PLoS ONE: Beskyttelse mod Intracellulær Oxidative Stress af Cytoglobin i Normal og Kræft spiserøret Cells

Abstrakt

Cytoglobin er en intracellulær globin af ukendt funktion, der udtrykkes oftest i celler af en myofibroblastdifferentiering afstamning. Mulige funktioner af cytoglobin omfatter buffering af intracellulær oxygen og afgiftning af reaktive oxygenarter. Tidligere arbejde i vores laboratorium har vist, at cytoglobin yder beskyttelse fra oxidant-induceret DNA-beskadigelse, når overudtrykt

in vitro

, men betydningen af ​​dette i mere fysiologisk relevante modeller for sygdom er ukendt. Cytoglobin er en kandidat til tylosis med kræft i spiserøret gen, og dens udtryk er stærkt nedreguleret i ikke-kræft oesophagal biopsier fra patienter med TOC sammenlignet med normale biopsier. Derfor øsofageale celler giver en ideel eksperimentel model til at teste vores hypotese, at nedregulering af cytoglobin udtryk sensibiliserer celler til de skadelige virkninger af reaktive ilt arter, især oxidative DNA-skader, og at dette vil kunne bidrage til TOC fænotype. I den aktuelle undersøgelse, vi testede denne hypotese ved at manipulere cytoglobin ekspression i både normale og øsofageal cancer cellelinjer, som har normal fysiologisk og ingen ekspression af cytoglobin henholdsvis. Vores resultater viser, at efter aftale med tidligere resultater, overekspression af cytoglobin i kræftcellelinjer gav beskyttelse mod kemisk induceret oxidativ stress, men dette blev kun observeret ved ikke-fysiologiske koncentrationer af cytoglobin. Desuden nedregulering af cytoglobin i normale øsofageale celler havde ingen virkning på deres følsomhed over for oxidativ stress som vurderet ved en række slutpunkter. Vi konkluderer derfor, at normale fysiologiske koncentrationer af cytoglobin ikke tilbyder cytoprotektion fra reaktive oxygenarter, i det mindste i den nuværende forsøgsmodel

Henvisning:. McRonald FE, Risk JM, Hodges NJ (2012) Beskyttelse mod Intracellulær oxidativt stress ved Cytoglobin i Normal og Kræft i spiserøret Cells. PLoS ONE 7 (2): e30587. doi: 10,1371 /journal.pone.0030587

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 11. november 2011; Accepteret: December 22, 2011; Udgivet: 16 februar, 2012 |

Copyright: © 2012 McRonald et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer Research UK projekttilskud C7738 /A10476. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cytoglobin er et medlem af globin familien af ​​haemoproteins der omfatter hæmoglobin og myoglobin, samt mere nyligt identificerede neuroglobin som udtrykkes hovedsageligt i celler i CNS [1]. Krystalstrukturen af ​​cytoglobin er løst, og studeret i detaljer [2], [3], [4] viser, at cytoglobin har mange ligheder med andre globiner, herunder den klassiske tre-over-tre alpha spiralformet globin fold og en P

O2 (oxygenaffinitet) på ca. 0,2 Torr, svarende til den i myoglobin [f.eks 5], [6]. Den høje affinitet af cytoglobin for oxygen har ført til forslaget om, at cytoglobin kan tjene som en “intracellulær” ilt transportsystem. I dette scenario er cytoglobin foreslås at levere ilt til mitokondrierne at opretholde oxidativ phosphorylering, på en måde svarende til funktionen af ​​myoglobin i muskelceller. Interessant synes oxygenaffinitet at være redox-sensitive, og reguleret af dannelsen af ​​en disulfidbro mellem to eksterne cysteinrester (Cys B2 og Cys E9). Redox-følsomme karakter af cytoglobin ilt affinitet antyder en mulig rolle cytoglobin som en ilt “vask /reserve”, hvorved ilt kun frigives, når celler bliver hypoksisk. Selv om disse er attraktive hypoteser, cytoglobin ekspression synes at være stort set begrænset til celler af en fibroblast oprindelse med ingen korrelation mellem metaboliske aktivitet af væv og niveauer af cytoglobin ekspression, som under alle omstændigheder er temmelig lav i de fleste celletyper undersøgt [7] , [8]. Disse resultater har ført til søgningen efter alternative fysiologiske funktion (er) for cytoglobin.

Cytoglobin blev første gang identificeret i 2001 [9] under en proteomisk skærm af hepatiske stjerneformige celler isoleret fra fibrotisk rotte levervæv og faktisk var oprindeligt opkaldt aktivering stjerneformet celle forening protein (Stap) i erkendelse af dette faktum [9]. Efterfølgende arbejde – både

in vitro

in vivo

[10] – [13], senest ved hjælp af transgene dyr over-udtrykkende cytoglobin [14], [15] synes at bekræfte, at cytoglobin spiller en rolle i den fibrotiske reaktion på en række organer, herunder lever og nyre. Selv mangler at blive etableret den præcise rolle cytoglobin i fibrose, pertubation af redox homeostase er en velkarakteriseret træk ved fibrose, og der er god dokumentation (især med hensyn lunge og nyre), som progression af fibrotiske læsioner involverer cykler af oxidativ reperfusionsskade efter vævshypoksi. Endvidere er det blevet påvist, at cytoglobin ekspression kan opreguleres ved hypoxi [16] – [19]. Det er derfor sandsynligt, at cytoglobin er involveret i den adaptive respons i forbindelse med denne skade.

Relateret til resultaterne i fibrotisk sygdom, er der også en spirende kroppen af ​​mekanistisk tyder på, at cytoglobin kan give beskyttelse mod oxidativ cellulær skade under andre omstændigheder, muligvis som følge af dens evne til at opfange reaktive ilt arter [20] – [23]. Faktisk har arbejdet i vores eget laboratorium vist, at overekspression af cytoglobin reducerer niveauet af kemisk inducerede reaktive ilt arter (ROS) og giver beskyttelse mod pro-oxidant induceret skade (lipidperoxidation og oxidative DNA streng pauser) [24]. I yderligere støtte til en rolle i afgiftning af ROS er det blevet rapporteret, at cytoglobin har peroxidaseaktivitet [9]. Interessant mere nylig er det blevet rapporteret, at ferri cytoglobin har pseudo-peroxidase aktivitet mod lipider, hvilket antyder, at under betingelser med oxidativt stress, omsætning af lipid baseret celle signalmolekyler kan også være en del af en cytoglobin-afhængig antioxidant respons [25]. Endvidere anden hvirveldyr globin, globin X, er fundet, at være membranassocierede og muligvis involveret i beskyttelse af lipider mod oxidation [26].

Interessant, ud over de mulige roller diskuteret ovenfor cytoglobin genet (

CYGB

) er også en kandidat tumorsuppressorgen [27], [28], [29], og vi har identificeret

CYGB

som kandidat tylosis med kræft i spiserøret (

TOC

) genet [30] – [33]. Selvom

CYGB

ikke muteret i tylotic individer [31] eller i en række sporadiske skællede celle øsofageale carcinomer [34], har vi vist, at dens udtryk er stærkt nedreguleret i ikke-kræft oesophagal biopsier fra patienter med TOC sammenlignet med normale biopsier [33].

CYGB

er også denatureret og nedreguleret i sporadisk øsofageal, lunge og hoved og hals kræft [27], [28], [33]. For nylig, nedregulering af cytoglobin har også vist sig at fremme kemisk induceret carcinogenese i gnaver leveren [35].

Der er overbevisende dokumentation for, at oxidativ beskadigelse DNA (f.eks 8-oxo deoxyguanosin), hvis ikke repareres, bidrager til dannelsen af ​​mutationer, der vides at være vigtige i ætiologien af ​​human carcinogenese [36], [37]. Vi har derfor hypotese, at tabet af cytoglobin udtryk vil gøre oesophagal celler mere modtagelige for de skadelige virkninger af ROS, og at dette bidrager til den observerede fænotype af

TOC

. I den aktuelle undersøgelse testede vi denne hypotese ved at manipulere cytoglobin udtryk i både normale oesophagal epitelceller og øsofageale pladecellekræft celler, som har normal fysiologisk og ingen endogen udtryk for cytoglobin henholdsvis.

Resultater

Manipulation af cytoglobin udtryk

Real time RT-PCR viste, at TE-8 planocellulært kræft i spiserøret cellelinje har ekstremt lave endogene niveauer af CYGB udtryk (lavere end 10

-5 med hensyn til beta actin (ACTB)), hvorimod NE1 normale oesophagal keratinocytter udtrykker CYGB på ca. 0,1 × ACTB. Denne naturlige niveau af CYGB ekspression i NE1 celler blev anset for at være det normale fysiologiske niveau, som det er inden for samme størrelsesorden som den, der observeres i et panel af normale væv (data ikke vist). CYGB ekspression blev moduleret i disse to cellelinier ved enten forbigående transfektion af genet (TE-8 celler) eller transitorisk knockdown under anvendelse af RNA-interferens (NE1 celler). Cytoglobin ekspression blev kunstigt induceret af ca. 4 eller 7 størrelsesordener i TE-8 celler, og blev reduceret med ca. fem gange ved siRNA knockdown i NE1 celler (figur 1).

Niveauer af CYGB ekspression, sammenlignet til ACTB udtryk, blev bestemt ved real time RT-PCR i en parallel prøve for hver komet assay udføres. Disse ekspressionsniveauerne vedrører derfor direkte til de komet assay data præsenteret i figur 3. Den geometriske gennemsnit af alle forsøg er vist for både TE-8 celler (orange søjler) og NE1 celler (lyserøde søjler).

Karakterisering af celler

Normal øsofageal epitel (NE-1) og øsofageal cancer (TE-8) celler blev analyseret for niveauer af oxidativt stress ved hjælp af redox-sensitive forbindelse 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCF -DA) i nærvær og fravær af buthionine sulfoxamine (BSO).

resultaterne viste, at BSO kunne inducere oxidativt stress i både TE-8 og NE1 cellelinjer, med en koncentrationsafhængig respons er indlysende (figur 2). I TE-8 celler, nåede denne statistiske signifikans i umanipulerede celler (p = 0,0134) og CYGB transficerede celler (p = 0,0034), men ikke i mock-transficerede celler (p = 0,092). Ikke desto mindre blev en lignende tendens i mock-transficerede celler. I den normale øsofageal cellelinie NE1 blev lignende resultater opnået: i dette tilfælde BSO koncentrationsafhængig oxidativ stress respons var statistisk signifikant i alle tre grupper af celler. BSO var i stand til at inducere oxidativt stress i kontrolceller (p = 0,0032), negativ kontrol siRNA behandlede celler (p = 0,0283), og celler udsat for siRNA knockdown af CYGB (p = 0,0077). Selv om der blev observeret en tendens i TE-8 celler i retning overekspression af CYGB blive associeret med lavere niveauer af ROS sammenlignet med mock-transficerede celler, var dette ikke statistisk signifikant. Ingen effekt af CYGB knockdown blev observeret i NE1 celler. Men som vores primære spørgsmål var at se på ROS-associeret DNA-skade, og ikke oxidativt stress

per se

, vi næste udført comet assay på de to cellelinier: dette har den yderligere fordel af at være en meget mere følsom indikator for cellulær oxidativ skade

oxidativ stress blev målt i en:. TE-8 og b: NE1 celler. Median DCF fluorescens er gennemsnittet af 5 gentagelser. Alle værdier blev normaliseret til det niveau set i kontrol celler uden BSO. Fejl søjler repræsenterer SEM + 2020:. Transfektionsreagens kun; + CYGB: celler transficeret med fuld længde CYGB; ve siRNA: scrambled kontrol; CYGB k /d: CYGB siRNA. * Statistisk signifikant koncentrationsafhængig respons (p 0,05) ** Statistisk signifikant koncentrationsafhængig respons (p 0,01)

Forholdet mellem oxidativ DNA-skader og cytoglobin udtryk

Comet. Assay.

I TE-8 celler blev CYGB udtryk kunstigt restaureret af forbigående transfektion (figur 1). Oxidativ DNA-skader blev målt ved comet assay i celler med to forskellige niveauer af CYGB ekspression ud over de grundlæggende kontrol: kunstigt høj overekspression (ca. 10

2-fold i forhold til ACTB ekspression), og lav (ca. fysiologisk) ekspression (ca. 10

-1-fold i forhold til ACTB ekspression). Til kunstigt høje niveauer af CYGB ekspression, blev en signifikant reduktion i oxidativ DNA-skade observeret under betingelser med eksogent oxidativt stress (1000 uM BSO) (p = 0,014) sammenlignet med mock-transficerede celler (figur 3a) Der var også en signifikant forskel i oxidative DNA-skader mellem celler med lave /fysiologiske og høje CYGB ekspressionsniveauerne (p = 0,035). Der var imidlertid ingen signifikant forskel mellem mocktransfekterede celler og dem med lave /fysiologiske CYGB ekspressionsniveauer (p = 0,074); Tilsvarende blev der observeret nogen forskel mellem kontrol og mock-transficerede celler (p = 0,455). Disse data tyder på, at CYGB udøver en beskyttende virkning mod cellulære oxidative skader kun på kunstigt høje – ikke-fysiologiske niveauer af udtryk. Selv counter-intuitivt, var der en tendens til øget oxidativ DNA-skade, da CYGB blev udtrykt ved lave /fysiologiske niveauer, har denne tendens ikke statistisk signifikans. I NE1 celler, reduktion af CYGB udtryk med 90% ved hjælp af RNA-interferens resulterede ikke i nogen forskel i oxidative DNA-skader: dette støtter yderligere det argument, at CYGB kun udøver sin cytobeskyttende effekter på kunstigt høje (ikke-fysiologiske) niveauer af ekspression (figur 3b)

DNA streng-pauser (baseline og oxidativ-beskadigelse-inducerede) blev målt ved Fpg-modificerede komet assay i et:. TE-8 og B: NE-1-celler med forskellige niveauer af CYGB ekspression (som vist i figur 1). Mean af median procent komet hale intensitet vises. Fejl- søjler repræsenterer SEM. * Signifikant forskellig fra hinanden (p 0,05). # Betydeligt forskellige fra hinanden (p 0,05).

Cytoglobin og celle motilitet

Tidligere undersøgelser har vist, at cytoglobin påvirkninger cellulære motilitet og kolonidannende evne [29], men i den aktuelle undersøgelse blev påvist nogen effekt af cytoglobin knockdown ved cellevækst i enten NE1 oesophagal keratinocytter eller CCD-18Co colon myofibroblaster, enten 25 eller 50 timer efter sårdannelse (data ikke vist).

diskussion

Tidligere arbejde i vore og andre laboratorier har vist, at cytoglobin har potentiale til at afgifte reaktive oxygenarter (ROS)

in vitro

når overudtrykt i forskellige cellekultursystemer [20], [21], [22 ], [24]. Endvidere nedregulering af cytoglobin af RNAi er også for nylig blevet vist at sensibilisere gliomceller for oxidativ stress induceret af både hæmning af elektrontransportkæden med antimycin A, og ioniserende stråling [23]. Yderligere støtte til en rolle for cytoglobin i afgiftning af ROS er den biokemiske tegn på, at cytoglobin protein besidder iboende peroxidaseaktivitet samt antioxidant egenskaber, og der er tegn på, at andre globiner herunder neuroglobin og globin X kan også have lignende egenskaber [20], [ ,,,0],26], [38], [39]. Men i tilfælde af cytoglobin, er det stadig uklart, om dette er en ægte fysiologiske funktion af cytoglobin eller en artefakt af de eksperimentelle modeller. Til dato har ingen “cytoglobin reduktase” blevet identificeret, som kunne reducere Fe

3+ tilbage til Fe

2+, så det er ikke klart, hvordan oxideret cytoglobin ville blive genvundet i cellerne. Der er også tegn på, at cytoglobin har katalytisk aktivitet mod de reaktive nitrogen arter nitrogenoxid, katalysere dets omdannelse til nitrat, hvor ascorbat og cytochrom b (5) er blevet identificeret som potentielle kilder til at reducere effekt [40]. Denne formodede aktivitet korrelerer godt med iagttagelsen af ​​høje niveauer af cytoglobin ekspression i fibroblaster og glatte muskelceller i vaskulaturen, hvor nitrogenoxid er et velkendt signalering molekylær der medierer vaskulær tonus [41]. Imidlertid har andre undersøgelser spørgsmålstegn ved, om nitrogenoxid dioxygenase er en fysiologisk relevant enzymatisk aktivitet af cytoglobin [42]. Desuden er der også nye

in vivo

tegn på en beskyttende rolle cytoglobin (og neuroglobin) mod oxidativ stress, især i modeller for fibrose, der involverer hypoxisk reperfusion og efterfølgende oxidativ skade [10] – [15] .

Mange af disse data er blevet genereret i forsøgsmodeller, hvor cytoglobin er over-udtrykt, så selvom disse er interessante resultater, deres fysiologiske relevans fortsat uklart. I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi, om cytoglobin udtryk havde råd beskyttelse mod kemisk induceret oxidativ DNA-skader i dyrkede oesophagal celler. Dette er især relevant, fordi

CYGB

er nedreguleret i både tylosis med kræft i spiserøret og sporadiske oesophagal kræft [33], og vi antaget derfor, at tab af cytoglobin udtryk ville bevidstgøre disse celler til DNA-skader, og at dette kan være involveret i ætiologien af ​​kræft i spiserøret. Når cytoglobin blev overudtrykt i TE-8 kræft i spiserøret cellelinjer, der har ringe eller ingen endogen cytoglobin udtryk, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser observerede vi statistisk signifikant beskyttelse mod BSO-induceret oxidativ DNA-skader, som vurderes af FPG-modificerede komet assay. Denne virkning var imidlertid koncentrationsafhængig: på lavere cytoglobin overekspression den beskyttende virkning var tabt. I overensstemmelse hermed havde knockdown af fysiologiske niveauer af cytoglobin i kulturer af primære NE1 øsofageale celler ikke mere bevidste om BSO-induceret oxidativ DNA-skade som bedømt ved den samme endepunkt. Interessant er det for nylig blevet rapporteret, at knockdown af cytoglobin ekspression i glioma-celler ved RNAi hæver niveauerne af antimycin A-induceret hydrogenperoxid [23]. I den aktuelle undersøgelse, observerede vi ingen signifikant forskel i niveauerne af BSO-induceret oxidativt stress som vurderet ved oxidation af dichlorfluorosceinopløsningen. Årsagen til denne forskel er ikke klar, men kan være relateret til enten den anden cellelinie eller metode til at inducere oxidativt stress.

Vores resultater tyder på, at selv om induktion af cytoglobin udtryk, for eksempel som følge af hypoxi eller i respons på oxidativ skade, har potentialet til at være beskyttende, i vores undersøgelse dette blev kun observeret ved CYGB niveauer sandsynligvis ikke blive nået

in vivo

. Desuden var der ingen tegn på en øget følsomhed over for ROS efter knockdown af RNAi i celler, der udtrykker cytoglobin på fysiologiske niveauer. Derfor er en cytobeskyttende rolle mod oxidativt induceret DNA-skader ikke at være en funktion af cytoglobin i øsofagus celler og andre forklaringer på cytoglobin funktion og tab af udtryk i denne sygdomsmodel er påkrævet.

Materialer og metoder

Cell kultur

Normale oesophagal epitelceller (NE-1, en gave af professor GSW Tsao, Anatomisk Institut, University of Hong Kong (se [43]) blev opretholdt i T

75 dyrkningskolber ved hjælp keratinocyt serumfrie medier (Gibco) suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse (25 pg ml

-1) og rekombinant epidermal vækstfaktor (0,15 ng ml

-1). kulturer blev rutinemæssigt delt 01:03 cirka hver 3-4 dage under anvendelse af trypsin-EDTA og sojabønnetrypsininhibitor (Gibco) ifølge den anbefalede protokol for keratinocyt serumfrit medium. den øsofageal cancer cellelinje TE-8 (en gave fra professor Toshio Kudo, Cell Resource Center for Biomedical Research , Tohoku University, Japan, [44]) blev dyrket i T

75 dyrkningskolber med RPMI-medium suppleret med 10% FBS og 2% L-glutamin. TE-8 celler blev delt efter behov ved hjælp af en standard trypsin-EDTA-protokol. CCD-18Co colon myofibroblaster (indkøbt fra ATCC produkt nr: CRL-1459; [45]) blev dyrket i DMEM supplememented med 10% FBS, 1% L-glutamin og 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAAs). blev spildt om nødvendigt disse celler under anvendelse af en standard trypsin-EDTA-protokol.

Cytoglobin knockdown

NE-1 celler eller CCD-18Co-celler blev videredyrket i seks-brønds plader (for komet assay) eller tolv brønde (for ROS assay og sårhelende assay) og fik lov til at nå 60-70% konfluens forud for transfektion. Celler blev transficeret med 25 nM slutkoncentration af enten en negativ kontrol scrambled siRNA (Ambion, AM4611) eller CYGB siRNA (Qiagen; SI03228323 eller Ambion; s41571) ved anvendelse af 15 ug ml

-1 Transit siQuest reagens (Mirus Bio) ifølge producentens anvisninger. Efter RNAi knockdown blev celler inkuberet i 42 timer inden de gennemfører forsøg (24 timer for sårheling eksperiment). Ekspression af CYGB blev analyseret ved RT-PCR (se nedenfor).

Overekspression af cytoglobin

TE-8 øsofageale pladecellecarcinom celler blev videredyrket i seks- eller tolv-brøndsplader som tidligere. Transient transfektion af

CYGB

blev opnået med Transit 2020 transfektionsreagens (Mirus Bio) (2 pi eller 5 pi per brønd i 12-brønds eller 6-brønds plader henholdsvis), og fuld længde

CYGB

cDNA-klon i en pCMV6-AC-vektoren (Origene) (0,6 ug eller 1,5 ug i 12-brønds eller 6-brønds plader henholdsvis), som pr standardprotokol for transfektionsreagens. Efter transfektion blev celler inkuberet i 42 timer inden de gennemfører forsøg. Ekspression af CYGB blev analyseret ved RT-PCR (se nedenfor).

RNA-ekstraktion, første streng cDNA-syntese og RT-PCR-analyse

Isolering af totalt RNA blev udført under anvendelse af et RNeasy Minikit ( Qiagen) med direkte lysis af cellerne i kulturen plade, og homogenisering under anvendelse QiaShredder rør. Revers transkription blev udført under anvendelse af en RETROscript Kit (Ambion) med, oligo dT-primere og 1 ug af total RNA, i overensstemmelse med producentens anvisninger. For RT-PCR en master mix blev fremstillet indeholdende TaqMan 2 × Master Mix (Applied Biosystems), β-actin VIC /MGB probe til den endogene kontrol (Applied Biosystems 4326315E), CYGB primer og probe mix (sense 5′-CTC TAT GCC AAC TGC GAG GAC-3 ‘, antisense 5′-AAC TGG CTG AAG TAC TGC TTG-3′ og probe FAM-5′-TGG CCA TCC TGG TGA GGT TCT TTG TG-3’-sort hul quencher) i RNase -fri vand. En standard totrinsprotokol blev anvendt til tidstro RT-PCR-analyse (50 ° C i 2 minutter efterfulgt af 50 cykler ved 95 ° C i 15 minutter og 60 ° C i 1 minut). Den Cycle Threshold (Ct) værdier opnået blev anvendt til at beregne realtids kvantificering værdi (RQ) udnytte ΔΔCt metoden, med ACTB Ct-værdier og ubehandlede /utransficerede celler, der anvendes som normaliseringsfaktorer.

FPG modificeret komet assay

Den metode var baseret på den af ​​Singh et al [46] med mindre modifikationer [47]. Efter behandling blev cellerne vasket i kold PBS og forsigtigt skrabet over i 1 ml frisk PBS (TE-8 celler) eller trypsineret (NE1 celler). Efter centrifugering (8000 rpm, 5 minutter) pellets blev resuspenderet i PBS (150 pi). En alikvot af resuspenderede celler (30 pi) blev anbragt i et sterilt rør indeholdende agarose med lavt smeltepunkt (300 pi), og denne cellesuspension blev overført til to mikroskopobjektglas (150 pi per slide), præ-coatet med 0,5% normal smeltepunkt agarose. Dækglas blev tilsat, og objektglassene anbragt på en metalbakke over is i 10 minutter. Dækglas blev fjernet og glider inkuberet i 1 time ved 4 ° C i lysisbuffer (2,5 M NaCl, 0,1 M Na

2EDTA, 10 mM Tris-base, 1% natrium-N – laurylsarcosinat, 10% DMSO og 1% Triton X -100). Objektglas blev vasket (3 x 5 minutter) med FPG Buffer (40 mM HEPES, 0,1 M KCI, 0,5 mM EDTA 0,2 mg /ml bovint serumalbumin pH 8,0) og inkuberet med 1 enhed FPG enzym (Trevigen) i 50 pi FPG puffer ved 37 ° C i 1 time (kontrolglas blev inkuberet med FPG puffer kun). Objektglas blev overført til en vandret elektroforese tank indeholdende elektroforese buffer (300 mM NaOH og 1 mM Na

2EDTA, pH 13,0) og DNA lov at slappe i 20 minutter. DNA blev underkastet elektroforese (25 V, 0,8 V cm

-1, 20 minutter) og dias neutraliseret ved vask (3 x 5 minutter) med neutralisering puffer (0,4 M Tris, indstillet til pH 7,5). Slides blev efterfølgende farvet med Sybr Gold 50 pi (Invitrogen, 10 × løsning i neutralisering buffer).

Glassene blev undersøgt ved 320 × forstørrelse ved hjælp af en fluorescens mikroskop (Zeiss Axiovert 10, Tyskland), udstyret med en 515 -560 nm excitationsfilter og et spærrefilter på 590 nm. En USB digitalt kamera (Merlin, Allied Vision Technologies) modtog billederne, som blev analyseret ved hjælp af en personlig computer-baseret billedanalyse-system Comet assay IV (Perceptive instrumenter). Billeder af hundrede tilfældigt udvalgte kerner blev analyseret pr dias. Måling af procent hale-DNA (TD%) blev valgt for at vurdere omfanget af DNA-skade, da dette har vist sig at lide meget mindre fra inter-run variation end andre komet parametre, fordi det er stort set uafhængig af elektroforese spænding og driftstid [48] . Medianværdier af tre separate forsøg blev analyseret under anvendelse ANOVA og post-hoc t-test, som anbefalet af Duez et al [49].

ROS assay

Reaktive oxygenarter blev vurderet ved at måle oxidationen af ​​redox følsomme farvestof 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCF-DA). Efter hydrolyse af intracellulære esteraser, den resulterende H2DCF er ude af stand til at forlade cellen og oxideres derefter ved ROS til dannelse af fluorescerende DCF-molekylet. Niveauet af fluorescens er proportional med graden af ​​oxidativt stress i cellerne. For at inducere oxidativt stress kunstigt, buthioninsulfoximin (BSO), som hæmmer det hastighedsbegrænsende trin i glutathion-syntese, blev sat til de dyrkede celler i 24 timer før forsøget ved 100 eller 1.000 uM.

Kort fortalt følgende behandlinger 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (slutkoncentration 10 uM for TE-8 celler; 1 uM eller 0,1 uM for NE1 celler) blev tilsat, og cellerne inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter i mørke. Celler blev løsnet ved trypsinering, pelleteret ved centrifugering og resuspenderet i PBS. Prøve fluorescensintensitet blev analyseret (FITC-kanal) med en FACScalibur ™ flowcytometri (Becton Dickinson) og CellQuestTM Pro software (Becton Dickinson). Celler uden fluorescerende farvestof blev anvendt som en negativ kontrol for at korrigere for baggrunden autofluorescens.

Sårheling Assay

NE1 øsofageale keratinocytceller og CCD-18Co colon myofibroblaster blev dyrket i tolv-brønds plader, og underkastet RNAi knockdown af CYGB som tidligere beskrevet, ved hjælp af både Ambion og Qiagen siRNAs til CYGB, og en scrambled kontrol siRNA. Hver betingelse blev gentaget seks gange for hver cellelinie. Cellelaget blev ridset indover form under anvendelse af en steril pipettespids ved 24 timer efter Knockdown. Celler blev fotograferet ved 1, 25 og 50 timer efter sårdannelse ved anvendelse af et USB digitalkamera. Billeder blev analyseret ved hjælp TScratch software [50], som analyserede ændringer i andelen af ​​åbne sår Samarbejdsområde (OWA).