PLoS ONE: Identifikation af denatureret gener associeret med aggressive Blære Cancer

Abstrakt

Ca. 500.000 personer diagnosticeret med blærekræft i USA kræver rutinemæssig cystoskopisk opfølgning overvåge for sygdom tilbagefald eller progression, hvilket resulterer i mere end $ 2 milliarder i årlige udgifter. Identifikation af nye strategier diagnostiske og overvågning er klart nødvendigt, og markører relateret til DNA methylering ændringer lover godt på grund af deres stabilitet, objektiv måling, og kendte foreninger med sygdommen og med de kliniske funktioner. For at identificere hidtil ukendte epigenetiske markører for aggressiv blærekræft, vi udnyttet en high-throughput DNA-methylering perle-array i to særskilte population-baserede serier af indfaldende blærecancer (n = 73 og n = 264, henholdsvis). Vi valideret derefter sammenhængen mellem methylering af disse kandidat-loci med tumor klasse i en tredje population (n = 245) gennem hydrogensulfit pyrosekventering af kandidat-loci. Array baserede analyser identificeret fem loci for yderligere bekræftelse med bisulfit pyrosekventering. Vi identificerede og bekræftede, at øget promotor methylering af

HOXB2

er betydeligt og uafhængigt associeret med invasiv blærekræft og methylering af

HOXB2

,

KRT13

FRZB

sammen markant forudsige høj kvalitet non-invasiv sygdom. Methylering af disse gener kan være nyttige som kliniske markører for sygdommen og kan pege på gener og pathways værdig yderligere undersøgelse som nye mål for terapeutisk behandling

Henvisning:. Marsit CJ, Houseman EA, Christensen BC, Gagne L , Wrensch MR, Nelson HH, et al. (2010) Identifikation af denatureret gener associeret med Aggressive blærekræft. PLoS ONE 5 (8): e12334. doi: 10,1371 /journal.pone.0012334

Redaktør: Michael Freitag, Oregon State University, USA

Modtaget: May 17, 2010; Accepteret: 29 Juli 2010; Udgivet: 23 August, 2010

Copyright: © 2010 Marsit et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Flight Attendant Medical Research Institute [YCSA 052.341 til CJM]; og National Institutes of Health [R01CA121147, K07CA102327, og P42ES007373]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i USA i 2009 blev en anslået 71.000 kræft i urinblæren diagnosticeret og større end 14.000 dødsfald tilskrives denne sygdom [1]. Langt størstedelen af ​​dødsfald forekommer hos patienter med indfaldende høj stadium, høj kvalitet, invasive tumorer, der infiltrerer de muskulære lag af blæren. Lav grad, non-invasiv sygdom, på den anden side, kan behandles med succes, selv om denne succes kommer på stor økonomisk byrde for sundhedssystemet. Ca. 500.000 patienter kræver overvågning i USA fører til anslået diagnose ihjel per patient omkostninger spænder fra $ 96,000 til $ 187,000, hvilket resulterer i $ 2.2 milliarder i årlige udgifter, hvilket gør blærekræft den dyreste af alle kræfttilfælde [2], [3]. Således ville omkostningseffektive prognostiske strategier for evaluering af hændelsen og tilbagevendende sygdom være af væsentlig klinisk anvendelighed.

Epigenetisk kontrol af DNA udtryk er velkendt at køre føtal udviklingsmæssige differentiering. I en parallel måde, i samråd med genetiske hændelser (mutation, sletning og gen forstærkning) det menes, at epigenetiske ændringer kan fremskynde vigtige patologiske træk af ondartet degeneration [4]. Blærecancer, med sine divergerende kliniske (og patologiske) fænotyper, præsenterer en tumor model, der kan opstå ved inaktivering af loci, der uafhængigt styre tilbøjeligheden til invasion og dermed diktere scenen og kvalitet, og at denne inaktivering kan forekomme gennem en række forskellige epigenetiske processer, herunder microRNA forandringer [5], at ændringer kromatin [6], [7], og ændringer i DNA methylering [8]. I dette tilfælde er der potentiale for anvendelse af epigenetiske ændringer og især DNA CpG-methylering som biomarkører for blære kræft, såvel som potentielt til en række andre humane cancere [8], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Microarray tilgange har også forsøgt at identificere nye gener, der er forbundet med invasiv sygdom, men med begrænsede stikprøvestørrelser grund array strategi ansat [15]. Den seneste udvikling i array-tilgange nu mulighed for anvendelse af disse teknologier til populationsbaserede epidemiologiske studier af kræft udnytte et stort antal prøver [16], [17], [18]. Der er mange fordele ved at udnytte en befolkning tilgang, herunder reduktion i bias, større generaliserbarhed af resultaterne, og adgang til prøverne spænder alle faser og kvaliteter af tumoren. Derfor har vi udnyttet dette array tilgang til at identificere klinisk og biologisk informative mønstre og nye gen-mål for DNA CpG methylering i en population-baserede serier af blære overgangsordning celle karcinom.

Resultater

identifikation af kandidat-loci

Vi udnyttet en 2-trins tilgang til identifikation og validering af loci, der var forbundet med udviklingen af ​​invasiv blærekræft (Figur S1). I trin 1 blev to uafhængige serie af tumorer (tabel 1) analyseret ved DNA-methylering array til at identificere potentielle kandidat-loci, der har differentiel methylering, og i trin 2, blev disse kandidater bekræftet i en yderligere række af tumorer ikke profileret på arrayet.

Samlet set var der en generel stigning i methylering i invasive tumorer (figur 1A), hvilket tyder på, at denne fremgangsmåde har nytte for afgrænsning af effektive biomarkører. Generaliserede lineære modeller sammenligner methylering niveauer af invasive versus ikke-invasive tumorer på hvert locus bekræftet denne visuelle indtryk. I serie 1, havde 445 CpG loci signifikant øget methylering i invasiv sammenlignet med ikke-invasive tumorer (

Q

0,05), mens kun 68 loci havde signifikant nedsat methylering. Tilsvarende i serie 2, 606 loci havde signifikant øget methylering og kun 41 havde reduceret methylering (tabel S1). Modeling hver serie uafhængigt med rekursivt partitioneret blanding modeller gav fire methylering profiler (Fig 1B). Især betydeligt mere invasive tumorer var i methylering klasse 4 (P 0,00001, permutation chi-square)

(A) Scatterplot af gennemsnitlige methylering beta værdier i ikke-invasive blæretumorer (x-aksen) og gennemsnit. methylering beta værdier i invasive tumorer (y-akse) i serie 1 (n = 73) og serie 2 (n = 264) prøver. (B) Rekursive partition blanding modeller af hver serie resultere i 4 klasser adskilt af røde lodrette linjer, med bredden af ​​de klasser, der svarer til antallet af prøver i hver klasse. Loci er repræsenteret som rækker med middelværdien methylering for klassen afbildet. Over hver klasse er forekomsten af ​​invasive tumorer (n invasiv /total n) inden for klassen. Methylering profiler markant skelne blære tumor fra ikke-syge blære epitel (P 0.00001)

For at identificere loci mest håndfast forbundet med invasiv sygdom, vi udnyttet 3 forskellige, almindeligt anvendte statistiske metoder til at identificere dem. gen loci (fra hver af de tre statistiske metoder og på tværs af 2-serien), som overlappede med at differentiere invasive og ikke-invasiv sygdom. Fem loci (

FRZB

_E186,

HOXB2

_P99,

KRT13

_P676,

RIPK1

_P868,

STAT5A

_P704) blev fundet at være forbundet med invasiv sygdom i alle tre statistiske metoder.

for fire af disse loci (

FRZB

,

STAT5A

,

KRT13

, og

HOXB2

), bisulfit pyrosekventering assays kunne udformes, og blev anvendt til at bekræfte konklusionerne array i en delmængde af blæretumorer undersøgt på arrayet. En pyrosekventering assay for

RIPK1

kunne ikke med held designet. For undersøgte, samt middelværdien tværs websteder for alle CpG sites

FRZB

,

KRT13

, og

HOXB2

observerede vi signifikant større methylering i invasive i forhold til ikke- invasive tumorer, i overensstemmelse med de array-resultater (figur S2A, S2C, S2D). For

STAT5A

, bekræftede vi signifikant større grad af methylering på det specifikke CpG stedet målt ved array, men ikke overholder denne forening i de omkringliggende CpG sites (Fig S2B), og så dette loci var ikke yderligere undersøgt.

Behandling af en blærekræft Cell line med methylering Inhibitor fører til Re-ekspressionen af ​​HOXB2

Pyrosequencing blev udført for at bestemme status methylering af

HOXB2

,

FRZB

, og

KRT13

i blære kræft cellelinjer HTB-9 og UM-UC3. HTB-9 havde en HOXB2 methylering omfanget af 68,9, svarende til, hvad der var blevet observeret blandt primær blære tumorprøver, og dermed blev valgt til yderligere undersøgelse. Behandling af HTB-9-celler med 1 eller 2 pM 5-aza-2′-deoxycytidin ført til en stigning på mere end 100 gange ekspression af HOXB2 sammenlignet med mock-behandlede celler (figur 2).

Kvantitativ RT -PCR-analyse blev anvendt til bestemmelse af genekspressionen af ​​

HOXB2

i human blærecarcinom-cellelinje HTB-9, efter en 5-dages behandling med 1 eller 2 pM 5-aza-2′-deoxycytidin eller mock behandling . Bjælkerne repræsenterer middelværdien gange ændring i ekspression sammenlignet med mock behandling til 4 eller 6 replikat eksperimenter, og fejlsøjler betegner standardafvigelser.

HOXB2 Methylering uafhængigt forbundet med invasiv blærekræft

Pyrosequencing af promotor-regioner

FRZB

,

KRT13

, og

HOXB2

blev udført i en selvstændig serie af 263 blære tumor patienter ikke undersøgt på array samt på 4 ikke sygdomsangrebne tumorprøver opnået fra NDRI. Omfanget af methylering ved pyrosequenced regioner i ikke-sygdomsramt blære epitel, er ikke-invasive tumorer til invasive tumorer afbildet på figur 3, og viser signifikante forskelle i methylering tværs af de 3 kategorier for hvert af generne (

HOXB2

P 0,00001,

KRT13

P 0,05,

FRZB

P 0,003, Kruskal Wallis test). Methylering af

HOXB2

KRT13

er hver signifikant større i invasiv sammenlignet med ikke-invasive tumorer (beskyttet Wilcoxon rang beløb test, P 0,00001 og P 0,02 henholdsvis). TP53 immunhistokemisk (IHC) farvningsintensitet tidligere er blevet forbundet med en mere aggressiv sygdom [19], [20], og vi medtaget denne variabel, når vi udførte logistisk regression forudsige invasiv sygdom, for hver af de loci individuelt, dichotomizing methylering omfang på medianen, og kontrollere for andre potentielle konfoundere. I modeller kontrolleret for alder, køn og TP53 immunhistokemisk farvning intensitet af tumoren, kun

HOXB2

promotor methylering viste en uafhængig forening med invasive tumorer (tabel 2). Tumorer med

HOXB2

methylering havde en OR på 7,7 (95% CI 3,3, 18,2) for at være en invasiv tumor. Dette resultat holdt op i en model, kontrollerer for alle 3 loci samt TP53 IHC farvning intensitet og patientens alder og køn, hvor

HOXB2

methylering blev forbundet med en 8,6 gange øget risiko for at være en invasiv tumor (95% CI 3,4, 21,7).

den gennemsnitlige (udfyldt cirkel) og 95 intervaller på omfanget af methylering af promotoren regioner (A% tillid)

FRZB

, (B)

KRT13

, og (C)

HOXB2

er afbildet (y-aksen) sammenligning ikke-sygdomsramt blære epitel, ikke-invasive tumorer og invasive tumorer (x-akse). Forskellene i omfanget af methylering tværs af disse grupper er signifikant forskellige (Kruskal-Wallis test), for

HOXB2 Hotel (P 0.00001) og

KRT13 Hotel (P 0,04), og

FRZB Hotel (P 0,003). Sammenligninger specifikt for noninvasive sammenlignet med invasiv sygdom afslørede også signifikante forskelle for

HOXB2

* P 0,00001 og

KRT13

** P. 0,02

methylering af HOXB2, FRZB, og KRT13 er associeret med Aggressiv Non-invasiv blærekræft

Da vi er interesseret i at bestemme, hvordan methylering bidrager til progression og aggressivitet af tumorer, vi undersøgte sammenhængen mellem methylering omfang og tumor kvalitet inden de ikke-invasive tumorer. Figur 4 viser, at der er signifikant større grad af methylering af

HOXB2 Hotel (P 0,01),

KRT13 Hotel (P 0,01) og

KRT13 Hotel (P = 0,0001) i høj grad (3) sammenlignet med lav kvalitet (1,2) ikke-invasive tumorer. For at kontrollere for potentielle confounding, vi udførte multivariable logistisk regressionsanalyse for at undersøge sammenhængen mellem gen promoter methylering omfang og tumor klasse. I første omgang, vi modelleret hvert gen promoter individuelt, og observerede signifikante sammenhænge mellem

FRZB

(OR 2,9, 95% CI 1,1, 7,9), og

KRT13

(OR 3,3, 95% CI 1,1, 10.1), men kun et grænsetilfælde signifikant sammenhæng mellem

HOXB2

methylering og høj tumor bedømmelse (OR 2,6, 95% CI 0,9, 6,9, tabel S2). Vi derefter undersøgte de additive virkninger af methylering af disse 3 loci ved at modellere sammenhængen mellem methylering af alle tre loci forhold til at have ingen, 1, eller 2 methyleret og high-grade non-invasiv sygdom (tabel 3). Kontrolleret for alder, køn og TP53 IHC farvning intensitet blev methylering af alle tre loci forbundet med en signifikant 7,4 gange øget risiko for at være en høj kvalitet tumor (95% CI 2,5, 22,1).

Den gennemsnitlige ( intervaller på omfanget af methylering af promotoren regioner (A)

FRZB

, (B)

KRT13

, og (C)

HOXB2

er afbildet (y-aksen) sammenligning lav (1,2) til høj (3+) karakteren tumorer (x-aksen). P-værdier fra de Wilcoxon Rank Beløb viser, at disse forskelle har betydning for

HOXB2 Hotel (P 0,01),

KRT13 Hotel (P 0,01) og

FRZB

( P = 0,0001).

diskussion

i forhold til gen-udtryk baserede markører, DNA methylering mønstre er mere stabile og kan påvises ved hjælp af forskellige metoder, der kræver relativt små mængder af patientens materialer. Desuden kan disse markører være objektivt identificeres og kvantificeres, hvilket giver mulige forbedringer til pålidelighed i histologiske subjektive diagnoser såsom tumor kvaliteter eller sammenlignet med immunohistokemisk farvning mønstre, som er afhængige af individuel fortolkning af intensitet og placering af farvning. For eksempel markørerne identificeret og uafhængigt valideret i denne undersøgelse hold lovende som biomarkører nyttige i blæren kræftscreening og opfølgning for recidiv og progression og kunne anvendes og testes for klinisk anvendelighed i let at samle urin sedimenter [9], [10 ], [11], [13], [21]. Hertil kommer, opdagelsen af ​​gener og pathways epigenetisk ændret på blæretumorer tyder nye mål for terapeutisk intervention, især når de overvejer dårlig prognose i forbindelse med invasive blære kræftformer. Identifikation af vigtige og nyttige DNA methylering baseret markører er ikke uden udfordring, især da der ofte en høj grad af korrelation mellem disse forandringer [22]. hensigtsmæssige statistiske metoder skal derfor udnyttes til at undersøge disse ændringer, og at identificere de ændringer med den største kliniske anvendelighed. Vi mener, at vores to etaper giver den mest robuste og generaliseres identifikation af DNA methylering ændringer, som kan undersøges nærmere i prospektive undersøgelser. Ved hjælp af flere forskellige statistiske metoder, vores udvalg strategi til informative markører tilladt os at identificere et overskueligt antal potentielt nyttige og robuste biomarkører for laboratorievalidering samt replikation i uafhængige prøver. Vigtigst er det, vores validering af disse markører i en uafhængig gruppe af patienter giver overbevisende dokumentation for deres potentielle anvendelighed og biologisk betydning.

Tidligere studier undersøger paneler af kandidatgener har identificeret specifikke gener og paneler af loci, der er prædiktive for både tilstedeværelsen af ​​tumor, når de undersøges i urin sediment [23] og progression fra ikke-invasiv for invasiv sygdom [15], [24], [25], [26], når undersøges inden for tumorvæv. Specifikke gener såsom

RASSF1A

,

RaRb

,

BAMBI

og

SFRP

familie har været forbundet med højere lønklasse og højere stadie blærekræft [8 ], [27], [28]. Vores strategi identificerede ikke disse specifikke gener, og denne uoverensstemmelse kan skyldes en række forskelle mellem vores tilgang og de tidligere anvendte. Vi har gjort brug af en populationsbaseret case-serier prøve, mens mange tidligere undersøgelser har udnyttet hospital-baseret bekvemmelighed serien, og dermed kan have haft en vis skævhed indført i de undersøgte prøver. Grupperingen platform, der anvendes i denne undersøgelse er begrænset ved, at den undersøger kun en delmængde af alle gener og kun 1 eller 2 specifikke bindingssteder for CpG for disse gener, og således kan gå glip af de specifikke gener af loci tidligere beskrevne. Endelig vores analytiske tilgang, da den er baseret på identifikation af paneler af gener kan identificere forskellige loci end dem, der anvendes i kandidat-analyser, men hypermethylering af de tidligere beskrevne kandidater, kan faktisk være højt korreleret til methylering mønstre identificeret heri . Yderligere undersøgelse kombinerer tidligere identificeret loci med vores egne nye mål i en fremadrettet måde er nødvendig for at mere endeligt bestemme dem loci med den største kliniske anvendelighed.

De biologiske fundament for non-invasiv endnu tilbagevendende sygdom versus invasiv sygdom mangler at være fuldt belyst [29]. Vores resultater viser, at der er store forskelle i methylering mellem invasive og ikke-invasive tumorer, med invasive tumorer udviser en generel stigning i methylering sammenlignet med ikke-invasive tumorer. Som DNA-methylering på én CpG er en binær foranstaltning (enten cytosin er methyleret eller ikke) forskellen i graden af ​​methylering kan afspejle potentielt større homogenitet i udvælgelsen af ​​epigenetisk ændrede celler i udviklingen af ​​invasiv sygdom, et resultat i overensstemmelse med vores tidligere arbejde undersøger kun et begrænset panel af genpromotorer i en enkelt række blæretumorer [14]. Denne større grad af methylering kan køre trækkene af den invasive fænotype, eller kan alternativt være en konsekvens af selektive pres til denne fænotype. Selvom vores tilgang i at undersøge hændelse sygdom ikke fuldt ud kan skelne disse muligheder, det giver data illustrerer det presserende behov for yderligere undersøgelse af denne epigenetiske fænomen.

Identifikation af specifikke gener, hvis DNA methylering mønster er forbundet med tumor fænotyper, herunder scenen og kvalitet belyser også de særligt vigtige biologiske processer og veje, der er nødvendige for skabelsen af ​​disse histologisk definerede væv stater.

FRZB

gen (også kendt som

SFRP3

) er medlem af det udskilte frizzlede receptor familie af opløselige proteiner, som binder til og antagoniserer WNT receptoren. Vi og andre har tidligere vist, at hypermethylering af

SFRP

gener er stærkt og signifikant associeret med invasiv blærekræft, hvilket bekræfter betydningen af ​​denne vej i denne fænotype [8], [12]. Af de

SFRP

gener, kun

SFRP1

, (ud over

FRZB

) er profileret på array, og på et andet CpG placering end primerne bruges i vores og tidligere rapporter om dets methylering [8], [30]. Dette kan forklare, hvorfor dette loci ikke blev identificeret i vores screening tilgang. Yderligere, mere genomisk tætte undersøgelse af WNT vej er berettiget, da dette kan foreslå en ny rute til terapeutisk intervention for denne sygdom.

HOXB2

er medlem af homeobox familie af transkriptionsfaktorer og er kodet på kromosom 17 som del af en genklynge med andre HOX familiemedlemmer. Interessant, vi konstatere, at ikke-syge blære epitel udviser en tilsvarende grad af methylering på

HOXB2

KRT13

som den ikke-invasiv sygdom, mens

FRZB

den ikke -diseased væv har en signifikant lavere grad af methylering end nogen af ​​de 2 tumortyper. Vi har også bemærket, i den humane blære- carcinom-cellelinie HTB-9, der demonstrerer omfanget af methylering svarende til den observeret i invasive tumorer, at behandling med methyleringen inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin fører til øget ekspression af

HOXB2

, hvilket antyder, at methylering af dette gen kan være funktionelt førende på inaktivering af dette gen. Resultaterne i

HOXB2

er i overensstemmelse med litteraturen, som har beskrevet en bivalent domæne struktur af chromatin af homeobox-gener, hvor både pluripotente og terminalt differentierede væv udviser mærker af begge aktive og undertrykkende chromatin inden for samme region [31 ], [32], og dermed en mellemliggende grad af DNA-methylering. Invasive blære kræftformer synes målrettet til hypermethylering af denne region, et fænomen tidligere rapporteret på tværs Polycomb gruppe kontrollerede gener i kolorektal cancer celler [33]. En sådan differentieret ændring af en nøgle udviklingsmæssige gen kan være kritisk i at definere fænotyper af disse tumorer og forklare adfærd og resultatet af disse forskellige former af denne sygdom.

KRT13

koder cytokeratin-13 som har vist sig at have særligt udtryk i cervikalt skæl tumorer og i mucinøse cervikale typen adenocarcinomer [34]; til vores viden, ikke er blevet rapporteret epigenetiske ændringer af dette gen. Epigenetisk ændring af dette gen kan påvirke dens udtryk mønster, og sådanne ændringer kan være tegn på en mere de-differentieret fænotype, betragtes karakteristisk for aggressive, høje kvalitet tumorer.

Vi demonstreret i en uafhængig bekræftelse række tumorer, omfanget af methylering af

HOXB2

FRZB

er forbundet med tumorklassificering, uafhængige af hinanden og af TP53 protein immunhistokemisk farvning. TP53 farvning er tidligere blevet undersøgt og er blevet udråbt som en nyttig prognostisk markør i denne sygdom [35], [36], [37], selv om der er modstridende oplysninger om dens anvendelighed [36], [38], [39], [40]. En nylig metaanalyse undersøge dens anvendelighed antyder, at der ikke er hensigtsmæssig, der tyder udnytte denne markør klinisk [20], da det kan give nogen tilføjelse andet end en stærk sammenhæng med den invasive fænotype af sygdommen [41] prognostisk information, [ ,,,0],42]. Vi kan endnu ikke foreslå, at markørerne opdaget ved hjælp af vores tilgang hold en mere klinisk nytte end patologisk sortering og iscenesættelse af tumorer, men vi mener, at vores data tyder på specifikke cellulære veje, der er afbrudt i denne sygdom. Således kunne disse veje undersøges intensivt som nye mål for terapeutiske strategier. Desuden foreslår vi, at der er behov for det fremtidige arbejde, at undersøge anvendeligheden af ​​disse markører i et prospektivt måde, da de kan være nyttig til at bestemme hvilke tumorer kan udvikle. Faktisk kan disse markører også bidrage til kliniske indsats for at følge patienter med mindre invasive metoder, for at afgøre, om deres tumor er vendt tilbage eller skred, hvilket kræver mere aggressive behandlingsmetoder.

Metoder

Undersøgelse Befolkning og Sample Konstatering

Alle undersøgelsens deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke under godkendelsen af ​​de institutionelle anmeldelse bestyrelser Dartmouth Medical School og Brown University. Vi udnyttede to, uafhængig, non-fortløbende populationsbaseret serie af blærekræft sager. Den første, der består af tumorer fra 344 personer, der er involveret i en case-kontrol undersøgelse af hændelsen blærekræft i New Hampshire, diagnosticeret perioden fra juli 1994 og juni 1998 [43], og den anden består af tumorer fra 264 individer diagnosticeret mellem den 1. januar, 2002 for 30. juli, 2004 [44]. Selv adskilt i tid og omfang disse to undersøgelser, udnyttes identisk ansættelsesprocedurer og studere personale samt identiske protokoller for konstatering af patologiske materialer til molekylære undersøgelser. Blæretumorer fra begge serier blev behandlet af undersøgelsen patolog (A.R.S.) og klassificeres i henhold til 1973 og 2004 World Health Organization retningslinjer for blæretumorer. Undersøgelsen patolog identificeret den relevante blok, hvorfra tumorprøver anvendt i disse analyser blev opnået, og andelen af ​​maligne celler i hver prøve blev estimeret. Alle prøver, der anvendes i undersøgelsen indeholdt 75% tumor prøve. Carcinoma in situ blev udelukket fra analysen på grund af begrænset stikprøvestørrelse. Tabel 1 angiver karakteristika for de emner indgår i den endelige analyse. Derudover blev fire ikke-sygdomsramte blære epitel prøver opnået fra National Disease Research Interchange (NDRI) alle fra obduktionen eksemplarer af personer, som ikke havde en diagnose af kræft.

DNA Udvinding og Methylering Analyse

Tumor sektioner med den største andel af malignt væv blev udvalgt ved undersøgelsen patolog til anvendelse i vores molekylære analyser. DNA blev ekstraheret og natriumbisulfit modificeret ifølge standardprocedurer som beskrevet i Marsit, et al. [18]. I alt 82 tumorer fra den første serie og alle 264 tumorer fra den anden serie blev profileret for status for methylering på 1505 CpG loci ved hjælp af Illumina GoldenGate® methylering perle arrays. Bead arrays blev kørt på UCSF Institut for Human Genetics, Genomics Core Facility ifølge producentens protokol og som beskrevet i Bibikova, et al. [45].

Statistisk analyse

Vi samles data med BeadStudio Methylering software fra array producenten (Illumina, San Diego, CA) og kvalitetsvurdering udført som i Christensen et al. [16] resulterer i syv prøver (9%), hvor 75% af loci havde en afsløring p-værdi 1 * 10

-5, bliver faldet fra analysen. En lignende kvalitetskontrol for CpG loci elimineret dem loci med median afsløring p-værdi 0,05 (n = 8, 0,5%)

Efterfølgende analyser blev udført i R pakken.. For sonderende /visualisering formål, var hierarkisk klyngedannelse ved hjælp af Manhattan metriske og gennemsnitlig kobling udført. For locus ved locus analyser blev foreninger på individuelle CpG loci testet med en generaliseret lineær model (GLM). Under forudsætning af, at den gennemsnitlige beta værdier følger en beta fordeling [46], en kvasi-binomial model (logit link, binomial varians, og ikke-enhed skalaparameter) blev anvendt; Bemærk, at logit link funktionen pålægger en passende begrænsning på den gennemsnitlige middelværdi beta. For at justere for flere sammenligninger i at scanne 1413 autosomal CpG loci, P-værdier for sammenhænge mellem gennemsnitlige beta og invasiv sygdom brugt falsk opdagelse korrektion og q-værdier beregnes af

qvalue

pakke i R. En FDR q -værdi af. 0,05 blev betragtet som signifikant for denne undersøgelse

Tilfældige Skove

[47] (https://www.math.usu.edu/~adele/forests/), blev anvendt til at bygge klassificører af invasiv fase (versus non-invasiv) efter CpG gennemsnitlige beta værdier. Analyse blev gennemført i R ved hjælp af

randomForest

pakke (version 4,5 til 18) ved Liaw og Wiener. Ved hver node i træet, en stikprøve af

m

ud af det samlede

M

variabler blev valgt, og den bedste split findes blandt de

m

variabler. Standardværdien for

m

i Random Forest R pakke er. I denne analyse testede vi en række

m

fra halvdelen af ​​til to gange og brugt

m Hoteller, som gav laveste forudsigelse fejl; i dette tilfælde

m

= 38. OOB fejlprocenten er den procentdel af tiden RF forudsigelse er forkert. En test for sammenhæng mellem methylering (prædiktorer) og prøvetype blev udført ved at sammenligne OOB opnået på datasættet med nul-fordeling af OOB fejl opnået ved at permutere prøve typen etiketter og kører RF procedure 100 gange. Vi brugte også den anden serie af 264 tumorer som en validering sæt, beregning af fejlprocenten, da hvert træ er konstrueret, for at opnå en anslået fejlprocent uafhængig af den første serie. Endelig har vi brugt de variable betydning scoringer, procentvis ændring i den gennemsnitlige kvadrerede fejl (MSE), at identificere loci, der havde størst indflydelse på klassificeringen, ved at vælge dem loci, hvis procent ændring i MSE var større end 5%.

for følgeslutning blev data grupperet anvendelse af en blanding model [48] med en blanding af beta distributioner [49], og antallet af klasser blev bestemt ved Bayesian information kriterium (BIC) [50], [51]. Blandingen model blev passe ved rekursivt at opdele data ved hjælp af en 2-klasse blanding model, med en variant af BIC anvendes som et kriterium for opdelingen, som beskrevet i [46]. Klasse medlemskab blev opnået fra blandingen hvortil benyttes en empirisk Bayes procedure, og efterfølgende foreninger med invasiv stadium blev testet via permutation test med 10.000 permutationer hver anvendelse af standard chi-kvadrat goodness-of-fit test. Udgangen af ​​blandingen modeller omfatter en klasse-specifikke betafordeling

F

jk

for hvert locus

j

og klasse

k

. Disse fordelinger indebære en receiver drift kurve (ROC) til at skelne to klasser

k

og

l

af relationen eller, alt efter hvilken kurve ligger over identiteten linje. I begge tilfælde til området-under-the-ROC (AUC), beregnet som, som kan bruges bestemme indflydelsen af ​​locus

j

om sondringen mellem klasser

k

l

. En lignende fremgangsmåde kan anvendes til at skelne klassen

k

fra de andre: vi bruger en normal tilnærmelse

G

jk

for fordelingen af ​​de andre end

k

, og compute. Vi rangeret derefter hvert locus j ved sin beregnede AUC

jk, og valgt dem med AUC . 0,90

For at identificere loci til efterfølgende validering som prædiktorer for invasive vs. non-invasiv sygdom, har vi beregnet skæringspunktet af loci, der var mest signifikant (Q 0,05) i locus-by-locus analyse, topplacering loci fra RF-analyse (% ændring i MSE 6%), og de loci med AUC 0,75 til at skelne klassen af interesse i forhold til andre i hver tumor serie, og derefter identificeret de loci overlapper i begge serier.

Bisulfite Pyrosequencing

Kvantificering af cytosin procent methylering blev udført ved pyrosekventering bisulfit-konverterede DNA ved hjælp af PyroMark MD pyrosekventering systemet (Qiagen, Valencia, CA).