PLoS ONE: E2F Hæmning synergistisk med paclitaxel i Lung Cancer Cell Lines

abstrakt

CDK /RB /E2F-vejen er almindeligt forstyrret i lungekræft, og således, forudsiges det, at blokering af E2F-vejen ville have terapeutisk potentiale. For at teste denne hypotese har vi undersøgt aktiviteten af ​​HLM006474 (et lille molekyle pan-E2F-inhibitor) i lungekræft cellelinier som et enkelt middel og i kombination med andre forbindelser. HLM006474 reducerer levedygtigheden af ​​både SCLC og NSCLC linjer med et biologisk IC

50, der varierer mellem 15 og 75 uM, men med ingen signifikant forskel mellem grupperne. Kombination af HLM006474 med cisplatin og gemcitabin demonstrere lidt synergi; dog HLM006474 synergizes med paclitaxel. Overraskende opdagede vi, at kortvarig behandling af celler med HLM006474 ført til en stigning af E2F3 proteinniveauer (på grund af de-repression af disse promotorsteder). Da paclitaxel følsomhed er blevet vist at korrelere med E2F3 niveauer, vi hypotese, at HLM006474 synergi med paclitaxel kan medieres af forbigående induktion af E2F3. For at teste dette blev H1299 celler udtømt for E2F3a og E2F3b med siRNA og behandles med paclitaxel. Assays af proliferation viste, at begge siRNA’er væsentligt reduceret paclitaxel følsomhed, som forventet. Taget sammen antyder disse resultater, at HLM006474 kan have effekt i lungekræft og kan være nyttige i kombination med taxaner

Henvisning:. Kurtyka CA, Chen L, Cress WD (2014) E2F Inhibering synergistisk med paclitaxel i Lung Cancer cellelinier. PLoS ONE 9 (5): e96357. doi: 10,1371 /journal.pone.0096357

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: 18. december 2013; Accepteret: April 4, 2014; Udgivet: 15. maj 2014

Copyright: © 2014 Kurtyka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Cancer Institute (CA119997), den Bankhead Coley Cancer Research Program for Florida Department of Health (FDH 08BB-05) og Moffitt Cancer center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. WDC er en opfinder på US patent 8.202.886 B2 afholdt af University of South Florida. Ellers forfatterne har ingen interessekonflikt. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

retinoblastoma protein (kaldet Rb) er bredt anerkendt som en af ​​de vigtigste tumorsuppressorer hos mennesker. Sammen med de tilsvarende “lomme” proteiner p107 og p130, er ansvarlig for at regulere cellecyklusprogression [1]. Rb familien regulerer cellecyklus gennem binding og inhibering af transkriptionel aktivitet af tidlige 2 faktorer (E2F’ere) og dets tumorsuppressoraktivitet er tæt relateret til denne funktion [2]. Når phosphoryleret (typisk ved CDK’er 2, 4 og 6 i G1), bliver Rb inaktiveret, og dermed frigøres E2F’ere og tillade cellecyklusprogression [3]. For at undgå afvigende post cellecyklus, CDK-inhibitorer, såsom CDKN2A (almindeligvis kendt som p16) forhindre CDK’er fra phosphorylere Rb og tvinger cellerne til at forblive i G1 [4].

Afhængigt kontekst, E2F-familiemedlemmer kan tjene som transkriptionelle aktivatorer, der driver cellecyklusprogression eller transkriptionelle repressorer, der hæmmer cellecyklusprogression [5]. Som aktivatorer, der E2F’ere anerkendt som værende vigtige i spredningen via deres transkriptionel aktivering af S-fase gener. E2F’ere aktivere transkription via association med histonacetyltransferase (HAT) aktivitet [6], [7]. Som repressorer, E2F’ere inhibere transkription af gener anvendes i S-fase indtastning ved binding til deres promotorer og undertrykke transkription gennem deres evne til at binde til Rb og andre lommeproteiner, som igen rekruttere kromatin modifikatorer såsom histondeacetylaser (HDAC’er) [6] – [8]. Af alle de E2F-familiemedlemmer, E2F3 er den eneste individuelt nødvendig for cellulær proliferation at forekomme [9] – [13]. E2F3 er vigtig for transkription af forskellige gener til S-fasen post og har vist sig at have roller i transskribere gener nødvendige for G2 /M-faser (såsom Aurora kinase A [14], CDC2 [15], og cyclin B1 [15], [16]). Der er to E2F3 isoformer, E2F3a og E2F3b, hver som følge af transskription på to forskellige promotorer. E2F3b niveauer forbliver konstant gennem hele cellecyklus, mens E2F3a niveauer svinge og nå peak ekspressionsniveauerne omkring G1 /S overgang [17] – [19]. Mus knockout undersøgelser viser, at E2F3a og E2F3b generelt kompenserende for hinanden [20], [21], men sletning af begge isoformer er dødelig [9], [20]. Endelig er E2F3 mere stærkt udtrykt i flere kræftformer (se [5] for en gennemgang), herunder lunge [22] og dens aktivitet er blevet korreleret med øget følsomhed over for taxan behandling i ovariecancer [23] og ER-negative brystkræft [ ,,,0],24].

CDK /RB /E2F-vejen afbrydes i næsten alle tilfælde af human lungecancer, den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan [25]. I småcellet lungecancer (SCLC), som tegner sig for ca. 15% af lungekræft, den mest almindelige mekanisme af Rb pathway afbrydelse er mutation af Rb-proteinet selv. Faktisk omkring 90% af småcellet lungekræft mangler et funktionelt Rb protein [26], [27]. I modsætning hertil i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), Rb mutation udgør 15-30% af disse cancere [26], [28], og dereguleringen af ​​CDK /RB /E2F-vejen mere almindeligt forekommer via nedregulering af CDK inhibitor p16 [29] – [32]. I de fleste tilfælde af NSCLC, hvor

RB1 ​​

gen er intakt, hæmmere af CDK4 og 6 ville repræsentere en potentiel måde at målrette denne vej. Denne hypotese er blevet undersøgt i flere kliniske forsøg og foreløbige resultater i brystkræft er meget lovende [33] – [35]., Hvilket tyder på, at CDK /RB /E2F pathway hæmmere kan have en vigtig rolle at spille i behandlingen af ​​forskellige kræftformer

fordelen ved CDK-inhibitorer kan være begrænset til tumorer, hvori Rb protein tilbage WT og funktionel, og således, reagenser, der kan målrette denne vej nedstrøms for Rb kan være nyttig i cancere, hvor Rb er almindeligt muterede (såsom lungekræft). For at teste denne hypotese har vi undersøgt aktiviteten af ​​HLM006474 mod et panel af lungekræft cellelinier. HLM006474 (også omtalt her som 6474) er et lille molekyle pan-inhibitor af E2F-DNA-binding [36]. Selvom IC

50 i HLM006474 er relativt høj (30 uM), har det fundet anvendelse som et redskab forbindelse [37] – [40].

In vivo

studier indikerer, at virkningerne af 6474-behandling på forskellige cellelinier omfattede en reduktion i celleproliferation og en stigning i apoptose og nedsat invasion i en tredimensionel vævskultur modelsystem [36]. HLM006474 kan være nyttige i forebyggelse af kræft ved at føre til en stigning i apoptose og fald i proliferation i tumorgene humane embryonale stamceller [39] samt fører til et fald i tumor dannelse i musefostre tilbøjelige til retinoblastoma [40]. Tilsammen antyder disse resultater, at interferens med E2F-aktivitet ved anvendelse små molekyler kan have klinisk anvendelse i cancerterapi. I den nuværende arbejde, giver vi en mere grundig karakteristik af 6474 i forbindelse med lungekræft. HLM006474 reducerer levedygtigheden af ​​en bred vifte af cellelinier med en biologisk IC

50, der varierer mellem 15 og 75 uM. Kombination af HLM006474 med fælles kemoterapeutika cisplatin og gemcitabin demonstrerer lidt synergi; dog HLM006474 synergizes med paclitaxel. Taget sammen antyder disse resultater, at HLM006474 kan have effektivitet mod cancere, hvor E2F dereguleres og kan være nyttige i kombination med andre lægemidler, der er målrettet cellecyklus komponenter. Salg

Materialer og metoder Salg

Cellelinjer og kemiske forbindelser

lungekræft cellelinjer blev opnået fra ATCC eller ophavsmændene og blev leveret af Moffitt SPORE i Lung Cancer Cell Core facilitet. Alle linjer er bekræftet af genotypning og vedligeholdes fri for

Mycoplasma

. SCLC-cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS og 1% pen /strep. NSCLC cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS uden antibiotika. HLM006474 blev syntetiseret og valideret af Moffitt Kemi Core som tidligere beskrevet [36]. Gemcitabin (Gemzar, Eli Lilly) blev købt gennem Moffitt Apotek og opløst i vand. Cisplatin og paclitaxel blev indkøbt fra Sigma og koncentrerede stamopløsninger blev fremstillet i dimethylsulfoxid.

siRNA knockdown

Celler udpladet ved -50% konfluens i 6-brønds plader blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies) ifølge leverandørens instruktioner med 200 pmol af enten siGENOME Ikke-targeting siRNA # 2 (Dharmacon) eller siRNA målrettet E2F3a eller E2F3b som beskrevet i en afhandling af Hurst

et al

[41]. Celler blev høstet fire timer efter transfektion for levedygtighed celleassay (som beskrevet nedenfor). De resterende celler blev re-belagt og høstet til Western blot-analyse 24 timer efter transfektion.

Levedygtighed analyser

antiproliferative aktivitet af forbindelser og kombinationer blev evalueret ved hjælp af en high-throughput CellTiter-Blå celleviabilitetstest (Promega), som tidligere beskrevet [42]. For assays, blev 1000 celler i 24 pi udpladet i 384-brønds plader og inkuberet natten over ved 37 ° C, 5% CO

2. Den næste dag blev lægemidlerne fortyndet i medier og 6 pi af disse fortyndinger sættes til passende brønde anvendelse af en automatiseret pipettestation. Fire replikatbrønde blev anvendt til hver medikamentkoncentration. Cellerne blev inkuberet med lægemidlet i 120 timer, på hvilket tidspunkt, blev 5 pi CellTiter-Blå reagens (Promega Corp., Madison, WI) tilsat. Cellelevedygtighed blev vurderet ved evnen af ​​de tilbageværende behandlede celler til bioreduce resazurin til resorufin (579 nm Ex /584 nm Em). Fluorescens blev læst med en Synergy HT mikropladelæser (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). IC

50’erne blev bestemt under anvendelse af en S-formet ligevægtsmodel regression ved anvendelse XLfit udgave 4.3.2 (ID Business Solutions Ltd.) og er defineret som koncentrationen af ​​lægemiddel kræves for en reduktion i vækst /levedygtighed 50%. For 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) cellelevedygtighedsassays, CellTiter 96 Aqueous One Solution fra Promega blev tilsat ifølge leverandørens instruktioner til cellerne i 2 timer efter behandling med lægemiddel ved den anførte dosis i 72 timer. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og gentaget mindst tre gange.

Kombi indekser

IC

50 værdier opnået fra enkelte spiredygtighed medikamentcellen assays blev anvendt til at designe kombinationseksperimenter. For 6474 kombinationer med cisplatin, gemcitabin og paclitaxel disse nøgletal var 01:01, 500:1 og 4000:1 hhv. For narkotika kombination eksperimenter blev cellelevedygtighedsassays udført, og resultaterne analyseret for synergistisk, additiv, eller antagonistiske virkninger ved hjælp af kombinationen indeks (CI) metode udviklet af Chou og Talalay [43]. Kombination indekser CI 1, CI = 1, og CI 1 indikerer synergisme, additiv effekt, og antagonisme henholdsvis

Antistoffer og vestlige blotting

Western blots blev udført som beskrevet tidligere [36. ], [44], [45]. Kort fortalt blev helcellelysater underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membran. Påvisning af proteiner blev udført under anvendelse af peberrod-peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer og forøget kemiluminescens (ECL) indkøbt fra Amersham eller Thermo Scientific. Forskellige antistoffer anvendt inkluderet E2F1 (C-20, SC-193, Santa Cruz), E2F3 (C-18, sc-878, Santa Cruz), PARP (# 9542L, Cell Signaling Technology), og monoklonalt β-actin (klon AC -15, kat nr: A5441, Sigma). Adobe Photoshop CS blev anvendt til at kvantificere vestlige skamplet band intensitet aflæsninger direkte fra eksponerede film ved hjælp af den rektangulære markeringsrammeværktøj /histogram og det inverterede scannede film billede. Denne samme firkant blev anvendt til alle yderligere band aflæsninger for at sikre, at det samme område blev analyseret for hvert bånd. Aflæsningerne blev derefter justeret til at redegøre for actin og baggrund og vilkårligt normaliseret til cellelinie H23 (tildelt en værdi på 1).

Real-time polymerasekædereaktion

RNA blev høstet fra celler under anvendelse af RNeasy mini kit fra Qiagen. Revers transkription polymerasekædereaktion (PCR) blev derefter udført under anvendelse af iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad). Dette cDNA blev derefter anvendt i real-time PCR under anvendelse af enten iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) eller Perfecta SYBR Green SuperMix (Quanta Biosciences, VWR). E2F1, E2F3, E2F4, tubulin, blev MCM2-, MCM10, CCNE2, og GAPDH primere bestilt fra Integrated DNA Technologies. Primersekvenser er som følger: E2F1 F (5′-GCTGGACCACCTGATGAATATC-3 ‘), E2F1 R (5′-TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG-3′), E2F3a /b F (5’-CGTCTCTTGGTCTGCTCAC-3 ‘), E2F3a /b R (5 ‘-CACTTCTGCTGCCTTGTTC-3’), E2F4 F (5’CTGAAGAGTGTGAGTGGTC 3 ‘), E2F4 R (5’GCAGAGGTGGAGGTGTAG 3′), tubulin F (5’-GGGGCTGGGTAAATGGCAAA-3 ‘), tubulin R (5’ TGGCACTGGCTCTGGGTTCG-3 ‘), MCM2 F (5′-CTGTGTGTGGTGAGGGACAC-3′), MCM2 R (5’-CTTGTCCTGGTCCATCTGGT-3 ‘), MCM10 F (5′-CGTCAGTGAGCAGCATGAAT-3′), MCM10 R (5’-TCCCGTTCCCATTTGTAGAG- 3 ‘), CCNE2 F (5′-CAGGTTTGGAGTGGGACAGT-3′), CCNE2 R (5’-ACTTCCTCCAGCATAGCCAA-3 ‘), GAPDH F (5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′), og GAPDH R (5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ‘).

Statistisk analyse

i den realtids-PCR-analyse for det tidspunkt eksperimentet, forskellen mellem ekspression af hvert eksperimentelt gen (E2F1, E2F3, E2F4, CCNE2, MCM2, og MCM10) og ekspression af kontrol-genet (tubulin) blev beregnet for hver cellelinje på hvert tidspunkt. Forskellen mellem hver af de ikke-0 time tidspunkter og 0 timers tidspunktet aflæsninger for hvert gen i hver cellelinje blev beregnet under anvendelse t-tests med Welch korrektion. Paclitaxel IC

50’erne blev log-transformeret for at forbedre normalitet. Korrelationen af ​​E2F3 mRNA og protein-ekspression med log paclitaxel IC

50’erne blev beregnet ved hjælp af Pearson korrelationskoefficient. Wilcoxon rank-sum test blev anvendt til at undersøge forskellen i cellelevedygtighed i kontrol siRNA behandling med enten E2F3a eller E2F3b siRNA behandling.

Resultater

HLM006474 har bred antiproliferativ aktivitet

for at undersøge potentialet i 6474 til behandling af lungekræft, vi bestemmes 6474 IC

50 i sytten lungekræft-cellelinjer (tabel 1). Denne analyse omfattede otte ikke-småcellet lungekræft linjer (NSCLC) og ni småcellet lungekræft linjer (SCLC). I denne levedygtighed assay blev cellerne udpladet ved lav densitet på dag nul og blev dyrket i nærværelse af forskellige koncentrationer 6474 i fem dage. Efter fem dage blev den relative levedygtighed af celler bestemt ved farvning med CT-blå (Promega). Resultaterne viser, at 6474 IC

50 spænder fra -15 til -75 uM på tværs af de sytten cellelinjer. Den gennemsnitlige biologiske IC

50 af alle cellelinier blev 31,4 (6,1) uM, som i det væsentlige er identisk med den biokemiske IC

50 på 29,8 (± 7,6 pM, tidligere rapporteret [36]. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem SCLC og NSCLC.

Korte behandlinger med HLM006474 fører til forøget ekspression af flere kendte E2F-regulerede gener

Som en del af vores analyse af HLM006474, vi undersøgte udtrykket af E2F-familiemedlemmer efter behandling ved Western blotting. NSCLC cellelinier H292 og H1299 blev behandlet med 60 pM HLM006474 i 0, 3, 6, 9, 12 og 24 timer og analyseret via western blot (Figur 1 A). Overraskende protein niveauer af både E2F3a og b isoformer steget i tidlige tidspunkter (typisk omkring 6-9 timer). niveauer af E2F1 protein steg mere beskedent efter behandling, topper mellem 6 og 12 timer, og vender tilbage til baseline niveau efter 24 timer. i real- PCR-analyse med tubulin som en kontrol, E2F3 mRNA-niveauer steg markant efter 3 timers behandling og faldt så i hvert efterfølgende tidspunkt (figur 1B), mens E2F1 mRNA ekspressionsniveauer blev forøget markant efter korte behandlingstider i H292 alene (figur 1C ) og E2F4-niveauer forblev konstant eller reduceres på hvert tidspunkt (figur 1 D). Det var også bemærket, at nogle gener almindeligvis reguleres af E2F’ere; MCM10 (figur 1E), MCM2 (figur 1F), og CCNE2 (figur 1G); blev mere stærkt udtrykt i tidlige tidspunkter på en måde sammenlignelig med de ændringer, der ses i E2F3 mRNA-ekspression. De i figur 1 resultater antyder, at behandling med en inhibitor af E2F-DNA binding kan resultere i aktivering af E2F-regulerede mål, herunder auto-regulerede E2F-familiemedlemmer. E2F-familien er kendt for at aktivt undertrykke transkription [46] – [49], og således, foreslår vi, at behandling med HLM006474 kan fortrænge E2F-repressive komplekser og derved aktivere transkription af E2F-regulere gener, som overvejende undertrykt af E2F komplekser. For at undersøge denne mulighed, brugte vi siRNA specifikt mod E2F1, E2F3a, E2F3b, E2F4 og Rb at nedbryder to NSCLC cellelinier af forskellige E2F komplekser. Microarray blev udført for at undersøge virkningen af ​​disse siRNA’er på ekspressionen af ​​et E2F signatur tidligere defineret baseret på E2F3 overekspression [50]. Resultaterne, som vil blive offentliggjort andetsteds, viser, at udtømning af individuelle E2F’ere resultater i mange E2F signatur gener aktiveres, som man ville forvente fra en de-repression model.

A

. De NSCLC cellelinier H1299 og H292 blev behandlet med 60 pM HLM006474 i 0, 3, 6, 9, 12, og 24 timer, derefter høstet og undersøgt gennem Western blots. Beskedne stigninger i E2F1 og mere dramatiske stigninger i E2F3a og b protein niveauer blev noteret på tidlig tidspunkt i begge cellelinier.

B-D

. mRNA blev høstet fra celler, der blev behandlet som beskrevet i 1A, omdannes til cDNA ved hjælp af RT-PCR, og analyseret for ekspressionsniveauer af E3F3 (

B

), E2F1 (

C

), og E2F4 (

D

) ved hjælp af real-time PCR og tubulin som en kontrol. Korte behandlinger med 6474 ændret mRNA ekspressionsniveauer af E2F3 og E2F1, men ikke E2F4.

E-G.

MRNA-ekspression af kendte gener almindeligvis reguleres af E2F’ere blev analyseret på en måde svarende til den tidligere beskrivelse i 1B-D. Ekspressionsniveauer af MCM10 (

E

), MCM2 (

F

), og CCNE2 (

G

) mRNA blev analyseret med tubulin som kontrol og blev alle noteret for at være mere stærkt udtrykt efter korte behandlinger med 6474. Noter: ns repræsenterer ikke signifikant, * repræsenterer p 0,05, ** repræsenterer p. 0,01

HLM006474 synergistisk med paclitaxel

Efter at have konstateret, at 6474 har anti-proliferative virkninger på lungekræft-cellelinjer , men kan påvirke E2F-regulerede gener på en kompleks måde, søgte vi at bestemme, om 6474 ville virke synergistisk med kemoterapeutiske lægemidler, der almindeligvis anvendes i lungekræft behandling. H1299-celler blev behandlet med 6474 alene og i kombination med cisplatin, gemcitabin og paclitaxel. Kombinationer blev valgt baseret på IC

50 af cellerne til de enkelte forbindelser og kombination indeks blev beregnet [43]. Figur 2 viser, at der er et modsætningsforhold mellem 6474 og cisplatin (panel 2A, CI gennemsnit 1,40) og gemcitabin (panel 2B, CI gennemsnit 1,39). Derimod 6474 svagt synergistisk med paclitaxel (panel 2C, CI gennemsnit 0,98). For yderligere at undersøge arten af ​​synergien mellem 6474 og paclitaxel blev H1299-celler behandlet med beskedne doser af hvert lægemiddel alene eller i kombination og anvendes i Western blot-analyse. Udseendet af spaltet PARP i celler behandlet med lægemiddelkombinationen bekræfter, at kombinationen af ​​6474 og paclitaxel inducerer mere apoptosis end hvert lægemiddel alene (figur 2D). For at undersøge, om denne synergi ville blive observeret i yderligere cellelinjer, vi også undersøgt NSCLC cellelinie H292. Som i tilfældet med H1299 celler, 6474 synergieffekt med paclitaxel (panel 2G, CI gennemsnit 0,96), men viste ingen synergi med cisplatin (panel 2E, CI gennemsnit 1,51) eller gemcitabin (panel 2F, CI gennemsnit 1,46).

A-C.

H1299 celler blev udsat for rentabilitet analyser i overværelse af 6474 (HLM) kombineret med cisplatin (

En

, CisPt), gemcitabin (

B

, perle) og paclitaxel (

C

, Pac), som angivet (se metoder). Resultater afslører synergi med paclitaxel (CI gennemsnit 0,98) og antagonisme med cisplatin og gemcitabin (CI gennemsnit 1,40 og 1,39, henholdsvis).

D

. Western blotting afslører, at i H1299-celler behandlet i 72 timer med 20 pM 6474 alene, 5 nM paclitaxel alene, eller kombinationen af ​​de to, 6474 og paclitaxel synergi i induktionen af ​​PARP-spaltning.

E

–

G

. H292 celler blev testet i lignende levedygtighed assays at fastlægge effekten af ​​6474 (HLM) kombineret med cisplatin (

E

, CisPt), gemcitabin (

F

, perle) og paclitaxel (

G

, Pac). Som det ses i H1299-celler, 6474 synergistisk med paclitaxel (Cl gennemsnit 0,96), men er antagonistisk med cisplatin (Cl gennemsnit 1,51) og gemcitabin (CI gennemsnit 1,46).

E2F3 niveauer indvirkning følsomhed over for paclitaxel

de observationer, som en E2F inhibitor kunne synergi med paclitaxel og den tidligere diskuteret stigning i E2F3 niveauer efter tidlige tidspunkt behandlinger med HLM006474 foreslog, at E2F3 aktivitet kan spille en rolle i paclitaxel følsomhed. Real-time PCR blev anvendt til at analysere den endogene ekspression af E2F3 (med GAPDH tjente som en intern kontrol), og derefter disse værdier blev korreleret til paclitaxel LOGIC

50 af hver cellelinje (figur 3A). Lysater fra ti NSCLC cellelinier blev kørt i Western blots (figur 3B) og densitometrisk analyseret ved anvendelse β-actin som kontrol. Disse E2F niveauer blev derefter plottet mod den tilsvarende paclitaxel LOGIC

50 værdier (figur 3C). I både real-time PCR og Western blot-analyser, en stærk invers korrelation mellem E2F3 og paclitaxel IC

50 blev noteret. Til mere formelt teste denne hypotese, brugte vi siRNA at nedbryder H1299 celler E2F3a og E2F3b og derefter bestemmes deres følsomhed over for paclitaxel som målt i MTS-analyser. Western blotting afslører en næsten fuldstændig knockdown af de målrettede E2F’ere i H1299 celler (Fig 4A). Kontrol siRNA’er påvirkede ikke E2F udtryk. Som forventet, Fig 4B afslører, at cellerne med nedsat E2F3 niveauer var mindre følsomme over for paclitaxel.

A

. cDNA fra ti NSCLC cellelinier blev anvendt i realtids-PCR til påvisning af endogene E2F3 ekspressionsniveauer (sammenlignet med GAPDH som kontrol). Ekspressionsniveauerne blev derefter sammenlignet med paclitaxel LOGIC

50 af hver linje og plottes som vist.

B

. Lysater fra ti NSCLC cellelinier blev fremstillet og kørte i et Western-blot til påvisning endogene E2F3 niveauer.

C

. Densitometrisk analyse værdier af proteinet ekspressionsniveauer (sammenlignet med p-actin som kontrol) blev derefter afbildet mod paclitaxel LOGIC

50 for hver linie som vist.

A

. H1299-celler blev transient transficeret med 200 pmol kontrol, E2F3a eller E2F3b siRNA og høstet efter 24 timer. Western blots af disse lysater demonstrerer omfanget af E2F knockdown.

B

. MTS assays blev anvendt til at bestemme følsomheden af ​​hver cellelinie til 50 nM paclitaxel. Celler med formindskede E2F3 niveauer var mere levedygtige i tilstedeværelse af paclitaxel end kontrol celler. Bemærkninger: * repræsenterer p 0,05, ** repræsenterer p 0,01

Konklusioner

CDK /Rb /E2F sti repræsenterer et godt mål for behandling af forskellige solide tumorer.. Selvom udviklingen har været langsom på grund af toksicitet af tidlige forbindelser, er CDK-inhibitorer begyndt at vinde trækkraft i kliniske forsøg [33], [51], [52]. Vi foreslår, at målretning af CDK /RB /E2F-vejen endnu længere nedstrøms, på E2F niveau, kan også være af værdi. Således har vi undersøgt potentialet i en pan-E2F-hæmmer, HLM006474, i behandlingen af ​​lungekræft.

Vi foreslår modellen i figur 5 for at forklare vores resultater. Først, vi observerer, at behandling med 6474 fører til en forbigående stigning i ikke bare E2F3-protein og mRNA ekspressionsniveauer, men også en stigning i mange andre E2F-regulerede transkripter. Disse counter-intuitive observationer er rimelig baseret på den længe kendte iagttagelse, at E2F’ere er aktive repressorer af transskription [46] – [49]; dog, de anledning til bekymring, at pan-E2F kompleks hæmning kan have uønskede konsekvenser. Derfor bør fremtidige E2F-målrettede forbindelser selektivt blokerer transskription aktivering E2F komplekser og reservedele transkriptionelle undertrykkende E2F komplekser. For det andet mener vi, de øgede niveauer af E2F3 (og sandsynlige andre E2F-regulerede gener) øge følsomheden af ​​cellerne til paclitaxel. Vi baserer denne konklusion på sammenhængen observeret mellem normale E2F3 niveauer og paclitaxel følsomhed, samt resultaterne af E2F3 siRNA eksperimenter. Dette dokumenterer den første forbindelse mellem niveauer af E2F3 og paclitaxel i NSCLC, selvom en relation mellem høje niveauer af E2F3-aktivitet og forøget følsomhed over for paclitaxel er tidligere blevet observeret i æggestokkene [23] og ER-negativ brystcancer [24]. Den mekanisme, hvorved E2F3 genererer følsomhed over for paclitaxel er ukendt. En mulighed er, at det direkte vedrører E2F3 rolle i cellecyklus. For eksempel i celler med høj E2F3 niveauer, det ville forventes, at cellerne vil proliferere mere, hvilket giver celler større mulighed for at indtaste M fase (hvor paclitaxel vil være mest effektivt). denne forklaring alene, ville imidlertid foreslår, at disse celler er mere følsomme over for gemcitabin samt grundet indtastning S fasen oftere. Det kan være mere sandsynligt, at større følsomhed over for paclitaxel skyldes apoptose-regulering gener bliver kraftigt udtrykt på grund af stigningen i E2F3. Det har også været tidligere bemærket, at overekspression af E2F3 fører til en berigelse af gener, der er mikrotubulus-relaterede [23], så dette kunne måske forklare korrelationerne ser vi mellem E2F3 niveauer og paclitaxel følsomhed. Ligeledes som tidligere nævnt, E2F3 er blevet bemærket at have en rolle ved G2 /M checkpoint gennem dens regulering af ekspression af Aurora kinase A [14], CDC2 [15], og cyclin B1 [15], [16], som kan også pege på højere niveauer af E2F3 fører til en stigning i celler ind, at fasen af ​​cellecyklus og måske derefter stigende paclitaxel følsomhed.

i ubehandlede celler, E2F /dimerisering partner (DP) /Rb komplekser dominerer, og således, E2F3 niveauer er relativ lav (såvel som mange andre E2F-regulerede gener). Behandling med HLM006474 forstyrrer E2F /DP /Rb repressive komplekser fra bindende DNA, hvilket resulterer i øget transskription af E2F3 (samt mange andre E2F-regulerede gener). I denne model er de forhøjede niveauer af E2F3 sensibilisere celler til taxan behandling, som tidligere demonstreret, gennem en ukendt mekanisme.

Vi har vist, at HLM006474 er effektivt til lungekræft cellelinier. Vi har desuden vist, at 6474 synergizes godt med paclitaxel, potentielt skyldes 6474 virkninger på E2F3 niveauer. Taget sammen antyder disse resultater, at kraftig, specifik aktivator E2F inhibering kan være nyttig i behandlingen af ​​NSCLC i fremtiden (især i kombination med andre midler), og at E2F3-niveauer kan være en god indikator af paclitaxel følsomhed i NSCLC.

Tak

de mange generøse gaver af reagenser er anerkendt i de materialer og metoder.

Dr. Fumi Kinose af Moffitt s SPORE i Lung Cancer Cell Core facilitet forudsat valideret cellelinjer, herunder dem, venligst doneret af laboratoriet af John D. Minna ved University of Texas Southwestern i Dallas. Dr. Dung-Tsa Chen og Jimmy Fulp af Moffitt s Biostatistik Core udført statistisk analyse. Drs. Christopher L. Cubitt og Shumin Zhang af Moffitt s Experimental Therapeutics Core udførte levedygtighed assays og dataanalyse.