PLoS ONE: Pramanicin Analog fremkalder apoptose i Human Colon Cancer Cells: Kritiske roller for Bcl-2, Bim, og p38 MAPK Signaling

Abstrakt

Pramanicin (PMC) er et svampedræbende middel, der tidligere blev vist at udstille antiangiogeniske og anticancer egenskaber i et par

in vitro

undersøgelser. Vi screenede oprindeligt en række PMC analoger for deres cytotoksiske virkninger på HCT116 human colon cancerceller. PMC-A, blev analogen med den mest potente antiproliferative virkning valgt til yderligere forespørge den underliggende virkningsmekanisme. PMC-A førte til apoptose gennem aktivering af caspase-9 og -3. Den apoptotiske karakter af celledød blev bekræftet ved ophævelse af celledød med forbehandling med specifikke caspaseinhibitorer. Stressrelaterede MAPK’er JNK- og p38 blev begge aktiveret concomittantly med den indre apoptotiske vej. Desuden farmakologisk inhibering af p38 viste sig at dæmpe celledødsinduktion mens forbehandling med JNK-inhibitor ikke udviste en beskyttende virkning. Modstand Bax – /- celler og beskyttende karakter caspase-9-inhibering indikerer, at mitochondrier spiller en central rolle i PMC-A induceret apoptose. Tidlig post-eksponering elevation af cellulær Bim og Bax blev efterfulgt af en marginal Bcl-2 udtømning og Bid spaltning. Yderligere analyse afslørede, at Bcl-2 nedregulering optræder ved mRNA-niveauet og er kritisk at mediere PMC-A induceret apoptose, som ektopisk Bcl-2-ekspression i det væsentlige sparet cellerne fra døden. Omvendt tvungen ekspression af Bim vist sig at øge celledød. Desuden analyser af p53 – /- celler viste, at Bcl-2 /Bim /Bax modulation og MAPK aktiveringer foregår uafhængigt af p53-ekspression. Tilsammen p53-uafhængig transkriptionel Bcl-2 nedregulering og p38 signalering synes at være de vigtigste modulerende begivenheder i PMC-A induceret apoptose

Henvisning:. Bodur C, Kutuk O, Karsli-Uzunbas G, Isimjan TT, Harrison P, Basaga H (2013) Pramanicin Analog fremkalder apoptose i Human Colon Cancer Cells: Kritiske roller for Bcl-2, Bim, og p38 MAPK signalering. PLoS ONE 8 (2): e56369. doi: 10,1371 /journal.pone.0056369

Redaktør: Jose Vina, University of Valencia, Spanien

Modtaget: 22 oktober, 2012; Accepteret: 8. januar 2013; Udgivet: 18 februar 2013

Copyright: © 2013 Bodur et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansieringen for det arbejde blev leveret af Sabanci University fakultet forskningsmidler. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Et væld af naturligt forekommende eller syntetiserede molekyler er blevet screenet for deres terapeutiske anvendelse i human eller veterinær medicin. Efter længe været udnyttet som desinfektionsmidler og konserveringsmidler i industrien, har svampemidler ikke været undtagelser fra denne. Pramanicin (PMC) er en fungal fermentering produkt tilhørende en klasse af antifungale midler, der er defineret af en højt functionilized polært hoved og en alifatisk sidekæde. Den tidligere

in vitro

analyser på dyrkede endotel og leukæmiske T-celler bekræftet sin terapeutiske potentiale både som antiangiogenisk og anticancermiddel [1], [2].

Langvarig udsættelse for

in vitro

effektive doser af PMC blev tidligere vist at falde cellernes levedygtighed og udløse caspase-afhængig apoptose [2]. PMC-induceret celledød blev påvist at være medieret af aktivering af både stress-relaterede kinaser p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK), mens ekstracellulær reguleret kinase (ERK) aktivitet blev rapporteret signifikant falde ved udsættelse for midlet. Selv om en transient intracellulær stigning calcium blev rapporteret at følge PMC eksponering i dyrkede pulmonale endotelceller, var dette fænomen ikke synkroniseret med enten endothelial dysfunktion eller celledød [1].

Fysisk eller kemisk miljømæssige belastninger inklusive stråling, osmotisk stress , og oxidativ stress eller celleoverfladereceptor ligander, såsom vækstfaktorer, inflammatoriske cytokiner eller død receptorligander kan aktivere en kinase kaskade, der til sidst stimulerer stress-aktiverede MAPK’er p38 og JNK. Opstrøms serin /threonin-kinaser MAP-kinase kinase kinaser (MEKKs) og MAP kinase kinaser (MKKs) er ansvarlige for aktivering af phosphorylering og efterfølgende nukleare translokation af JNK og p38 [3]. Når den er aktiveret, er JNK og p38 vides at være i stand til apoptotisk modulation gennem aktivering /deaktivering af en række transkriptionsfaktorer.

Apoptose er en tæt reguleret celledød mekanisme, som aktiveres som reaktion på forskellige intra- /ekstracellulære stimuli såsom oxidativ stress og elektromagnetisk stråling, der skader cellulære makromolekyler eller signaler, herunder inflammatoriske cytokiner og vækstfaktorer. Apoptotiske udførelse overtages af en familie af cysteinproteaser kaldet caspaser, der aktiveres i en veldefineret måde [4]. Mens den indre vej er udløst af apoptogenic molekyle frigivelse fra mitochondrier, er den ydre vej aktiveret via ligandbinding til dødsreceptorer på celleoverfladen. Hvorvidt den intrinsiske eller extrinsiske apoptosecyklus vil være i aktion bestemmes generelt af beskaffenheden af ​​stimulus. Uafhængig af omsætningsvejen, som blev aktiveret i første omgang, både de indre og eksterne forløb kunne inddrages til amplifikation den apoptotiske signal under forskellige omstændigheder.

cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier som markerer point of no return for iboende apoptotisk aktivitet er uløseligt reguleret af interaktioner blandt Bcl-2-familien af ​​proteiner. Den fine balance mellem de anti- og proapoptotiske medlemmer af familien bestemmer apoptotiske belastning i cellen. Multidomain proapoptotiske Bcl-2-proteiner Bax og Bak har evnen af ​​homo- /heterooligomerization ved den ydre mitokondrielle membran (OMM), som bevirker permeabilisering af OMM og frigivelse af apoptogenic molekyler, herunder cytochrom c i cytosolen. Mens den antiapoptotiske Bcl-2 proteiner såsom Bd-2, Bd-XL, A1 og Mcl-1 holde proapoptotiske Bax /Bak afsondret forhindrer dem i at indlede OMM permeabilisering, proapoptotiske BH3 (Bcl-2 homologi 3)-kun proteiner, herunder Bim, Bid, Noxa, Bad og Puma kunne arbejde for at neutralisere antiapoptotiske medlemmer af familien [5], [6]. Selv om de nøjagtige mekanismer modulerer Bcl-2-proteiner stadig uklar i vid udstrækning, er balancen mellem relative cellulære beløb og aktiviteter af pro- og anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner kendt for at være strengt kontrolleret på gen- og protein-niveauer i raske pattedyrceller . I denne henseende cellulære niveauer af proapoptotiske BH3-only Bcl-2-proteiner i forhold til deres antiapoptotiske modstykker er kritisk at indstille Bax /Bak frit at indlede den iboende apoptotiske vej.

Ud over sine roller i DNA-reparation og cellecyklusregulering, har den velkendte tumor suppressor p53 vist sig at være i stand til direkte at regulere apoptose. Hidtil har denne regel blevet påvist at ske via modulering af Bcl-2-familien protein- eller død receptor udtryk. Foruden transkriptionelt at opregulere Bax, Bid, Puma, Noxa, Bak og transmembrane dødsreceptorer som en transkriptionsfaktor, blev p53 også rapporteret at være i stand til direkte at aktivere Bax på proteinniveauet [7] – [13]. Nylig dokumentation indikerer også, at p53 i sig selv også kan opføre sig som et BH3-only proapoptotiske protein til at antagonisere antiapoptotiske Bcl-2-proteiner samt forårsager transrepression af antiapoptotisk Bcl-2 gentransskription [14] – [17].

i denne undersøgelse definerer vi en mekanisme til intrinsic apoptosecyklus aktivering udløses af PMC-a, en potent PMC-analog, hvori epoxygruppen på sidekæden af ​​PMC erstattes af en alken (fig. 1). PMC-A medieret apoptose gennem p53-uafhængig aktivering af p38 og Bcl-2 nedregulering i HCT-116 humane coloncancer-celler. Samtidigt, Bax og Bim blev begge akkumuleret i celler udsat for PMC-A med efterfølgende Bid trunkering.

Materialer og metoder

Cell Kultur og behandlinger

Wild- type (wt) p53 – /-, og Bax – /- HCT116 humane coloncancer-celler blev venligst leveret af Bert Vogelstein (Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University, USA) [18], [19], dyrket i McCoys 5A suppleret med 10% HI FBS og 100 IU /ml penicillin /streptomycin. Kulturer blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Ethanol (max 0,5%, vol /vol) blev tilsat til alle kontrolbrønde /plader i hvert forsøg. Celler blev opsamlet, kvantificeret i komplet medium og udsået (100000 celler /ml) i 12-brønds, 6 brønd eller 60 mm dyrkningsplader afhængigt af forsøget. Pramanicin og analoger blev tilsat til dyrkningspladerne 36 timer senere. Pre-behandlinger med inhibitorer blev udført i 30 minutter før PMC-A behandling.

Reagenser og Analog Synthesis

Generelt.

Proton NMR-spektre blev optaget i CDC

3 eller cd

3OD på en Bruker AC-200 eller AC-600 spektrometer og er rapporteret som følger: kemisk skift δ (ppm); antal protoner, multiplicitet, koblingskonstant J (Hz) og tildeling. Resterende protiske opløsningsmidler CHC

3 (δ = 7,26 ppm) og CH

3OH (δ = 3,30) blev anvendt som den interne reference.

13C-NMR-spektre blev registreret i CDC

3 eller cd

3OD ved 50 MHz på et Bruker AC-200 og 150 MHz på et Bruker AC-600 spektrometer, ved hjælp af centrale resonans af CDC

3 (δ = 77,16 ppm) som intern reference. Infrarøde spektre blev registreret på et Perkin-Elmer 983G maskine. Massespektre blev opnået på et Micromass Quattro Ultima (LC-ESI /APCI tripel kvadrupol-massespektrometer) på kemi afdeling, McMaster University. Følgende ioniseringsteknikker blev anvendt: elektron ionisering (El), og elektrospray (ES). Smeltepunkter blev bestemt på en Reichert hot scene apparat. Optiske rotationer blev registreret på et Perkin-Elmer (241 MC polarimeter, λ = 589, Na-lampe).

Pramanicin (PMC) og pramanicin A (PMC-A) blev fremstillet som tidligere [20] beskrevne. Flashsøjlekromatografi blev udført på silicagel (silicagel 60). Tyndtlagskromatografi (TLC) blev udført på præcoatede silicaplader (Alugram SIL G /UV

254) og visualiseret ved UV, vanillin eller ceriammoniumnitrat opløsning. Vandige opløsninger blev mættet medmindre andet er angivet. Forholdet mellem opløsningsmidler i blandinger refererer til de anvendte mængder. Alle reaktioner blev udført under en nitrogen- eller argonatmosfære i ovntørret glas, der blev afkølet under en kontinuerlig strøm af nitrogen umiddelbart før anvendelse, medmindre andet er anført. THF blev destilleret fra natriumbenzophenonketyl, CH

2Cl

2 og toluen fra calciumhydrid, og EtOAc fra kaliumcarbonat. Andre opløsningsmidler og reagenser blev anvendt som leveret.

3-tetradecanoyl-1-vinylpyrrolidin-2-on (2).

Frisk destilleret

N

-vinylpyrrolidin-2- en (1) (0,96 ml, 9 mmol) blev tilsat til NaH (1,44 g, 36 mmol) i tilbagesvalende THF (15 ml). Blandingen blev omrørt i 30 minutter ved 90 ° C, og derefter ethylmyristat (4,3 ml, 10,3 mmol) blev tilsat. Efter 3 timer blev opløsningen opvarmet til stuetemperatur, quenchet med mættet vandig NH

4CL og ekstraheret med ether. Ekstrakterne blev tørret (Na

2SO

4), filtreret og koncentreret. Det resulterende faststof blev opløst i CH

2Cl

2, filtreret og koncentreret og oprenset ved kromatografi (CH

2Cl

2 /EtOAc, 01:01) for at give 2 som hvide krystaller (3,54 g , 82%): smp 39-40 ° C; IR (film) 2920, 2851 (C-H, str.), 1685, 1637 (C = O, str.), 1459 (C = C, bøjning.), 1391, 861 cm

1;

1H NMR (CDC

3, 200 MHz) δ 7,01 (1H, dd,

3J = 9,0,

3J = 16,0, NCH = CH

2), 4,46 (2H, m , NCH = CH

2), 3,68 (1H, dd,

3J = 9,0,

3J = 6,0, COCHCO), 3,54 (1H, ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,5, CH

2 N), 3,47 (1H, ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,7, CH

2 N) , 3,01 (1H, m, CH

2CH

2CO), 2,68 (1H, m, CH

2CH

2CO), 2,67 (1H, dddd,

2J = 13,8,

3J = 5,7,

3J = 8,5,

3J = 6,0, CH

2CH

2 N), 2,12 (1H, dddd,

2J = 13,6,

3J = 8,5,

3J = 9,0,

3J = 5,5, CH

2CH

2 N), 1,57 (2H, m, CH

2CH

2CO), 1,24 (20H, m, C

10H

20), 0,87 (3H, t,

2J = 6,7, CH

3CH

2);

13C NMR (CDC

3, 50 MHz); δ 204,2 (CH

2 CO), 169,9 (CON), 130,0 (NCH = CH

2), 94,5 (NCH = CH

2), 57,3 (COCHCO), 44,0 (CH

2 N) , 43,5 (CH

2CH

2 CO), 32,7, 30,4, 30,2, 29,8, 24,1, 23,5 (C

10H

20), 20,1 (CH

2CH

2CH

2), 14,9 (CH

3); MS (EI

+) m /z = 321 (M

⋅ +), HRMS (El) beregnet for C

20H

35NO

2 (M

⋅ +) 321,2668 , fundet 321,2679.

3-Tetradecanoylpyrrolidin-2-on (3).

Forbindelse 2 (520 mg, 1,6 mmol) blev opvarmet ved 90 ° C i en blanding af 95% C

2H

5OH (35 ml) og koncentreret HCI (0,5 ml). Reaktionen blev overvåget ved TLC. Opløsningen blev afkølet til stuetemperatur, tørret (Na

2SO

4), filtreret og koncentreret. Det resulterende faststof blev oprenset ved kromatografi (CH

2Cl

2 /EtOAc, 01:01), hvilket gav 3 som hvide krystaller (241 mg, 50,4%): smp 73-74 ° C; IR (film) 3226 (N-H str.), 2920, 2851 (C-H, str.), 1716 1671 (C = O, str.), 1468, 1375, 1278 cm

1;

1H NMR (CDC

3, 600 MHz) δ 5,73 (1H, brs, NH), 3,50 (1H, dd,

3J = 9,0,

3J = 6,0 COCHCO), 3,44 (1H , ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,5, CH

2 N), 3,34 (1H, ddd,

2J = 9,0,

3J = 9,0 ,

3J = 5,4, CH

2 N), 2,95 (1H, ddd,

2J = 17,4,

3J = 7,4,

3J = 7,5 CH

2CH

2CO ), 2,57 (1H, ddd,

2J = 17,4,

3J = 7,2,

3J = 7,2 CH

2CH

2 CO), 2,65 (1H, dddd,

2J = 11,0,

3J = 5,4,

3J = 9,0,

3J = 9,0, CH

2CH

2 N), 2,17 (1H, dddd,

2J = 11,0,

3J = 8,5,

3J = 9,0,

3J = 5,5, CH

2CH

2 N), 1,59 (2H, m, CH

2CH

2 CO), 1,23 (22H, m, C

11H

22), 0,88 (3H, t,

3J = 6,8, CH

3CH

2);

13C NMR (CDC

3, 150 MHz) δ 205,9 (CH

2 CO), 171,6 (CONH), 53,9 (COCHCO), 42,9 (CH

2 CO), 40,6 (CH

2 N), 32,1 (CH

3CH

2CH

2), 29.8~29.2, 23,5 (CH

2CH

2CH

2 CO), 22,9 (CH

2CH

2CH

2NH), 14,9 (CH

3); MS (EI

+) m /z = 295 (M

⋅ +), HRMS (El) beregnet for C

18H

33NO

2 (M

⋅ +) 295,2511 , fundet 295,2554.

(2R, 5S) -2- (p-fluorphenyl) -3-oxa-1-azabicyclo [3.3.0] octan-8-on (4).

en opløsning af 5-hydroxymethylpyrrolidin-2-on (580 mg, 5 mmol) og

s

-fluorobenzaldehyde (810 mg, 6,5 mmol) i toluen (20 ml) indeholdende PPTS (30 mg) blev opvarmet ved tilbagesvaling i 13 timer under anvendelse af en Dean-Stark-vandudskiller. Efter afkøling blev opløsningen fortyndet med EtOAc, vasket med mættet NaHCO

3 vandig opløsning, derefter saltvand, tørret (MgSO

4) og inddampet under reduceret tryk for at give en brun olie. Kromatografisk separation på silicagel ved eluering med chloroform gav

3 4 som en bleggul olie (586 mg, 53%): IR (film) 2920, 2851 (CH, str.), 1701 (C = O, str. ), 1559, 1507, 1437 (aromatisk C = C bøjning) 1301, 1099, 821, 668 cm

-1.;

1H NMR (CDC

3, 200 MHz) δ 7,34 (2H, dd,

3J = 8,0,

4J = 5,5, H-Ph), 6,95 (2H, dd,

3J = 8,6,

4J

HF = 8,6, H-Ph), 6,20 (1H, s, OCHPh), 4,15 (1H, dd,

2J = 7,4,

3J = 6,4, CH

2O), 4,04 (1H, m, NCHCH

2O), 3,40 (1H, t,

2J = 7,4,

3J = 7,6, CH

2O), 2,74 (1H,

2 J = 17,4

3J = 9,6,

3J = 9,4, CH

2 CO), 2,47 (1H, ddd,

2J = 17,4,

3J = 3,7,

3J = 9,8, CH

2 CO), 2,31 (1H, dddd,

2J = 20,2,

3J = 3,7,

3J = 7,6,

3J = 7,0, CH

2CH

2CHN), 1,87 (1H, dddd,

2J = 20,2,

3J = 4,7,

3J = 9,4,

3J = 9,8, CH

2CH

2CHN) ;

13C NMR (CDC

3, 50 MHz) δ 178,2 (CON), 163,5 (1C, d,

1J

CF = 244,4, CF), 129,5 (2C, d,

3J

CF = 8,2, CHCHCF), 115,4 (2C, d,

2 J

CF = 21,5, CHCF), 86,7 (OCHPh), 71,8 (CH

2O), 58,9 (NCH), 33,6 (COCH

2), 23,1 (COCH

2CH

2).

(2R, 5S) -2- (p-fluorphenyl) -7-tetradecanoyl-3-oxa- 1-azabicyclo [3.3.0] octan-8-on (5).

til en opløsning af beskyttet lactam 4 (222 mg, 1 mmol) og HMPA (5 ml) i THF (15 ml), LiN (TMS)

2 (1,0 M, 1,3 ml, 1,3 mmol) i THF blev tilsat ved -78 ° C. Reaktionsblandingen blev omrørt i 30 min, og derefter ethylmyristat (0,4 ml, 1,2 mmol) blev tilsat. Opløsningen blev langsomt opvarmet til stuetemperatur. Efter 3 timer blev reaktionsblandingen standset med mættet NH

4CL vandig opløsning, ekstraheret med ether, og ekstrakten blev tørret (Na

2SO

4) og koncentreret. Det resulterende produkt blev oprenset ved kromatografi (hexaner /EtOAc, 02:01) for at give 5 som hvide krystaller (233 mg, 53%), der blev dannet som en blanding af to diastereomerer: smp 60-62 ° C; IR (film) 2918, 2851 (CH, str.), 1716 1681 (C = O, str.), 1559 1512 (aromatisk C = C bøjning.), 1401, 1240, 1035, 802 cm

– 1; MS (EI

+) m /z = 431 (M

⋅ +), HRMS (El) beregnet for C

26H

38NFO

3 (M

⋅ +) 43,2913 , fundet 431,2914.

(5R) -5- (hydroxymethyl) -3-tetradecanoylpyrrolidin-2-on (6).

en opløsning af beskyttet lactam 5 (50 mg, 0,15 mmol) i 5 ml AcOH /THF /H

2O (03:07: 1) blev opvarmet ved 90 ° C i 3 timer. Benzen (30 ml) blev tilsat til blandingen, og inddampet under reduceret tryk. Flashkromatografi blev udført (EtOAc /CH

3OH, 10:01), hvilket gav 6 som hvide krystaller (22 mg, 60%) af en blanding af diastereomerer, smp 73-76 ° C; IR (film) 3385 (NH str.), 3307 (OH, str.), 2920 (C-H, str.), 1699 1653 (C = O, str.), 1457, 1119 cm

1; MS (EI

+) m /z = 325 (M

⋅ +), HRMS (El) beregnet for C

19H

35NO

3 (M

⋅ +) 325,2617 , fundet 325,2599.

(2S, 5S, 7R) -7-hydroxy- (4-fluorphenyl) -3-oxa-1-azabicyclo [3.3.0] octan-8-on (7).

Forbindelse 6 (200 mg, 0,46 mmol) blev tilsat til en suspension af CeCl

3.7H

2O (5,6 mg, 0,015 mmol) i 2 ml

i

PrOH. Suspensionen blev blandet ved at boble luft gennem det i 2 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev koncentreret. Flashkromatografi blev udført (CH

2Cl

2 /EtOAc, 01:01), hvilket gav 7 som en farveløs olie (120 mg, 57%): (. OH, str) IR (film) 3384, 1715, 1698 (C = O, str.), 1511 1230, 1156 cm

1; [Α]

D

23 = -0,05

0 (c = 0,8 g /100 ml, CH

3OH);

1H NMR (DMSO-d

6, 600 MHz) δ 7,41 (2H, dd,

3J = 8,9,

4J = 5,5, H-Ph), 7,23 (2H, dd,

3J = 8,9,

4J

HF = 8,9, H-Ph), 6,62 (1H, s, OH), 6,11 (1H, s, H-Ph), 4,28 (1H, dd,

2J = 8,1,

3J = 8,4, CH

2O), 4,01 (1H, dddd,

3J = 6,8,

3J = 7,0,

3J = 8,4,

3J = 6,0, NCHCH

2), 3,51 (1H, t,

2J = 8,4,

3J = 8,1, CH

2O), 2,75 (1H, dd,

2J = 13,0,

3J = 6,8, CH

2CHN), 2,69 (2H, dd,

2J = 18,5,

3J = 7,2, CH

2CH

2 CO), 1,90 (1H, dd ,

2J = 13,0,

3J = 7,0, CH

2CHN);

13C NMR (DMSO-d

6, 150 MHz) δ 209,3 (CH

2 CO), 172,3 (CON), 162,2 (

1J

CF = 244,4, C-Ph), 134,7 (C-Ph), 128,3 (2C,

3J

CF = 8,4, C-Ph), 115,2 (2C,

2 J

CF = 21,7, C-Ph), 87,7 (C OH), 85,6 (CH-Ph), 72,2 (CH

2O), 54,6 (CH

2CHN), 37,2 (CH

2CHN), 36,2 (CH

2CH

2CO) , 22,6 (CH

2CH

2 CO), 22.05~31.25, 13,9 (CH

3CH

2); MS (EI

+) m /z = 447 (M

⋅ +), HRMS (El) beregnet for C

26H

42FN

2O

4 [(M

⋅ + NH

4)

+] 465,3129 fundet 465,3126.

(3S, 5R) -3-hydroxy-5- (hydroxymethyl) -3-tetradecanoyl pyrrolidin-2-on (8 )

En opløsning af forbindelse 7 (60 mg, 0,13 mmol) i 5 ml AcOH /THF /H

2O (03:07:. 1) blev opvarmet ved 90 ° C i 3 timer. C

6H

6 (30 ml) blev tilsat til blandingen, og inddampet under reduceret tryk. Flashkromatografi blev udført (EtOAc /CH

3OH, 10:01) for at give 8 som hvide krystaller (22 mg, 48%): smp 74-76 ° C; IR (film) 3300 (NH, str.), 3226 (OH, str.), 2995, 2849 (C-H, str.), 1688, 1650 cm

-1 (C = O, str.); [Α]

D

23 = -4,25 ° (c = 0,04 g /100 ml, CH

3OH); 1H NMR (CD

3OD, 600 MHz) o 3,81 (1H, dddd,

3J = 4,9,

3J = 5,4,

3J = 6,3,

3J = 7,9, CH

2CHN), 3,62 (1H, dd,

2J = 11,1,

3J = 4,9, CH

2O), 3,53 (1H, dd,

2J = 11,1,

3J = 6,3 , CH

2O), 2,74 (2H, m, CH

2CH

2 CO), 2,38 (1H, dd,

2J = 14,1,

3J = 5,4, CH

2CHN ), 2,10 (1H, dd,

2J = 14,1,

3J = 7,9, CH

2CHN), 1,56 (2H, m, CH

2CH

2CO), 1,31 (3H, t,

3J = 7,0, CH

3CH

2);

13C NMR (CD

3OD, 150 MHz) δ 212,2 (CO), 176,7 (CON), 84,5 (COH), 65,5 (CH

2OH), 54,3 (CHN), 38,7 (CH

2CO), 33.1~30.8, 24,3 (CH

2CH

2 CO), 14,4 (CH

3CH

2); MS (EI

+) m /z = 341 (M

⋅ +), HRMS (El) beregnet for C

19H

35NO

4 (M

⋅ +) 341,2617 fundet 341,2599.

PMC og analoger blev opløst i ethanol. McCoys 5A, FBS og antibiotika var fra Pan Biotech GmbH (Aidenbach, Tyskland). Phosphataseinhibitor cocktail (PhosStop) og protease-inhibitor cocktail blev opnået fra Roche (F. Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Schweiz). Annexin V (FITC) var fra Alexis Biochemicals (Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, USA). Spaltet caspase-3, spaltet caspase-9, JNK, P-JNK, p38, P-p38, Bcl-2, blev Bax, Bid, Bim og β-actin-antistoffer købt fra Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, USA ). MAPK-inhibitorer SP600125 og SB203580 var fra Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Caspaseinhibitorer Z-VAD-FMK (generel caspaseinhibitor), Z-DEVD-FMK (caspase-3-inhibitor), Z-LEHD-FMK (caspase-9-inhibitor), og Z-IETD-FMK (caspase-8 inhibitor) blev indkøbt fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Tris, glycin og Tween-20 var fra Molekula Ltd (Shaftesbury, UK). Alle andre kemikalier blev opnået fra Sigma (Darmstadt, Tyskland).

MTT cellelevedygtighed Asssay

Cellelevedygtighed ved udsættelse for PMC analoger blev bestemt under anvendelse af et MTT (dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium) assaykit ( Roche, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev HCT116 wt celler i plader med 96 brønde behandles som anført, og 10 pi MTT mærkningsreagens blev tilsat til hver brønd, hvorefter pladerne blev inkuberet i 4 timer. Cellerne blev derefter inkuberet i 100 pi af solubiliseringen opløsning i 12 timer, og absorbansen blev målt med en mikrotiterpladelæser (Bio-Rad, CA, USA) ved en test bølgelængde på 550 nm og en referencebølgelængde på 650 nm. Procent levedygtighed blev beregnet som (OD af lægemiddel-behandlede prøve /kontrol OD) × 100.

flowcytometri

Celledød blev bestemt ved en Annexin-V affinitet assay. Wt, p53 – /-, og Bax – /- blev HCT116 celler podet i 12-brønds plader transficeret /behandles som anført, overført til flowcytometri-rør og cellerne blev høstet ved centrifugering ved 300 g i 5 minutter. Derefter blev cellerne resuspenderet i 1 ml kold PBS og centrifugeret igen ved 300 g i 5 minutter. Efter fjernelse af supernatanten blev cellerne inkuberet i Annexin V-buffer (140 mM HEPES, 10 mM NaCl, 2,5 mM CaClz

2, pH: 7,4) indeholdende 1% (v /v) Annexin V (FITC) for 15 minutter i mørke. Celler blev analyseret ved FACS (FACSCanto, Becton Dickinson).

Protein Extraction og immunblotting

Celler blev behandlet som angivet og høstet ved centrifugering ved 300 g i 30 sekunder. Efter resuspension i 1 ml iskold PBS og overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør blev celler centrifugeret ved 13200 rpm i 30 sekunder. Pelleten blev lyseret ved inkubering i 30 minutter i 200 pi kold celle lysis buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH: 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM phenylmethansulfonylfluorid, protease og phosphatase inhibitor cocktails, og Nonidet P-40 1 % (v /v). Efter centrifugering ved 13200 rpm i 10 minutter, supernatanten indeholdende det totale protein ekstrakt blev fjernet og opbevaret ved -80 ° C. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved DC-proteinassay (Bio-Rad, Munchen, Tyskland). Proteiner (30 ug) blev blandet med loadingbuffer (4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0,004% bromphenolblåt, 0,125 M Tris-HCI pH: 6,8) og separeret på 10-15% SDS- PAGE og blottet på PVDF-membraner. Membranerne blev blokeret med 5% blokerende reagens (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland) i PBS-Tween 20 og inkuberet med passende primære og HRP-konjugerede sekundære antistoffer (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland) i 5% blokeringsreagens . Efter påkrævede vaske med PBS-Tween 20, blev proteiner endelig analyseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens påvisningssystem (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland) og udsat for Hyperfilm-ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland).

Transfektioner

HCT116 wt celler blev transficeret med Bcl-2 og Bim ekspressionsplasmider (Addgene Inc., Cambridge, MA, USA) under anvendelse FuGene 6-transfektionsreagens (Roche, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Schweiz) ifølge fabrikantens protokol. Totalt protein ekstraktion blev udført efter 24 timer efter afslutningen af ​​transfektion procedure for bekræftelse af ektopisk ekspression. Plasmid-transficerede celler blev behandlet med PMC-A som angivet og analyseret ved flowcytometri efter 24 timer.

Statistical Analysis

Alle de viste resultater repræsenterer en af ​​mindst tre uafhængige forsøg med lignende resultater . Alle numeriske data er præsenteret som som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans af responsive forskelle blandt differentielt behandlet eller differentielt transficerede cellepopulationer blev vurderet med uparret eller parret t-test, hhv. Værdier af P 0,05 og P 0,01 er markeret som * eller ** henholdsvis

Resultater

PMC-A Beviser Mere Cytotoksisk I forhold til dens forløber PMC og flere Analoger mod HCT116 Cells

PMC blev tidligere vist til selektivt beskadige vaskulære endotelceller i

in vitro Salg funktionelle undersøgelser af rotte-aorta og hundens arterier [1], [21], [22]. PMC og analoger blev også påvist at forårsage celledød i dyrkede bovine vaskulære endotel og Jurkat T-leukæmiceller [1], [2]. I vores undersøgelse, vi oprindeligt undersøgte tidligere rapporterede naturlige produkter PMC og PMC-A [20], og derefter syntetiseret flere analoger til at udforske mellem struktur og funktion (fig. 1). Således blev PMC-C fremstillet ud fra kommercielt

N

-vinylpyrrolidinone (1) ved dannelse af enolatet, derefter acylering med ethylmyristat til opnåelse 2. Den vinyl-beskyttelsesgruppen blev derefter fjernet med vandig syre, hvilket giver Pmc- C (3) som en racemisk blanding ved let epimeriseres stereocentre (fig. 2).

for analoger PMC-D og -F, kommercielle (

R

) -5- hydroxymethylpyrrolidin-2-on blev omdannet til den beskyttede derivat 4, under anvendelse af en litteraturen procedure [23], derefter deprotoneret og acyleres med ethylmyristat, hvilket giver 5. Afbeskyttelse derefter gav PMC-D (6). Alternativt hydroxylering af 5 med oxygen og ceriumchlorid som katalysator ifølge fremgangsmåden ifølge Christoffers [24] gav 7 som derefter blev afbeskyttet til opnåelse PMC-F (8). Anvendelse af

s

fluorphenyl beskyttende gruppe bekvemt resulteret i væsentlige fuldstændig stereoselektiv hydroxylering, mens andre substituenter på benzenringen gav blandinger. Stereokemien af ​​8 blev oprettet ved røntgenkrystallografi, som afslørede, at hydroxygruppen var

trans

til hydroxymethylsubstituenten, i modsætning til den

cis

relation i pramanicin. Det var derfor af interesse at fastslå, om denne hydroxygruppe og dets stereokemi er vigtige for aktivitet, og dermed vi medtaget denne forbindelse i testpanelet.

Vi derefter udført en 24 timers cytotoksicitet assay for at søge efter de mest potente analog mod HCT116 celler. MTT reduktion test, som indirekte bestemmer cellelevedygtighed /proliferation ved at overvåge metabolisk aktivitet, viste, at 100 pM PMC forårsagede ca. 8% fald i cellelevedygtighed (fig. 3). Men PMC-A, som har en C = C-dobbeltbinding i stedet for en epoxygruppe i sin sidekæde, faldt cellelevedygtigheden med næsten 70% i forhold til den ubehandlede kontrol. Især analoger PMC-C, -E og -F alle bevarede betydelig aktivitet, hvilket indikerer, at en acyleret pyrrolidinon (som i PMC-C), højst er nøglen farmakofor og at mange af substituenterne (epoxid, dien, C- 5 hydroxymethylgruppe, og C-3 og C-4 alkoholgrupper) som er ikke-essentielle, men kan forbedre aktivitet.

levedygtigheder af HCT116-celler blev analyseret ved MTT-assay efter 24 timer behandling med 100 uM af hver PMC-analog . Vildtype-HCT116-celler blev analyseret kolorimetrisk efter 24 timer behandling med PMC analoger. Gennemsnitlige absorption værdier i forhold til ubehandlet kontrol vises efter multiplikation med 100. Resultaterne fra mindst 3 uafhængige forsøg blev vist som middelværdier ± SD. Forskellen mellem de gennemsnitlige værdier mellem behandlede og ubehandlede prøver blev testet under anvendelse uparret t-test; ** P 0,01. Kontrolceller blev behandlet med kun opløsningsmiddel. Alle testede analoger undtagen forløberen PMC ført til betydelige tab af levedygtighed /proliferation mens PMC-A og -F viste sig mest cytotoksiske for celler.

PMC-A fremkalder celledød via Induktion af Intrinsic apoptosecyklus

In vitro

effektive doser af de potente PMC analogen PMC-a (25-100 uM) forårsagede celledød på en dosis-afhængig måde blandt alle tre HCT116 coloncancer-cellelinjer (wt, p53 – /-, og Bax – /-) som vist ved øgede Annexin-V affiniteter i cellepopulationer (fig 4a).. For at analysere celledød og bestemme den optimale dosis til brug i en 24 timers tidsskala vi anvendt flowcytometri efter Annexin-V-farvning af celler udsat for fire fysiologisk relevante PMC-A-koncentrationer. Celledødsinduktion var tydelig for alle doser i alle cellelinjer og steg dosisafhængigt. Eftersom mere end 50% af vildtype celler var døde efter den 24. timers eksponering for 100 pM PMC-A gennemførte vi resten af ​​immunoblotting forsøg under anvendelse af 50 pM dosis, hvor ca. 70% af cellerne forblev i live efter 24 timer efter p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.