller lipid-reducerede vækstmedium og overvåges i 20 dage. Efter sfæroid dannelse blev 50% medium volumen udskiftes hver 3-4 dage. Sfæroiderne blev analyseret ved hjælp af

i celle Analyzer

(GE Healthcare).

ATP assay

levedygtighed celler med de sfæroider blev bestemt ved måling af celle ATP indhold ved hjælp CellTiter- Glo Luminescent Cell levedygtighed Assay (Promega) ifølge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev 100 pi ‘CellTiterGlo-reagens’ sættes til brøndene indeholdende sfæroider. Før tilsætning af CellTiterGlo-reagens 100 pi medium fjernet fra hver brønd. Sfæroiderne lyseres ved rystning i 10 minutter efterfulgt af pipettering. 100 pi cellesuspension fra hver brønd overføres til en hvid Optiplate 96 (Perkin Elmer). Luminescens måles.

lipidsyntese

Celler blev dyrket i 24-brønds plader i normal eller lipid-reducerede medium. Efter 72 timer [

14C] -mærket acetat (56 mCi /mmol, 0,2 uCi /brønd, Amersham Biosciences) tilsat til cellerne. Efter 4 timers inkubation blev cellerne opsamlet ved trypsinbehandling og pelleteres ved centrifugering. Lipider blev ekstraheret ved anvendelse af en modificeret Bligh Dyer metode, som tidligere beskrevet [19].

14C-inkorporering i cellulære lipider blev kvantificeret ved scintillationstælling, anvendelse af en Packard 1600CA

Tri-Carb væskescintillationstæller

(Packard instrument Company). De opnåede tællinger blev normaliseret til prøve-DNA-indhold, for at tage hensyn til forskellene i antallet af celler efter 72 timer i lipid-reduceret medium betingelser.

Nanofluidic proteomisk analyse

Udtrykket af forstadiet og den aktive form af SREBP1 og SREBP2 blev undersøgt ved en størrelse baseret Simple Western immunassay under anvendelse af en Peggy Nanopro indretning (Protein Simple). Den totale proteinkoncentration af prøverne blev bestemt ved anvendelse af et BCA Protein Assay (Pierce). Lige mængde prøve er udarbejdet i Simple vestlige fortyndingsbuffer, reduceret og denatureret før de anbringes på pladen. Plader blev fremstillet ifølge fremstilling procedure, ved hjælp af alle reagenser fra Protein Simple. SREBP1 og SREBP2 antistoffer (Active Motiv, # 39939 og # 39.941) blev anvendt ved 1:25 fortynding blev α-tubulin antistof (Cell Signaling, # 2125), der anvendes ved en 1:500 fortynding. Data blev analyseret ved anvendelse af Simple Western Compass software. Proteinekspression (arealet under kurven, AUC) blev korrigeret for a-tubulin ladningskontrol (AUC SREBP /AUC alpha-tubulin).

Statistisk analyse

Resultaterne blev analyseret ved Students’t -test (Excel) eller envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest (GraphPad Prism Software), hvor det er relevant. P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. De præsenterede data repræsenterer middelværdier ± S.D. som angivet i det tilsvarende tal legender.

Resultater

Lipid-reducerede vækstbetingelser forskelligt dæmpe spredning på tumorcellelinier

For at undersøge effekten af ​​reduktionen lipid på spredning og overlevelse af kræftceller, vi valgte PC3M, HOP62, HepG2 og T24-cellelinjer. De første tre cellelinier er rapporteret at have en lipogen fænotype i standard cellekultur betingelser med fuldstændig serum. Vi observerede i vores tidligere undersøgelse, at disse cellelinjer var påvirket af miljømæssige lipider [24]. Dette var uventet, da lipogene cellelinjer menes at være overvejende afhængig af

de novo

lipogenese for at opfylde deres fedtsyrer krav. De T24 celler viser en lav-lipogenisk fænotype under disse betingelser, og blev indarbejdet som en kontrol cellelinie [14], [24] – [26]. Alle disse cellelinier blev dyrket under normale forhold i medium med 10% gennemført serum eller med 10% lipid-reduceret serum. Incucyte imaging i realtid og trypanblåteksklusion assays viste, at dyrkning i lipid-reducerede betingelser svækkede celleproliferation af de forskellige cellelinjer i forskellige grader. HOP62 viste en dramatisk reduktion i vækstraterne når de dyrkes under lipid-reduceret vækstbetingelser, efterfulgt af HepG2 (figur 1a-b). T24 celler var langt mindre påvirket og PC3M celler blev ikke påvirket overhovedet (figur 1a-b). Men den lave lipid miljø ikke inducere apoptose i PC3M og HepG2 cellelinjer (Supplerende figur S1).

(a) Spredning kurver for PC3M, HOP62, HepG2 og T24 celler. Celler blev podet og dyrket i normal eller lipid-reduceret medium, og celleproliferation blev overvåget ved

Incucyte imaging i realtid.

Panelerne på højre side af hver proliferation graf viser fase kontrast billede af den tilsvarende cellelinje under begge betingelser. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) Antallet af levende celler blev talt under anvendelse af en trypanblå fremgangsmåde udelukkelse farvestof, efter 72 timers dyrkning i normal (N) eller LR-medium. * Signifikant forskellig (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N.S. ikke signifikant (p 0,05).

For HepG2, som tidligere har vist sig at danne kompakte 3D sphæroider i 3D celle-kultur-systemer [27] – [30], vi også undersøgt virkninger af lipid-reducerede betingelser på en 3-dimensional (3D) cellekultursystem, der efterligner naturlige væv og organer nøjere end 2-dimensional (2D) cellekultursystem. I normale vækstbetingelser blev observeret en tidsafhængig stigning i størrelsen af ​​sfæroider (figur 2a). Men i lipid-reducerede betingelser HepG2-sfærisk vækst blev fuldstændig standset (figur 2a). På dag 20 blev 5-fold større sphæroider observeret i normale vækstbetingelser i forhold til lipid-reducerede vækstbetingelser (figur 2a). Dette blev også afspejlet i antallet af levedygtige celler som afsløret af ATP målinger [31] (figur 2b).

(a) Fase kontrast mikroskopi viser HepG2-sfærisk formation. HepG2-celler blev podet i normalt og LR medium i ultralave vedhæftede plader ved en densitet på 750 celler /brønd og klyngedannelse blev overvåget over tyve dage som angivet. Sfæroiderne blev analyseret ved hjælp af en

i celle Analyzer 2000

instrument. Omkreds af sfæroider blev målt ved hjælp af

i celle Analyzer 2000 software.

(B) levedygtighed celler med de sfæroider blev bestemt ved måling af celle ATP indhold ved hjælp af luminescens assay.

Kræftceller tænde

de novo

lipid syntese veje i lipid-reduceret vækstbetingelser

forventes Cell proliferation i lipid-reducerede betingelser for at afhænge af evnen af ​​kræftceller til at syntetisere de nødvendige lipider

de novo

. Men vores førnævnte spredning data ikke matcher lipogeniske aktivitet kræft cellelinjer dyrket under standardbetingelser, som væksten i lav-lipogene T24 celler var mindre påvirket end dem i den lipogen HOP62 og HepG2-celler. Derfor vurderede vi evnen hos cellelinjerne til at aktivere denne vej i lipid-reducerede betingelser. Først kontrolleres vi effekten af ​​normale og lipid-reducerede vækstbetingelser på mRNA udtryk profiler af store gener i

de novo

lipogenese veje: ATP-citratlyase (ACLY), et cytosolisk enzym, som katalyserer dannelsen af ​​acetyl -COA for både fedtsyre og cholesterolsyntese, acyl-CoA syntetase kortkædede familiemedlem 2 (ACSS2), som katalyserer syntesen af ​​acetyl-CoA fra acetat, fedtsyresyntase (FASN), nøglen enzym involveret i fedtsyresyntese og hydroxymethyl glutaryl-CoA reduktase (HMGCR), det hastighedsbegrænsende enzym i kolesterol syntese. Ct-værdierne for de testede gener er angivet i supplerende Tabel S2. Interessant nok blev ekspression af disse enzymer steg i alle cellelinjer, herunder det ikke-lipogen cellelinie T24, omend i en noget anden grad, med HepG2 er den mindst responsiv (Figur 3a-d). Western blot analyse af FASN og ACLY viste, at disse enzymer var mest dramatisk opreguleret i lipid-reducerede medium i PC3M og mindst i HepG2 (figur 3e). I overensstemmelse med disse resultater, sterol regulatorisk bindende protein 1 (SREBP1) og SREBP2, som er de vigtigste regulatorer af ekspression af gener af fedtsyren syntese og mevalonat vej henholdsvis viste også en øget udtryk (Supplerende figur S2) og var yderligere aktiveret på proteinniveauet i lipid-reducerede forhold i HOP62, PC3M og T24 celler, men ikke i HepG2 (Figur 4 annonce og supplerende Figur S3). Carbohydrat-responsive element binding protein (ChREBP), en anden vigtig regulator af ekspressionen af ​​lipogene gener [32], blev kun udtrykt i detekterbare niveauer i HepG2-celler (leverkræft cellelinie) (Supplerende figur S4A) og i denne cellelinie , kunne vi ikke observere en aktivering og nuklear translokation af transskription faktor, når dyrkes i svagt lipid forhold (Supplerende figur s4b). I PC3M, den HOP62 og T24 cellelinjer, prostata, lunge og nyre kræft cellelinjer henholdsvis vi kunne ikke registrere ChREBP i de samlede cellulære ekstrakter eller i de nukleare fraktioner, når cellerne blev dyrket i lipid-reducerede vækstbetingelser (Supplerende figur s4b). Disse observationer tyder på, at ChREBP ikke spiller en central rolle i den øgede lipogenisk genekspression i lipid-reducerede forhold.

genekspression af FASN, ACLY, ACSS2 og HMGCR blev analyseret ved qPCR-analyse i (a) HOP62 ( b) HepG2 (c) PC3M (d) T24-celler. Celler blev dyrket i normal eller LR-medium i 48 timer. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af tredobbelte prøver, normaliseret til TFRC for HOP62, HepG2 og PC3M eller til 18S for T24. * Signifikant forskellig (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N.S. ikke signifikant (p 0,05). (E) FASN og ACLY ekspression på proteinniveauet blev analyseret ved Western blot-analyse i HOP62, HepG2, PC3M og T24-celler dyrkes under normal (N) eller LR-medium i 72 timer. Beta-actin blev anvendt som en loading kontrol.

(a) repræsentant virtuel blot af Simple Western-analyse af precursor og aktiv SREBP1 ekspression i HepG2, PC3M, HOP62 og T24-celler efter 72 timers dyrkning i normal (N) eller LR mediebetingelser. Alpha-tubulin anvendes som lastning kontrol. Forskellige eksponeringer af precursor og aktiv SREBP1 er vist for at få en nøjagtig eksponering for begge former. For originale data se Supplerende Figur S3a-d. (B) Kvantitativ analyse af Simple Western. data, udtrykt som areal under kurven (AUC). Angivelse af SREBP1 blev korrigeret til lastning kontrol alpha-tubulin. Graf repræsenterer middelværdi ± S.D. (N = 2-3). (C) repræsentant virtuelle blot af Simple Western-analyse af precursor og aktiv SREBP2 ekspression i HepG2, PC3M, HOP62 og T24-celler efter 72 timers dyrkning i normale (N) eller LR mediebetingelser. Alpha-tubulin anvendes som lastning kontrol. Forskellige eksponeringer af precursor og aktiv SREBP2 er vist for at få en nøjagtig eksponering for begge former. For originale data se Supplerende Figur S3E-h. (D) Quantificative analyse af Simple Western. data, udtrykt som areal under kurven (AUC). Angivelse af SREBP2 blev korrigeret til lastning kontrol alpha-tubulin. Graf repræsenterer middelværdi ± S.D. (N = 2-3).

For at underbygge vores resultater på øget ekspression af lipogene gener i lipid-reducerede forhold, blev lipid syntese bestemt ved at måle inkorporeringen af ​​radioaktivt mærket acetat i cellulære lipider. I tråd med vores øvrige observationer, blev

14C-acetetate inkorporering steget betydeligt i PC3M, HOP62 og T24 celler, når de blev dyrket i en lav-lipid miljø (figur 5). HepG2-celler, som allerede udviser en høj basal lipogen aktivitet, udviste ikke signifikant opregulering af deres lipidsyntese ved dyrkning i lipid-reducerede vækstmedium. Selv HOP62 og T24 kunne opregulere deres

de novo

lipogenese, de kunne kun nå det samme niveau af lipogenisk aktivitet som de HepG2-celler. Derimod kunne PC3M celler opregulere deres lipogenisk aktivitet til et meget højere niveau end de andre cellelinjer. Dette giver en indikation, hvorfor disse senere celler kunne holde en normal vækst i lipid-reducerede forhold og de andre tre celle kunne ikke linjer. Disse resultater viser, at i lipid-berøvet betingelser kræftceller, uanset om de er lipogen eller ikke-lipogen i standard dyrkningsbetingelser, har evnen til at opregulere

de novo

lipogenese veje, det være sig til en anden grad. I hvilket omfang cellerne opregulere deres lipogenisk vej i en lipid-reduceret miljø bestemmer deres evne til at holde prolifererende under disse forhold.

HepG2, PC3M, HOP62 og T24 celler vokser i normal eller LR medium for 72 timer, blev inkuberet i de sidste 4 timer med

14C-acetat. Cellulære lipider blev ekstraheret og inkorporeringen af ​​

14C i de cellulære lipider blev bestemt ved scintillationstælling. Scintillation tæller blev normaliseret for prøve-DNA-indhold. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. * Signifikant forskellig (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N.S. ikke signifikant (p 0,05).

opregulering af

de novo

lipid syntese induceret af lav-lipid miljø kan vendes ved VLDL og kan henføres til en mangel på fedtsyrer og kolesterol

Dernæst søgte vi at bekræfte, at induktionen af ​​

de novo

lipogenese under lipid-reducerede betingelser skyldtes specifik udtømning af lipider fra vækstmediet. Som lipid-reducerede serum fremstilles ved fjernelse af lipoproteiner såsom lipoproteiner med meget-lav densitet (VLDL) [33], som er en rig kilde af triglycerider og kolesterol, der forklarer den stærke reduktion af disse to lipider i vores lipid-reduceret FBS ( supplerende tabel S1), T24-celler blev dyrket i lipid-reducerede betingelser, og mediet blev suppleret med VLDL. Tilsætning af VLDL faldt udtryk for SREBP1a, SREBP1c og SREBP2 (Supplerende figur S5a). Følgelig ekspressionen af ​​FASN, ACACA, ACLY, ACSS2 og HMGCR var også signifikant reduceret (figur 6a). Dette fald i ekspression af de lipogene gener var ledsaget af en formindsket aktivitet af lipogen pathway, som bestemt ved

14C-acetat inkorporering assay (figur 6d). For at definere, om triglycerider eller kolesterol til stede i VLDL partiklen forårsagede denne lipogenese-hæmmende effekt, vi suppleret cellerne med triglycerider eller kolesterol alene. Tilsætning af triglycerider kunne ikke vende den forhøjede lipogenese observeret i T24 dyrket i lav-lipid vækstbetingelser (Supplerende figur S6). Frie fedtsyrer, havde imidlertid medføre en betydelig redning. Forskellige blandinger af mættede, mono- og poly-umættede fedtsyrer faldt ekspressionen af ​​SREBP1a, SREBP1c og SREBP2 (Supplerende figur S5b). Følgelig ekspressionen af ​​FASN, ACACA, ACLY, ACSS2 og HMGCR blev også signifikant reduceret efter fedtsyre tilsætning (figur 6b) og var ledsaget af en formindsket aktivitet af lipogen pathway, som bestemt ved

14C-acetat inkorporering assay ( Figur 6e). Disse resultater viser tydeligt, at eksogene fedtsyrer kan påvirke reguleringen af ​​

de novo

lipogenese også i kræftceller. I modsætning til fedtsyre Desuden har tilskud af lipid-reducerede vækstmedium med kolesterol ikke føre til reducerede mRNA niveauer af SREBP1a, SREBP1c eller SREBP2 (Supplerende figur S5c), men stadig påvirket mRNA niveauerne af de nedstrøms lipogene gener, FASN, ACLY, ACSS2 og HMGCR (figur 6c). Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser kolesterol til at regulere SREBP aktivitet på post-translationel niveau, snarere end på det translationelle niveau [34]. Kolesterol-induceret fald i ekspressionen af ​​lipogene enzymer var ledsaget af en formindsket aktivitet af lipogen pathway (fig 6f), hvilket indikerer, at også exogent kolesterol påvirker aktiviteten af ​​lipogenese pathway i cancerceller.

Genekspression af FASN, ACLY, HMGCR og ACSS2 blev analyseret ved qPCR i T24-celler blev dyrket i 48 timer i normal (N) eller LR vækstbetingelser i nærvær eller fravær af VLDL (a), forskellige fedtsyreblandinger (b) og forskellige koncentrationer cholesterol (c). VLDL blev tilsat i en koncentration på 607 ug triglycerider /ml serum (svarende til koncentrationen triglycerider i normal FBS). Fedtsyre (FA) blandinger blev som følger, FA Mix 1: 20 pM linolsyre (18:02), 20 uM α-linolensyre (18:03), 5 uM arachidonsyre (20:04), 5 uM docosahexaensyre (22: 6), FA Mix 2: 10 pM 18:02, 15 uM 18:03, 10 uM 20:04, 15 uM 22:06 og FA Mix 3: 20 uM 18:02, 20 uM 18:03, 5 uM 20 :4, 5 uM 22:06, 30 uM oliesyre, 30 pM palmitinsyre. (CH) koncentrationer forskellige kolesterol er som angivet i figurerne (25 pM, 50 pM eller 100 uM). Data er normaliseret 18S og repræsenteret som middelværdi ± S.D. (Tredobbeltbestemmelse pr eksperiment og n = 3). Signifikans blev bestemt ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligningstest. * Signifikant forskellig (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001; **** p≤0,0001) fra normal medium kontrol.

#Significantly forskellige (

# p≤0,05

## p≤0,01

### p≤0,001

#### p≤0,0001 ) fra LR kontrol. (D, e, f)

14C-inkorporering i cellulære lipider blev bestemt i T24-celler, dyrket i 48 timer i normal (N) eller LR vækstbetingelser i nærvær eller fravær af VLDL (d), forskellige fedtsyreblandinger Beta-actin blev anvendt som en loading kontrol.