PLoS ONE: kemo-Predictive Assay til Målretning Cancer Stem-lignende celler i patienter med Brain Tumors

Abstrakt

Administration af ineffektiv anticancer-terapi er forbundet med unødig toksicitet og udvikling af resistente kloner. Cancer stamceller-lignende celler (CSLCs) modstå kemoterapi, hvorved tilbagefald af sygdommen. Således udvikling af en test, der identificerer den mest effektive kemoterapi management tilbyder meget lovende for individualiserede behandlinger mod kræft. Vi har udviklet en ex vivo kemoterapi følsomhed assay (ChemoID), som måler følsomheden af ​​CSLCs samt hovedparten af ​​tumorceller til en række kemoterapimidler. To patienter, en 21-årig mand (patient 1) og en 5-måneders kvindelige (patient 2), påvirket af anaplastisk WHO grad III ependymoma blev screenet ved hjælp af ChemoID analysen. Patient 1 blev fundet følsom over kombinationen af ​​irinotecan og bevacizumab, hvilket resulterede i en forlænget sygdomsprogression periode på 18 måneder. Efter gentagelse, blev kombinationen af ​​forskellige kemoterapi narkotika testet igen med ChemoID analysen. Vi fandt, at benzylisothiocyanat (BITC) i høj grad øget kemosensitivitet af ependymoma celler til kombinationen af ​​irinotecan og bevacizumab. Efter patient 1 blev behandlet i to måneder med irinotecan, bevacizumab og tilskud af korsblomstrede planteekstrakter indeholdende BITC, vi observeret over 50% tumoral regression sammenlignet med præ-ChemoID scanning som det fremgår af MRI. Patient 2 blev fundet resistent over for alle testede og følgende 6 cyklusser af vincristin, carboplatin, cyclophosphamid, etoposid og cisplatin i forskellige kombinationer behandlinger, tumor af denne patient hurtigt skred frem, og protonstråleterapi blev anbefalet. Som forventet dyreforsøg udført med patient afledte xenotransplantater behandlet med ChemoID screenede narkotika sammenfattet den kliniske observation. Dette assay demonstrerer, at patienter med den samme histologiske fase og grad af cancer kan variere betydeligt i deres kliniske respons, hvilket antyder, at ChemoID test, som måler følsomhed CSLCs samt hovedparten af ​​tumorceller til en række kemoterapimidler kunne føre til mere effektive og personlige behandlinger mod kræft i fremtiden

Henvisning:. Mathis SE, Alberico A, Nande R, Neto W, Lawrence L, McCallister DR, et al. (2014) Chemo-Predictive Assay til Målretning Cancer Stem-lignende celler i patienter med hjernetumorer. PLoS ONE 9 (8): e105710. doi: 10,1371 /journal.pone.0105710

Redaktør: Caterina Cinti, Klinisk Institut Fysiologi, c /o Toscana Life Sciences Foundation, Italien

Modtaget: Maj 27, 2014; Accepteret: 23, 2014 Udgivet: 21 August, 2014

Copyright: © 2014 Mathis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. De nuværende undersøgelser blev delvist understøttet af National Center for Fremme Translationelle Sciences, National Institutes of Health, gennem tilskud nummer UL1TR000117 fra National Center for Research Resources (NCRR) og 5P20RR020180 fra National Cancer Institute, WV-INBRE 5P20RR016477, og delvist af en Marshall University Translationel Award, og en pris fra Marshall University Institut for Neurovidenskab (til PPC). Indholdet af dette manuskript er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NCRR og NIH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom ependymomas er den tredje mest almindelige form for hjernesvulst hos børn (efter astrocytoma og medulloblastom), de er forholdsvis sjældne, med cirka 200 tilfælde diagnosticeret i USA hvert år [1], [2]. De tegner sig for 60% af alle intramedullære tumorer og 50% opstå i filum terminale [3].

Behandlingen af ​​ependymomas kan være udfordrende. Den indledende standard behandling for ependymoma er kirurgi ofte efterfulgt af strålebehandling og kemoterapi. Selv om kemoterapi er blevet udbredt i børn med ependymomas, der er lidt klinisk evidens, at kemoterapi forbedrer overlevelse af børn med denne type tumor. Kemoterapi er ofte forbeholdt patienter med residual tumor efter operationen og for børn yngre end 3 år i et forsøg på at forsinke strålebehandling [4].

Det er ikke helt klart, hvorfor der ikke er en forbedret overlevelse med kemoterapi, men det er kendt, at resistens over for en række almindeligt anvendte kemoterapeutiske midler er almindelig i ependymoma [5]. Derfor undersøgelse og udvikling af nye strategier og integrerede behandlingsformer er forpligtet til at finde mere effektive behandlinger for denne type tumor.

Patienter med den samme scene og kvalitet af kræft kan variere betydeligt i deres kliniske respons og tolerance af kemoterapi. Ineffektiv anticancerterapi kan resultere i unødvendig toksicitet og udvikling af resistente kloner. De overlevende cancerceller ofte er mere resistente over for behandling. Mange forsøg er blevet gjort gennem årene for at udvikle en

ex-vivo

anti-cancer test, der kunne hjælpe skimte de bedste behandlingsmuligheder for den enkelte patient og samtidig minimere toksicitet.

Animal xenograftmodeller har vist, at kun en delmængde af cancerceller i hver tumor kan igangsætte tumorvækst. Denne evne er blevet vist i flere typer af humane cancere, at inkludere ependymomas [6]. Denne pulje af kræftceller er operationelt defineret som “Cancer Stem-Ligesom Cell” (CSLC) delmængde. Ifølge “kræft stamceller-lignende celle” teori, tumorer er en kompleks, voksende befolkning af unormale celler, der stammer fra et mindretal af CSLCs. Disse celler opretholder stamceller-lignende egenskaber, idet de formere sig meget langsomt og har en iboende evne til at forny sig selv og differentierer til fænotypisk heterogene, afvigende afkom [7] – [10]. I modsætning til størstedelen af ​​tumorceller, CSLCs modstå kemoterapi og strålebehandling og er ansvarlige for tumor tilbagefald og metastase [9], [10].

Nogle ependymomas udtrykker forskellige markører for stemness, herunder CD133. Desuden tilbagefald tumorer udviser en genekspression signatur udgøres af up-regulerede gener involveret i kinetochore (ASPM, KIF11) eller i neural udvikling (CD133, Wnt og Notch veje) [11].

Målretning CSLCs i Ud over hovedparten af ​​andre cancerceller i en tumor er et nyt paradigme i kræftbehandling. Vore nylige undersøgelser viser, at en hydrodynamisk fokusering Bioreactor (HFB) (Celdyne, Houston TX) selektivt beriger CSLCs fra cancercellelinier, der kan anvendes i en kemosensitivitet assay [8]. Under anvendelse af denne strategi vi optimeret berigelse af CSLCs fra tumorbiopsier og har udviklet den ChemoID kemoterapi følsomhed assay, der måler respons CSLCs og hovedparten af ​​tumorceller til kemoterapi til at bestemme den mest effektive kombination af anticancerlægemidler til maligne tumorer i nervesystemet.

i denne undersøgelse rapporterer vi for første gang, vores undersøgelse under anvendelse af ChemoID assay til måling af følsomhed og modstand af CSLCs og hovedparten af ​​tumorceller dyrket fra 2 biopsier af human ependymoma udfordret med flere kemoterapeutiske stoffer, der også er blevet korreleret til respons af animalske xenografter behandlet med de forudsagte narkotika og til den kliniske respons af de behandlede patienter.

Materialer og metoder

Reagenser

benzyl isothiocyanat (BITC) blev indkøbt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Bevacizumab (Avastin), Cisplatin, Oxaliplatin, arabinosid-C, VP-16, Irinotecan (Camptosar, CPT-11), Busulfan, methotrexat, blev erhvervet som klinisk kvalitet kemoterapeutiske stoffer.

Patienter

Case 1 er en 21-årig mandlig patient diagnosticeret med intradural, intramedullær, og ekstramedullær anaplastisk diffus spinal ependymoma, WHO grad III. Case 2 er et 5-måneder gammel kvindelig patient diagnosticeret med anaplastisk WHO grad III ependymoma.

ChemoID assay blev udført efter at have indhentet patientens skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med de etiske standarder i Helsinki-erklæringen (1964, senest ændret i 2008) af World Medical Association. Enhver information, herunder illustrationer, er blevet anonymiseret. Marshall University Institutional Review Board (IRB) har godkendt denne forskning i henhold til protokollen # 326.290. Deltagere eller værger af deltager (i tilfælde af et barn deltager), forudsat at deres skriftlige samtykke på en IRB godkendt informeret samtykke formular til at deltage i denne undersøgelse efter at være blevet uddannet om forsøgsprotokollen. Etiske komitéer /IRB på Marshall University godkendt denne godkendelsesproceduren. For Børn deltagere til studiet, blev skriftligt informeret samtykke indhentes fra den nærmeste pårørende, pedeller, eller værger på vegne af mindreårige /børn indskrevet i dit studie.

Single Cell Suspension og primær cellekultur

Single-cellesuspensioner fra ependymoma biopsier blev fremstillet under anvendelse af gentleMACS Dissociator (Miltenyi, Auburn, CA), og C Rør ved anvendelse af en standardiseret, halvautomatisk protokol baseret på en kombination af mekanisk vævsødelæggelse og inkubering med en 50% opløsning 0,025% trypsin og Accutase (Innovative Cell Technologies, San Diego, Californien). Celler blev serielt udpladet i 24-brønds, 12-brønds, 6-brønds, 10-cm behandlede skåle og dyrket til subkonfluens i RPMI-1640-medium suppleret med 5% bestrålet, varmeinaktiveret, defineret føtalt bovint serum (ThermoFisher /Hyclone), og 50 U penicillin og 5 pg streptomycin /ml medium (ThermoFisher /Mediatech).

Tre-Dimensional bioreaktor CSLCs Kultur

En hydrodynamisk fokusering bioreaktor (HFB) (Celdyne, Houston TX ) blev anvendt som tidligere beskrevet til selektivt prolifererer CD133 (+) cancer stamceller-lignende celler [8]. Dyrkningsmedier, iltning, hastighed, temperatur og CO

2 blev holdt konstant konstant i ti dage.

Celler blev talt og 1 × 10∧6 celler blev anbragt i den roterende beholder fastsættes til 25 rpm med luftstrømmen fastsat til 20%. Celler blev derefter fjernet og talt igen under anvendelse af trypan-blå-udelukkelse for at bestemme cellulær levedygtighed og celleantal og udpladet i 96 brønde til kemosensitivitet testning. Cellerne blev også inkuberet med fluorescerende antistoffer til fænotypisk karakterisering [8].

Celle Sortering

Op til 1 × 10∧7 celler blev Weaver et magnetisk cellesortering (MACS) systemet , som består af magnetiske kugler konjugeret til et antistof mod CD133 (Miltenyi, Auburn, CA). Kort fortalt blev cellerne høstet under anvendelse af 0,25% trypsin, pelleteret og mærket med CD133 /1 biotin og CD133 /2-PE. Celler blev vasket og mærket med anti-biotin magnetiske perler, og derefter ledes gennem en magnetisk kolonne, hvor CD133 (+) celler blev bevaret, mens umærkede celler passerede gennem søjlen. Den CD133 (+) tilbageholdt celler elueres fra søjlerne efter fjernelse fra magneten. Positive og negative celler blev derefter analyseret ved FACS for renhed.

Flowcytometri Studies

Celler blev analyseret ved de antigene kriterier ved hjælp af anti-CD34 (Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD38 ( Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD44 (BD Bioscience, Sparks, MD), -CD117 (Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD133 /2 (prominin1) (Milteny Biotech, Auburn, CA), -Oct3 /4 (BD Bioscience, Sparks, MD), og -Nanog (BD Bioscience, Sparks, MD). Kort fortalt blev cellerne løsrevet under anvendelse 0,02% EDTA i PBS og pelleteret (10 minutter ved 1000 rpm), vasket i 0,1% BSA i 1X PBS ved 4 ° C og inkuberet i en opløsning af 1 mg antistof +9 ml 0,1% BSA i 1X PBS. Celler blev vasket i den samme opløsning en gang og blev analyseret under anvendelse af en C6 Accuri flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA).

ChemoID Assay

Følsomhed over for kemoterapi blev vurderet ved anvendelse af et levedygtighedsassay (WST8) på 1 × 10∧3 celler udpladet i 5 replikaer i 96-brønds plader. Kort beskrevet lige antal hovedparten af ​​tumorceller dyrket i monolag og CSLCs dyrket i bioreaktoren, blev talt og podet separat i skåle med 96 brønde og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Cellerne blev derefter udfordret for 1 times puls med et panel af anticancerlægemidler som valgt af onkolog at efterligne den gennemsnitlige kliniske kemoterapi infusion tidsplan.

For at undersøge virkningen af ​​BITC på chemosensitization af cancerceller til kemoterapi narkotika, blev cellerne behandlet med en times puls 5-30 uM BITC efterfulgt af en time af de forskellige lægemidler mod cancer. Hver anticancer lægemiddel blev testet i en række doser herunder det klinisk relevante dosis.

En WST8 blev udført 48 timer efter kemoterapi behandling for at vurdere cellernes levedygtighed som beskrevet tidligere [12]. En dosis-respons diagram blev udviklet, ved hvilken prøverne blev scoret som responsiv (0-30% celleoverlevelse), mellemprodukt (30-60% celleoverlevelse), og ikke-responderende (60-100% celleoverlevelse).

Begrænsning Fortynding Tumorgenetisk Assay i Immune manglende mus

En række 1 × 10∧2, 1 × 10∧3, 1 × 10∧4, og 1 × 10∧5 ependymom celler fra Patient 1 blev injiceret subkutant i 5 athymiske immundefekte nøgen

nu /nu-mus per gruppe. Kort beskrevet et tilsvarende antal parentale hovedparten af ​​tumorceller dyrket i 2D monolag, CD133 (+) tredimensionalt dyrket i hydrofocusing bioreaktoren, og CD133 (+) MACSorted CSLCs blev injiceret med 100 pi matrigel i flanken af ​​NOD-

Scid

mus og sammenlignet med væksten af ​​CD133-negative celler i 3 måneder.

Kemoterapi Animal Study

der er udført Alle dyreforsøg efter godkendelse fra Marshall University IACUC, protokol # 373.017. Virkningerne af kemoterapier screenet in vitro ved ChemoID assay blev testet på humane tumor biopsier, der var xenotransplanteret i flanken af ​​en NOD-

Scid

musemodel. 1 × 10∧6 ependymoma celler blev blandet til 100 pi matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) injiceret subkutant i flanken af ​​10 athymiske, NOD.Cg-Prkdc

Scid

ll2rgtm1wjl /SzJ immundeficiente mus ( NOD-

Scid

) /gruppe og blev dyrket i 10 uger eller indtil 100 mm∧3. Mus blev randomiseret i forskellige behandlings- og kontrolgrupper og kemoterapi blev administreret ved intraperitoneal (i.p.) injektioner i 200 pi således i en periode på 4 uger: 1) Gruppe # 1, Kontrolgruppe med primære tumorceller injiceret i flanken og modtage i.p. sterilt saltvand injektioner. Gruppe # 2, Experimental gruppe injiceret i.p. med den mindst effektive kemoterapi som fastsat af

in vitro

ChemoID assay. Group # 3, Experimental gruppe injiceret i.p. den mest effektive kemoterapi som bestemt ved

in vitro

ChemoID assay. Group # 4, Experimental gruppe injiceret i.p. med den anden mest effektive kemoterapi som fastsat af

in vitro

ChemoID assay. Gruppe # 5, Eksperimentel gruppe injiceret i.p. med den mest effektive kombinatorisk kemoterapi som fastsat af

in vitro

ChemoID analysen.

Kemoterapi mus doser blev beregnet ved hjælp af en legemsoverflade (BSA) normaliseringsmetode [13] fra den kliniske dosis og verificeret i henhold til doser tidligere bestemt af en litteratursøgning.

Eutanasi

Dyrene blev aflivet efter de nuværende retningslinjer fastsat af den seneste rapport fra AVMA Panel om eutanasi bruger CO2 indånding og kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.

statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved hjælp af IBM SPSS statistisk software. Resultaterne for hver variant i de forskellige eksperimentelle design repræsenterer et gennemsnit på 3 forskellige eksperimenter. Dataene af 5 målinger blev midlet; variationskoefficienten blandt disse værdier oversteg aldrig 10%. Middelværdier og standardfejl blev beregnet for hvert punkt fra den samlede, normaliserede for at kontrollere dataene. Statistisk analyse af betydningen af ​​resultaterne blev udført med en 1-vejs ANOVA.

s

værdier på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Patient 1 Historie og udvælgelse af kemoterapier med ChemoID Assay

En fysisk aktiv 17 -årig mand præsenteret i oktober 2005 med paræstesier i fødderne og en temmelig alvorlig indsigtsfulde tab. Dette blev gradvist værre i december 2005 går op benene med temmelig svær følelsesløshed i højre ben og smerter i sit venstre ben, fra midten af ​​låret ned til midten kalv medialt. Ved undersøgelse havde han ingen omdrejningspunkt svaghed i hele hans øvre og nedre ekstremiteter. Han havde hypoalgesi med delvis sensoriske niveau i den øvre bryst rygsøjlen ned. Han havde også svære proprioception tab i hans fødder og tæer. Magnetisk resonans imaging (MRI) af halshvirvelsøjlen viste tilstedeværelsen af ​​en abnorm forstærkende masse, som strakte sig fra midten af ​​C5 til ringere C7 (4,5 i længden × 1,0 × 2,0 i cephalocaudal og anteroposteriore dimension), der forårsagede ledningen komprimering (figur 1A). MR-scanning af thorax rygsøjlen viste en forstærket læsion på T2-3 (1,5 i længden × 0,6 × 0,6 cm i anteroposteriore og tværgående dimension) med flere andre mindre nodulær masser, bedst set på T2 vægtet sekvens, som udvidede hele thorax niveau til T11 (figur 1B).

A) Magnetic Resonance Imaging (MRI) af halshvirvelsøjlen viser tilstedeværelsen af ​​en forbedring masse, der strækker sig fra midten af ​​C5 til ringere C7 (4,5 i længden × 1,0 × 2,0 i cephalocaudal og anteroposteriore dimension) og forårsager ledningen kompression. B) MR-scanning af brysthvirvelsøjlen viser en forstærket læsion på T2-3 (1,5 i længden × 0,6 × 0,6 cm i anteroposteriore og tværgående dimension) med flere andre mindre nodulær masserne, bedst set på T2 vægtet sekvens, som udvidede hele thorax niveau til T11. C) Hematoxylin og eosin-farvning af en tumor snit, der viser en samlet fremherskende tætte cellulære komponent, med primitive nukleare funktioner, mitotisk aktivitet, nekrose og vaskulær proliferation. Tilstedeværelsen af ​​velformede, tydelige perivaskulære pseudorosettes (med vasocentric mønster, perivaskulære nukleare zoner, og klassiske tynde gliale processer udstrålende til /fra karvæggen) blev fundet støtter diagnosen intradural, ekstramedullær anaplastisk diffus spinal ependymoma, WHO grad III.

patienten fik en laminektomi i december 2005 ved C5, C6, og C7 med delvis resektion af tumoren under mikroskopet med mikrokirurgiske teknikker. Efter operationen blev patienten behandlet med stråling og temozolomid

Morfologisk analyse af histologiske snit farvet med hematoxylin Eosin viste en samlet fremherskende tætte cellulære komponent, med primitive og pleomorfe kerner, øget mitotisk sats og apoptose, og foci med mikrovaskulære spredning. Tilstedeværelsen af ​​velformede, tydelige perivaskulære pseudorosettes (med vasocentric mønster, perivaskulære nukleare zoner, og klassiske tynde gliale processer udstrålende til /fra karvæggen) fandtes at understøtte diagnosen anaplastisk diffus spinal ependymoma, WHO grad III. Figur 1C viser hæmatoxylin og eosin farvning af en tumor sektion på diagnose i 2005.

Dele af tumoren blev evalueret af immunoperoxydase teknikker med passende farvning kontrol sektioner. Tumoren udviste positiv farvning med antistoffer mod neuron specifik enolase, vimentin, S-100, og GFAP. Svag farvning forekom med antistofferne mod actin. Fokal farvning forekom med antistoffer mod epitelmembran antigen, cytokeratin AE1 /AE3, og synaptophysin. Tumoren var negative for leukocyt fælles antigen, desmin, og myogenin. Desuden et afsnit farvet med PAS viste en fokal PAS-positive fibrillært materiale. Profiler og tumor blok blev også sendt til Biopathology Center (BPC) af Børnenes Oncology Group (COG) var to neuropathologists uafhængigt revideret sagen og bekræftet diagnosen anaplastisk ependymoma, WHO grad III.

Efter tilbagefald og progression, patienten modtog komplekse kemoterapi i januar 2006 og marts 2006, cyclophosphamid, thalidomid, celecoxib efterfulgt af etoposid, thalidomid og celecoxib. Kemoterapi behandling blev afsluttet i september 2006, men i august 2007 patient havde tumor genvækst på T7-T8, som han gennemgik robot strålebehandling behandling. Patienten havde en anden debulking operation i april 2008, men senere i december 2008 havde han progressiv følelsesløshed i benene sammen med rygsmerter med MRI viser tilbagefald hos den kirurgiske område (figur 2A) samt lændehvirvelsøjlen. Han blev derefter behandlet igen med temozolomid, men havde ingen respons på behandlingen.

A) 2009 MRI af halshvirvelsøjlen der får recidiv i det kirurgiske område. B) 2009-MRI af thorakale hvirvelsøjle viser progression af de vigtigste læsion måler 23,9 mm, og fremkomsten af ​​flere andre mindre læsioner. C og D) 2010 MRI af livmoderhalskræft og brysthvirvelsøjle viser tumor regression efter en behandling med irinotecan og bevacizumab.

I marts 2009 på grund af progression af sygdommen han havde en thorax laminektomi og resektion af intradural intramedullære tumor. Han havde alvorlige spinal kompression og begyndte at have svaghed i benene. På grund af yderligere tilbagefald, patienten havde derefter en anden debulking operation i juli 2009. Han modtog også oxaliplatin og etoposid behandling i juli og august 2009, men tumoren skred endnu mere (figur 2B).

Passende informeret samtykke blev underskrevet og på tidspunktet for den debulking kirurgi af juli 2009 blev en steril biopsi taget for at vurdere følsomheden af ​​tumorceller (hovedparten af ​​tumor og CSLCs) mod standard-of-care kemoterapi narkotika bruger vores ChemoID assay. Den biopsi blev anbragt i RPMI-1640 sterile medier og væv blev dissocieret i vores laboratorium i en enkelt-cellesuspension med anvendelse af en GentleMACS væv dissociator (Miltenyi, Aubourn, CA). Den encellede ependymoma suspension blev udpladet i RPMI-1640 i nærværelse af 5% bestrålet, varmeinaktiveret, defineret føtalt bovint serum, streptomycin og penicillin, og celler blev dyrket som et monolag i 15 dage. Cellerne blev immunophenotyped ved flowcytometer bruge antistoffer mod CD34, CD38, CD44, CD117, CD133, OCT3 /4, og Nanog.

De ependymom celler viste sig positiv til OCT3 /4 (2,73%), Nanog (0,95 %), CD133 (49,93%), CD117 (36.81%), og CD44 (20,39%) sammenlignet med et isotypekontrolantistof (fig S1 AE). En dobbelt farvning af CD34 og CD38 viste tilstedeværelsen af ​​1,88% af cellerne CD34 + /CD38 +, og 78,4% CD34 + /CD38-celler (figur S1 F).

At udvide CSLC population af CD133 + -celler fra ependymoma primær kultur, ependymom celler blev dyrket som tidligere beskrevet [8]. 1 × 10∧6 af ependymoma celler fra et monolag primær kultur blev dyrket i ti dage under anvendelse Hydrodynamisk Fokusering Bioreactor (HFB) (Celdyne, Houston, TX) [8]. De ependymom celler dyrket i bioreaktoren dannet celleklynger (figur 3A), som blev udvidet 14,7 gange (tabel 1) og syntes at være 95,93% CD133 positive efter 10 dages dyrkning i bioreaktoren (figur S1 C, berigede CSLCs).

a) Contrast fase billede af en klynge af berigede CSLCs efter 7-dages kultur i et hydrofocusing bioreaktor. B) immundeficient nøgne mus (nu /nu) injiceret med 1 × 10∧2 ependymoma celler MacSorted CD133 (+) celler eller CD133 (+) ependymoma celler dyrket i hydrofocusing bioreaktoren, ved hjælp af 100 pi matrigel i flanken dannede en svulst inden for 3 måneder i forhold til CD133 (-) celler

for at verificere tumorfremkaldende kapaciteten af ​​HFB vokset celler, vi injiceres 5 immune mangelfuld nøgne mus /gruppe en række 1. × 10∧2, 1 × 10∧3, 1 × 10∧4, og 1 × 10∧5 celler dyrket i HFB (~96% CD133 +) og sammenlignet deres vækst til et tilsvarende antal CD133 (+) MACsorted celler og CD133 (-) celler i 3 måneder. Vi observerede, at både 1 × 10∧2 MacSorted CD133 (+) celler eller CD133 (+) fra bioreaktoren voksede i alle de immune deficiente mus injiceret og dannede en håndgribelig tumor inden for 12 uger (figur 3B).

for at udføre ChemoID assayet et sammenligneligt antal celler (1 × 10∧5) hovedparten af ​​tumorceller dyrket som en 2D monolag og CSLCs beriget i bioreaktoren [8] blev separat udpladet i 96 brønde plader (n-5 replikaer) og blev behandlet i en time med en række anticancerlægemidler ved en række koncentrationer, herunder klinisk relevant dosering (tabel 2). ChemoID assay blev udført ved hjælp af et panel af lægemidler bestående af cisplatin, oxaliplatin, arabinosid-C, VP-16, busulfan, methotrexat, irinotecan og bevacizumab som vælges af den behandlende onkolog.

Følsomhed over for kemoterapi blev vurderet ved 48 timer efter WST8 levedygtighed assay. Det blev kategoriseret som følger baseret på den procentdel af ikke-levedygtige celler: responsive (0-40% celleoverlevelse), mellemprodukt (40-70% celleoverlevelse), og ikke-responderende (70-100% celleoverlevelse). Den WST8 assay blev udført tre separate gange med n-5 såvel replikaer /lægemiddel /dosis hver gang.

ChemoID assay viste, at ependymoma celler dyrket i monolag og repræsenterer størstedelen af ​​tumorceller var følsomme for klinisk relevante doser cisplatin, irinotecan, busulfan, og en kombination af irinotecan og bevacizumab på en statistisk signifikant måde (p 0,05). Interessant nok CSLCs var følsomme over for en kombination af irinotecan og bevacizumab (p 0,05), mellemliggende følsomme over for cisplatin, og irinotecan, men ikke følsomme over for busulfan. På den anden side, både CSLCs og hovedparten af ​​tumorceller var ikke reagerer på methotrexat, oxaliplatin, arabinosid-C, og VP-16 (figur 4).

1 × 10∧3 hovedparten af ​​tumorceller eller CSLCs udpladet i 5 replikaer i 96-brønds plader blev provokeret til 1 times puls med et panel af anticancerlægemidler angivet med onkolog. En WST-8 assay blev udført 48 timer efter kemoterapi behandlinger til at vurdere cellernes levedygtighed. Data afbildes i søjlediagram som reagerer (0-40% cellelevedygtighed), moderat responsiv (40-70% cellelevedygtighed), og ikke-responderende (70-100% cellelevedygtighed). Lys grå bar repræsenterer følsomhed CSLCs til kemoterapi med hensyn til negative ubehandlede kontrol celler. Mørkegrå bjælke repræsenterer følsomhed hovedparten af ​​tumorceller til kemoterapi i forhold til negative ubehandlede kontrolceller. Anticancerlægemidler testede angivet ved bunden af ​​diagrammet. Statistisk analyse af betydningen af ​​resultaterne blev udført med en 1-vejs ANOVA. Stjerner angiver

p

værdier på mindre end 0,05.

På grund af den manglende reaktion på en oxaliplatin og etoposid ledelse givet i august 2009 (figur 2B) (som blev startet før modtage resultaterne fra ChemoID assay), den patient gennemgik i oktober 2009 en behandling med bevacizumab og irinotecan, som blev administreret hver anden uge i 6 måneder. I en opfølgende MR scanne maj 2010 patient viste indledende sygdom regression resterende fri sygdomsprogression i 18 måneder (Figur 2 C og D). Dette svarede til den længste sygdomsprogression periode observeret i denne patient uden større de-bulking kirurgi.

Gentagelse af tumorvækst efter 18 måneders sygdomsfri progression førte os til at udforske nye terapeutiske metoder til behandling af denne patients kræft. I den forbindelse blev kombinationskemoterapi undersøgt for at identificere naturlige forbindelser, der kan øge den kliniske effekt af lægemidler mod cancer.

BITC er blevet vist i andre laboratorier [14], [15] for at øge kemosensitivitet af cancer celler. Vi har for nylig observeret i vores laboratorium (data ikke vist), benzyl-isothiocyanat (BITC) stiger specifikt kemosensitivitet af CD133 positive cancerceller. Fordi de primære ependymoma celler i vores patient viste en høj procentdel af celler positive til CD133, vi ønskede at teste hypotesen om, at BITC kunne øge deres kemosensitivitet til irinotecan og bevacizumab. Vi fandt med ChemoID assay, stigende koncentrationer af BITC i området fra 2,5 pM til 20 uM faldt levedygtighed CD133 (+) ependymoma celler af patient 1 fra 90% til 62% på en statistisk signifikant måde (figur 5A). ChemoID assay også bestemt, at kombinationen af ​​irinotecan og en ikke-toksisk koncentration på 10 uM BITC reducerede levedygtigheden af ​​ependymoma celler fra 60% til 40% (over 40% mere chemosensitive sammenlignet med ikke BITC behandlede celler) (figur 5 B) . Derudover er kombinationen af ​​irinotecan og bevacizumab med BITC reduceres endnu mere levedygtighed ependymoma celler til 30% (figur 5 B). Patienten blev behandlet med irinotecan og bevacizumab, men denne gang med kombinationen af ​​2 kapsler /dag af en Triple Action korsblomstrede planteekstrakt indeholdende høj koncentration af BITC (LifeExtension, https://www.lef.org), til to måneder. Efter kombinationsbehandling med irinotecan, bevacizumab og tillægget af korsblomstrede grøntsager, har vi observeret en 4 cm regression (hvilket svarer til en 50% regression) af læsionerne i brysthulen og det cervikale område [sammenlign figur 5C (ved gentagelse) til Figur 5D (efter behandling)]. Derudover rapporterer vi, at patienten var i stand til at tolerere hele forløbet af irinotecan og bevacizumab kemoterapi med mindre træthed og tolerance over for kulde.

A) 1 × 10∧3 CSLCs forgyldt i 5 replikaer i 96 brønde pladerne blev udfordret for 1 times puls med 2,5, 10, og 20 uM BITC. En WST-8 assay blev udført 48 timer efter behandling for at vurdere cellernes levedygtighed. B) 1 × 10∧3 CSLCs udpladet i 5 replikaer i 96-brønds plader blev provokeret til 1 times puls med 10 pM BITC efterfulgt af 1 times puls med 0,5 mM CPT-11. En WST-8 assay blev udført 48 timer efter kemoterapi behandling for at vurdere cellernes levedygtighed. Data afbildes i søjlediagram som reagerer (0-40% cellelevedygtighed), moderat responsiv (40-70% cellelevedygtighed), og ikke-responderende (70-100% cellelevedygtighed). Lys grå bar repræsenterer følsomhed CSLCs til kemoterapi med hensyn til negative ubehandlede kontrol celler. Mørkegrå bjælke repræsenterer følsomhed hovedparten af ​​tumorceller til kemoterapi i forhold til negative ubehandlede kontrolceller. Statistisk analyse af betydningen af ​​resultaterne blev udført med en 1-vejs ANOVA. Stjerner angiver

p

værdier på mindre end 0,05. C) 2012 MRI af livmoderhalskræft og brysthvirvelsøjle der får recidiv efter en 18 måneder progressionsfri periode. D) 2012 MRI af halshvirvelsøjlen viser markant tumorregression af brysthvirvelsøjlen læsion efter kombineret behandling med irinotecan (CPT11), bevacizumab (Avastin), og BITC tilskud.

Effekten af ​​kemoterapier screenet i vitro ved ChemoID assay blev testet på ependymoma celler fra patient 1, som var xenotransplanteret i en NOD-

Scid

musemodel (figur 6 a og B).