PLoS ONE: Små RNA Målretning transkriptionsstartsitet Fremkald Heparanase Silencing gennem Interferens med transkriptionsinitiering i Human Cancer Cells

Abstrakt

Heparanase (HPA), en endo-HD-glucuronidase som spalter heparansulfat kæde af heparan sulfat proteoglycaner, overudtrykkes i hovedparten af ​​humane cancere. De seneste oplysninger tyder på, at små interfererende RNA (siRNA) inducerer transkriptionel gendæmpning (TGS) i humane celler. I denne undersøgelse transfektion af siRNA mod -9 /+ 10 bp (siH3), men ikke -174 /-155 bp (siH1) eller -134 /-115 bp (siH2) region i forhold til transkriptionsstartstedet (TSS) lokalisering på 101 bp opstrøms for translation start site, resulterede i TGS på heparanase i human prostatacancer, blærecancer, og gastriske cancerceller i en sekvens-specifik måde. Methyleringsspecifik PCR og bisulfit sekventering afslørede intet DNA methylering af CpG-øer i heparanase promotor i siH3-transficerede celler. Den TGS af heparanase ikke indebar ændringer af epigenetisk markører histon H3 lysin 9 dimethylering (H3K9me2), histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) eller aktiv kromatin markør acetyleret histon H3 (AcH3). Reguleringen af ​​alternativ splejsning var ikke involveret i siH3-medieret TGS. I stedet siH3 forstyrret transkriptionsinitiering via faldende bindingen af ​​både RNA polymerase II og transskriptionsfaktor II B (TFIIB), men ikke bindingen af ​​transkriptionsfaktorer Sp1 eller tidlig vækstrespons 1 på heparanase-promotoren. Desuden Argonaute 1 og Argonaute 2 lettede nedsat binding af RNA-polymerase II og TFIIB på heparanase promotor og var nødvendige siH3-induceret TGS på heparanase. Stabil transfektion af den korte hårnål RNA konstruktion målretning heparanase TSS (-9 /+ 10 bp) til kræftceller, resulterede i nedsat proliferation, invasion, metastase og angiogenese af cancerceller

in vitro

i athymiske musemodeller. Disse resultater antyder, at små RNA’er rettet mod TSS kan inducere TGS på heparanase via interferens med transkriptionsinitiering, og væsentligt undertrykke tumorvækst, invasion, metastase og angiogenese af cancerceller

Henvisning:. Jiang G, Zheng L, Pu J, Mei H, Zhao J, Huang K, et al. (2012) Små RNA Målretning transkriptionsstartsitet Fremkald Heparanase Silencing gennem Interferens med transkriptionsinitiering i Human kræftceller. PLoS ONE 7 (2): e31379. doi: 10,1371 /journal.pone.0031379

Redaktør: Sebastien Pfeffer, franske Nationale Center for Videnskabelig Forskning – Institut de biologie moléculaire et cellulaire, Frankrig

Modtaget: 23. maj 2011; Accepteret: 6 jan 2012; Publiceret: 20 feb 2012

Copyright: © 2012 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.200.284, No. 30.600.278, No. 30.772.359, No. 30.972.980, No. 81.071.997, No. 81.072.073), Program for New Century Fremragende Talenter i University (NCET-06-0641) , Scientific Research Foundation for det returnerede Overseas Chinese Scholars (2008-889) og grundforskning Midler til de centraleuropæiske universiteter (2010JC025). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Heparanase er en endo-HD-glucuronidase, der har evnen til at spalte heparansulfat kæde af heparansulfatproteoglycaner [1], og letter invasionen og metastase af tumorceller ved forværrede basalmembranen (BM) og ekstracellulære matrix-barrierer [2]. Heparanase bidrager også til angiogenese ved at frigive og aktivere forskellige heparansulfat-binding vækstfaktorer [3], [4]. Desuden er høj ekspression af heparanase hyppigt observeret i et stigende antal primære humane tumorer, såsom prostatakræft, blærekræft og mavekræft, og heparanase-lettet invasion og metastase fremkalde dårlige resultater i kræftpatienter [5] – [8] . Disse undersøgelser antyder, at heparanase kan serveres som en molekylær mål for cancerterapi.

Silencing af genekspression ved anvendelse af små interfererende RNA (siRNA) udgør en potentiel strategi til terapeutisk produktudvikling [9]. Foruden posttranskriptionel gendæmpning i en lang række organismer, kan siRNA interagere med DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) og direkte transkriptionel gendæmpning (TGS) i humane celler [10]. Promotor- målrettet siRNA’er inducerer CpG ø metylering af ubiquitin C-genet [11], human immundefekt virus type 1 long terminal repeat [12], Ras association domæne familie 1A [13], og interleukin-2 [14] i humane celler. Desuden eksogene siRNAs udløse TGS i humane celler gennem heterochromatin dannelse ved målet promotor, der involverer rekruttering af kromatin-modificerende enzymer til at resultere i dimethylering af histon H3 ved lysin 9, trimethylation af histon H3 ved lysin 27, og histondeacetylering [10], [11], [12]. Desuden siRNA’er målretning introniske eller exon sekvenser tæt på en alternativ exon kan øge dimethylering af histon H3 ved lysin 9 og trimethylation af histon H3 ved lysin 27 på målstedet, hvilket resulterer i differentiel splejsning af denne exon [15]. Disse undersøgelser tyder på, at siRNA’er påvirker ikke kun transskription men også splejse proces med target-genet, hvilket indebærer en realistisk tilgang til at udvikle gen-specifikke lægemidler.

Transskription start-sites (TSS) er væsentlige kontakter til konvertering anerkendelse af DNA-genomet i aktiv syntese af RNA-kopier [16]. Vlodavsky

et al

. identificeret TSS af heparanase genet ved nukleotidposition 99 bp opstrøms for translationsstartstedet (ATG) af en traditionel hurtig amplifikation af cDNA ender (RACE) assay [17]. Ved anvendelse af den modificerede RLM-RACE metode til selektivt at amplificere DNA-fragment fra udjævnede fuld-længde mRNA, Jiang

et al

. rapporterede nøjagtig TSS på 101 bp opstrøms for ATG [18]. Alternativ større heparanase transkript er også blevet bemærket i humane immunsystem, men den nøjagtige placering og opstrøms promotor for TSS forbliver stort set ukendt [19] – [21]. I den aktuelle undersøgelse viste vi, at små RNA’er målretning heparanase TSS lokalisering på 101 bp opstrøms for translation start site [18], herunder siRNA og korte hårnål RNA (shRNA), induceret TGS på heparanase via forstyrre transkriptionsinitiering, men ikke gennem fremkalde heterochromatin dannelse eller epigenetiske ændringer, og svækket spredning, invasion, metastase og angiogenese af forskellige former for kræftceller

in vitro

og

in vivo

.

Resultater

siRNA-induceret TGS af heparanase

for at undersøge, om siRNA kunne fremkalde TGS af heparanase, vi designet og syntetiseret tre siRNAs målrettet TSS (lokalisering på 101 bp opstrøms for ATG) eller mere opstrøms områder af heparanase promotor, -174 /-155 (siH1), -134 /-115 (siH2), og -9 /+ 10 bp (siH3) (fig. 1A og fig. S1). SiRNA rettet mod kodende region + 1496 /+ 1515 bp (SiH4) blev påført som en kontrol (fig. 1A). Cellelinier af de mest almindelige humane cancere, herunder prostatacancer (PC-3), blærecancer (EJ) og gastrisk cancer (SGC-7901), blev valgt som model for denne undersøgelse. Transfektion af siH3 og SiH4, men ikke af siH1, siH2 eller negativ kontrol siRNA (sinc), svækkede heparanase ekspression i PC-3, EJ og SGC-7901 celler (fig. 1B). Desuden transfektion af siH3, men ikke af sinc eller krypteret siRNA (siSCb), ophævede transkriptionelle og translationelle niveauer af heparanase på en dosis-afhængig måde (Fig. 1C). Den siH3-induceret nedregulering af heparanase varede op til 5 dage, og delvist genvundet på dag 7 (fig. 1D). Transfektion af siM31 og siM32, to forkerte siRNAs af siH3, ikke afskaffe heparanase udtryk (fig. 1E), hvilket viser, at indgrebet blev henrettet ved siH3 i en sekvens-afhængig måde. Svigt af siM32 at inhibere transkription tydede også at delvis komplementaritet til 5′-terminalen af ​​mRNA ikke var tilstrækkeligt for heparanase silencing (fig. 1E). DNA-duplexer analog med siH3 ikke hæmme udtryk, der angiver, at anerkendelse skal være medieret af RNA (fig. 1E). Promoter reporter-luciferase assay viste, at transfektion af siH3, men ikke siScb, siM31 eller siM32, undertrykte heparanase promotoraktivitet og transkription (fig. 1F), hvilket antyder, at den reducerede heparanase ekspression skyldtes transkriptionel inhibering med siH3. Endvidere blev ekspressionen af ​​ikke-nedstrøms gener af heparanase, prolifererende cellekerneantigen (PCNA) og cyclin D1, ikke påvirket ved transfektion af siH3 (fig. S2). Disse resultater viste, at siH3 selektivt målrettet TSS og induceret TGS af heparanase i en sekvens-specifik måde i humane cancerceller.

A, skema siRNA’er rettet mod TSS (lokalisering på 101 bp opstrøms af oversættelsen startstedet) , opstrømspromotorelement og kodende regioner af heparanase, herunder siH1 (-174 /-155 bp), siH2 (-134 /-115 bp), siH3 (-9 /+ 10 bp) og SiH4 (+ 1496 /+ 1515 bp). Automatiseret nukleotid grundlæggende lokal tilpasning søgeværktøj (BLAST) søgninger viste, at der ikke var nogen sekvens ligner siH1, siH2 eller siH3 i transskriberede sekvens af heparanase. B, 72 timer efter transfektion af siRNA’er i PC-3, EJ og SGC-7901 celler, 100 nmol /l siH3 eller SiH4, men ikke af siH1, siH2 eller sinc, dæmpede heparanase ekspression i cancerceller. C, 72 timer efter transfektion af siH3, men ikke af sinc eller siScb, resulterede i ophævede heparanase ekspression af cancerceller på en dosis-afhængig måde. D, siH3 (100 nmol /l) -induceret gendæmpning af heparanase i cancerceller varede op til 5 dage, og delvist gendannet på dag 7. E, 72 timer efter transfektion af 100 nmol /l DNA-duplekser analog med siH3, siM31 eller siM32 (to forkerte siRNA’er af siH3), ikke afskaffe heparanase udtryk i kræftceller. F, dual-luciferase reporter assay indikerede, at 72 timer efter transfektion af siH3, men ikke af siScb, siM31 eller siM32, undertrykte heparanase promotoraktivitet og transkription i cancerceller. Symbolerne (# og A) viser et signifikant fald fra utransficerede kontrol (mock) og en betydelig stigning fra pGL3 /Basic, henholdsvis.

siRNA-induceret hæmning af transkriptionsinitiering af heparanase

Da TGS er forbundet med epigenetiske ændringer i promotor, såsom DNA-methylering, histon methylering, og histondeacetylering [10], [11], [12], vi først analyseret den epigenetiske status opstrøms regioner af heparanase-promotoren. De CpG-øer var umethyleret i utransficerede PC-3, EJ og SGC-7901 celler (mock) og i dem transficeret med sinc (data ikke vist). Transfektion af siH1, siH2 eller siH3, inducerede ikke methylering af CpG-øer af heparanase promotor i cancerceller (fig. 2A og fig. 2B). Udtrykket og DNA binding af histon H3 lysin 9 dimethylering (H3K9me2) og histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) på heparanase promotor, to undertrykkende epigenetiske mærker involveret i TGS [10], ændrede ikke ved transfektion af siH2, siH3, SiH4 eller siScb (fig. S3 og fig. 2C). Endvidere bindingen af ​​acetyleret histon H3 (AcH3), en markør for transkriptionelt aktive kromatin [22], var upåvirket ved transfektion med disse siRNAs (fig. 2C). I mellemtiden var der ingen PCR-produkter på “no-antistof” kontrol i kromatin immunpræcipitering (chip) assay (fig. 2C). Bindingen af ​​H3K9me2 og H3K27me3 blev beriget på promotoren for transkriptionelt til tavshed gener p16 og retinsyrereceptor beta 2 (RARβ2) [23], sat i forhold til den heparanase promotor i PC-3-celler (fig. 2D), og bindingen af AcH3 på heparanase promotor væsentligt forøget efter de pan histondeacetylaser (HDAC) -hæmmer trichostatin A (TSA) behandling (fig. 2E), hvilket bekræfter tilstrækkeligheden af ​​CHIP assay betingelser. Desuden har behandling af cancerceller med DNMT inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (5-Aza-CdR) eller TSA ikke påvirke heparanase lyddæmpning, hvilket indikerer, at DNMTs og HDAC var usandsynligt, at blive inddraget i denne proces (Fig. 2F). Endvidere chip assay viste ingen ændringer i bindingen af ​​transkriptionsfaktorer tidlig vækstrespons 1 (EGR1) og Sp1 på heparanase promotorregionen omkring siH3-målsted, udelukker deres potentielle rolle i siH3-induceret TGS på heparanase (fig. 2G). Imidlertid faldt bindingen af ​​RNA-polymerase II (RNA Pol II) på blev bemærket i siH3-transficerede celler heparanase promotor, men ikke i siH2-, siH4- eller siScb-transficerede celler (Fig. 2H). Endvidere bindingen af ​​transkriptionsfaktoren II B (TFIIB), der dirigerer RNA Pol II kernepromotoren, blev også reduceret i siH3-transficerede celler (Fig. 2H). CHIP data om RNA Pol II eller TFIIB binding blev bekræftet af real-time kvantitativ PCR (qPCR) med primere spænder over TSS (fig. 2H). Nedsat RNA Pol II eller TFIIB binding blev set op til 7 dage efter transfektion (fig. 2i). Desuden har den relative inklusion-til-udelukkelse forholdet mellem den første exon af heparanase, som var et alternativ exon nær siH3 målrettede website, ikke ændre sig efter transfektion af siH2, siH3, SiH4 eller siScb i kræftceller (Fig. 2J ), hvilket tyder på, at reguleringen af ​​alternativ splejsning ikke var involveret i siH3-medieret TGS. Disse resultater viste, at transkriptionsinitiering af heparanase blev forstyrret af siH3 målretning TSS.

A og B, bisulfit sekventering og MSP viste, at transfektion af siRNA’er (100 nmol /l), siH1, siH2 og siH3, ikke inducere methylering af CpG-øer af heparanase-promotoren i cancerceller. C, 72 timer efter transfektion, chip med forskellige primer sæt viste, at der ikke var nogen PCR produkter til “no-antistof” (nr Ab) kontrol, og bindingen af ​​H3K9me2, H3K27me3 og AcH3 på heparanase promotor ændrede ikke efter transfektion af siH2, siH3, SiH4 eller siScb i kræftceller. D, Bindingen af ​​H3K9me2 og H3K27me3 blev beriget på promotoren for p16 og RARβ2 sammenlignet på heparanase promotoren i PC-3-celler. E, behandling af siH3- eller siScb-transficerede cancerceller med TSA (200 nmol /l), resulterede i en signifikant stigning i bindingen af ​​AcH3 på heparanase-promotoren, sammenlignet med patienter behandlet med DMSO kontrol opløsningsmiddel. F, cancerceller blev transficeret med siRNA’er og behandlet med 5-aza-CdR (5 pmol /L) eller TSA (200 nmol /l), hvilket resulterer i ingen ændringer i siH3-induceret heparanase silencing. G, 72 timer efter transfektion, chip assay indikerede, at bindingen af ​​Sp1 og EGR1 på heparanase-promotoren, ikke ændrede efter transfektion af siH2, siH3, SiH4 eller siScb i cancerceller. H, chip assay med forskellige primersæt indikerede nedsat binding af RNA Pol II og TFIIB på heparanase promotor i siH3-transficerede cancerceller, men ikke i siH2- eller SiH4-transficerede celler. I, chip assay indikerede, at den reducerede RNA Pol II eller TFIIB binding blev set reproducerbart og op til 7 dage efter transfektion af siH3 i cancerceller. J, QRT-PCR detektion viste, at den relative integration-til-udelukkelse forholdet mellem den første exon af heparanase ikke ændredes efter transfektion af siH2, siH3, SiH4 eller siScb i cancerceller. Symbolet (#) angiver en signifikant fald fra utransficerede kontrol (mock) eller siScb. Symbolet (▴) angiver en betydelig stigning fra bindende for heparanase promotor. Symbolet (Δ) angiver en betydelig stigning fra DMSO kontrol.

Inddragelse af Ago1 og Ago2 i siH3-induceret transkriptionel hæmning af heparanase

Da tidligere undersøgelser indikeret inddragelse af RNA-interferens (RNAi) maskiner i TGS, vi nærmere indflydelse Argonaute en (Ago1) og Argonaute 2 (Ago2), to integrerede dele af RNAi pathway [24], [25], på siH3-induceret TGS af heparanase. Som vist i fig. 3A og fig. 3B, bankede ned af Ago1 eller Ago2 undertrykte siH3-induceret TGS af heparanase. Desuden transfektion af siH3, men ikke af siScb, øget sammenslutningen af ​​Ago1 og Ago2 på heparanase promotor, der henholdsvis blev afskaffet ved at banke ned af Ago1 og Ago2 (fig. 3C og fig. 3D). Desuden Ago1 eller Ago2 lyddæmpning øget binding af RNA Pol II og TFIIB på heparanase promotor, hvorimod transfektion af sinc ikke havde nogen effekt (fig. 3E). Nuklear run-on assay yderligere vist, at opstrøms transskriberede mRNA (indeholdende Exon 1) fremlagde på et lavt niveau i forhold til den samlede heparanase mRNA, og transfektion af siH3 svækket den spirende transskription af den samlede heparanase mRNA, men ikke mRNA initieres fra opstrøms alternativ TSS , som også blev gendannet ved at banke ned af Ago1 eller Ago2, hvilket indikerer, at den reducerede heparanase ekspression skyldtes inhibering på transkriptionen initieres fra den nedstrøms TSS (fig. 3F). Disse resultater viste, at Ago1 og Ago2 var nødvendige for siH3-induceret transkriptionel inhibering af heparanase i humane cancerceller.

A og B, vælte af Ago1 eller Ago2 genoprettede siH3-induceret TGS på heparanase i cancerceller, henholdsvis. C og D, chip assay viste, at 72 timer efter transfektion af siH3, men ikke af siScb, sammenslutningen af ​​Ago1 og Ago2 på heparanase promotoren steg i kræftceller, som blev afskaffet ved at banke ned af Ago1 og Ago2 hhv. E, chip assay indikerede, at nedregulering af Ago1 eller Ago2 restaureret bindingen af ​​RNA Pol II og TFIIB på heparanase promotor i cancerceller. F, nuklear run-on assay viste, at den opstrøms transskriberede mRNA (indeholdende Exon 1) fremlagde på et lavt niveau i forhold til den samlede heparanase mRNA, og den spirende transskription af den samlede heparanase mRNA, men ikke mRNA initieres fra opstrøms alternativ TSS, faldt efter transfektion af siH3 til kræftceller for 72 timer, som blev restaureret ved at banke ned af Ago1 eller Ago2. Symbolerne (# og A) indikerer en signifikant nedgang og en betydelig stigning fra siScb hhv. Symbolet (*) angiver et signifikant fald fra sinc.

RNAi maskiner interagerede indirekte med transskription præinitieringskomplekset i siH3-induceret TGS af heparanase

Siden seneste beviser en indviklet samspil mellem RNAi maskiner og RNA Pol II i heterochromatic lyddæmpning i

Drosophila

[26], vi hypotesen, at Ago1 eller Ago2 direkte kan interagere med RNA Pol II eller TFIIB at deltage i siH3-induceret TGS af heparanase. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [27], [28], co-immunpræcipitering analyse viste, at RNA Pol II interagerede med TFIIB i dyrkede celler. Transfektion af siH3 ikke svækker interaktionen mellem RNA Pol II og TFIIB (fig. 4A). Men anti-RNA Pol II eller anti-TFIIB antistoffer ikke samarbejdede immunoprecipite Ago1 eller Ago2 fra siH3-transfekterede celler (fig. 4A), som blev yderligere dokumenteret ved co-immunopræcipitering analyse med pull-down af anti-Ago1 eller anti -Ago2 antistoffer (fig. 4B). Kombinere med ovenfor beviser at Ago1 og Ago2 påvirket bindingen af ​​RNA Pol II og TFIIB på heparanase promotoren viste disse resultater, at RNAi maskiner og transkription præinitieringskomplekset var forbundet, men ikke direkte interaktiv, i siH3-induceret TGS på heparanase i humane cancerceller .

A, co-immunudfældningsanalyse med pull-down af anti-RNA-Pol II eller anti-TFIIB antistoffer indikerede, at siH3 eller siScb ikke svækker interaktionen mellem RNA Pol II og TFIIB i cancerceller. Desuden har Ago1 eller Ago2 ikke direkte interagerer med enten RNA Pol II eller TFIIB i siScb- og siH3-transficerede cancerceller. B, co-immunopræcipitering analyse med pull-down af anti-Ago1 eller anti-Ago2 antistoffer ikke samarbejdede immunoprecipite RNA Pol II eller TFIIB fra siScb- og siH3-transficerede cancerceller.

Heparanase TSS -targeted shRNA svækket spredning, vedhæftning, invasion og angiogenese af cancer celler

in vitro

Fordi de seneste undersøgelser viser muligheden for shRNA-medieret TGS i pattedyrceller [29], [30] , for yderligere at undersøge virkningerne af heparanase TSS-målrettet siRNA på cancerceller blev shRNA konstruktioner etableret og transficeret ind PC-3, EJ og SGC-7901 celler (fig. S4A). Stabil transfektion af shP3 (-9 /+ 10 bp) og shCd (+ 1496 /+ 1515 bp), men ikke af SHP2 (-134 /-115 bp) eller krypteret shRNA (shScb), resulterede i svækkede mRNA og protein niveauer af heparanase (fig. s4b, og fig. S4C) og fald i

in vitro

proliferation af cancerceller (fig. 5A, fig. 5B og fig. 5C). Transwell Analysen viste, at celler transficeret med shP3 eller shCd, men ikke med SHP2 eller shScb, præsenterede en forringet invasion kapacitet (fig. 5D og fig. 5E). Desuden cancerceller transficeret med shP3 eller shCd, men ikke med SHP2 eller shScb, udviste markant reduceret evner i adhæsion til præcoatede matrigel (fig. 5F). Røret dannelse af endotelceller blev undertrykt ved behandling med mediet forbehandles ved stabil transfektion af cancerceller med shP3 eller shCd, men ikke med shScb (fig. 5G og fig. 5H). Desuden blev frigivelsen af ​​basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) fra cancerceller svækkede efter stabil transfektion af shP3 eller shCd, men ikke af shScb (fig. 5I). Disse resultater viste, at stabil transfektion af heparanase TSS-målrettet shRNA bemærkelsesværdigt faldt spredning, vedhæftning, invasion og angiogenese af cancer celler

in vitro

.

A, MTT kolorimetri viste, at stabil transfektion af shP3 eller shCd, men ikke af SHP2 eller shScb, svækkede spredning af PC-3, EJ og SGC-7901 celler. B og C, kolonidannelse assay viste, at transfektion af shP3 og shCd, men ikke af SHP2 eller shScb, svækket den

in vitro

spredning af PC-3, EJ og SGC-7901 celler. D og E, transwell analyse viste, at PC-3, EJ og SGC-7901 celler transficeret med shP3 eller shCd, men ikke med SHP2 eller shScb, besad en forringet invasion kapacitet. F, i adhæsionsassayet, PC-3, EJ og SGC-7901-celler transficeret med shP3 eller shCd, men ikke med SHP2 eller shScb, udviste markant reduceret evne i adhæsion til forud belagt matrigel. G og H, endotelceller blev behandlet med mediet forbehandles ved stabil transfektion af PC-3, EJ og SGC-7901 celler med shP3 eller shCd, men ikke med shScb, hvilket resulterer i undertrykt rør formation på matrigel. Jeg, frigivelse af bFGF fra PC-3, blev EJ og SGC-7901 celler svækket efter transfektion af shP3 eller shCd, men ikke af shScb. Symbolet (#) angiver en signifikant fald fra tomme vektor-transficerede celler (mock).

Heparanase TSS-målrettet shRNA hæmmede væksten, metastase og angiogenese af kræftceller

in vivo

Vi næste undersøgt effekten af ​​shP3 mod tumorvækst, metastase og angiogenese

in vivo

. Stabil transfektion af shP3 eller shCd i PC-3-celler, resulterede i nedsat vækst og vægt af subkutane xenotransplantattumorer i athymiske nøgne mus (fig. 6A). Desuden stabil transfektion af shP3 eller shCd resulterede i fald i CD31-positive mikrokar og betyde kardensitet inden tumorer (fig. 6B). Endvidere ekspressionen af ​​heparanase nedstrøms gener i tumorer, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) og matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), blev også reduceret med stabil transfektion af shP3 eller shCd (fig. 6C og fig. 6D).

A, subkutan injektion af PC-3 celler i athymiske nøgne mus etablerede subkutane xenotransplantattumorer. En måned senere, mus (n = 6) fra hver gruppe blev aflivet. Stabil transfektion af cancerceller med shP3 eller shCd resulterede i nedsat tumorstørrelse og den gennemsnitlige tumorvægt dannet af shP3- eller shCd-transficerede celler blev signifikant reduceret. B, CD31 udtryk og den gennemsnitlige fartøj tæthed inden tumorer faldt efter stabil transfektion af shP3 eller shCd. C, HE og immunhistokemisk farvning viste, at stabil transfektion af shP3 eller shCd resulterede i nedsat udtryk for heparanase, VEGF og MMP-9 i tumorer. D, ekspressionen af ​​heparanase nedstrøms gener i tumorer, VEGF og MMP-9 blev reduceret med stabil transfektion af shP3 eller shCd. E, 3 × 10

6 PC-3-celler blev injiceret i peritonealhulen af ​​2 måneder gamle mandlige nøgne mus (n = 5 for hver gruppe). Nøgne mus, der modtog injektion af cancerceller stabilt transficeret med shCd eller shP3 viste forholdsvis færre knuder. F, PC-3-celler blev injiceret i halevenen af ​​athymiske nøgne mus (0,4 x 10

6 celler per mus, n = 5 for hver gruppe). Kræftceller stabilt transficeret med shP3 eller shCd etablerede signifikant færre metastatiske kolonier. Symbolet (#) angiver en signifikant fald fra tomme vektor (mock).

I de peritoneale metastase undersøgelser, nøgne mus, der fik injektion af PC-3 celler stabilt transficeret med shCd eller shP3 viste forholdsvis færre knuder (22 ± 9 og 17 ± 7, henholdsvis) end tom vektor (mock) gruppe (106 ± 31) (fig. 6E). I de eksperimentelle metastase undersøgelser, PC-3-celler stabilt transficeret med shP3 eller shCd etableret statistisk færre lunge metastatiske kolonier end mock gruppe (fig. 6F). Kombineret med de tilsvarende fund i EJ og SGC-7901 celler (data ikke vist), disse resultater antydede, at heparanase TSS-målrettet shRNA kunne hæmme væksten, metastase og angiogenese af cancer celler

in vivo

.

diskussion

TGS vej blev oprindeligt rapporteret i tobaksplanter, som staten methylering og ekspression af gener blev påvist at være påvirket af RNA [31]. For nylig er RNA’er blevet rapporteret at mediere TGS i pattedyrceller via DNA CpG-methylering og heterokromatin dannelse [10], [11], [12], [32]. De tavse-state epigenetiske modifikationer medføre tab af transkriptionsfaktorer rekruttering [12], [33]. I mellemtiden siRNA’er målretning interne genregioner af human fibronectin 1 kan inhibere indre forlængelse og efterfølgende påvirke splejsningssted udvælgelse [15]. Den humane heparanase-promotoren er bestod af en minimal basisk område, der spænder over 300-700 bp proximalt i TSS lokalisering på 101 bp opstrøms for ATG, der er kendetegnet ved høj GC indhold, observeret /forventet CpG-forhold, og bindingsstederne for flere grupper af transkription faktorer [18]. Transkriptionsfaktor EGR1 er relateret til den inducerbare transkription af heparanase-gen i T-celler [34], og den allestedsnærværende transkriptionsfaktor Sp1 er forbundet med dets basal transkription [18]. I denne undersøgelse har vi designet tre siRNA’er rettet mod heparanase promotorregionen indeholdende CpG loci og Sp1-bindingssted, mens siH3 målrettede region (-9 /+ 10 bp omkring heparanase TSS lokalisering på 101 bp opstrøms for ATG) blev også støder op til den bindingssted af EGR1. viste imidlertid vores beviser, at transfektion af disse siRNAs inducerede hverken methylering af CpG eller heterochromatin formation på heparanase promotor. Chipanalyse yderligere udelukket ændringerne i bindingen af ​​Sp1 og EGR1 på heparanase promotor og splejsningsvariant analyse udelukkes den differentielle splejsning af den nærmeste exon.

Faktisk siRNA’er målretning promotorområder inducerer ikke TGS i visse tilfælde [35]. Nylige undersøgelser viser, at antigen-RNA’er (agRNAs) rettet mod TSS kan blokere gentranskription af human progesteronreceptor (PR) [36], [37], androgen receptor (AR) [37], og huntingtin [37], hvilket antyder, at TSS kromosomale DNA giver forudsigelige mål for inhibering af genekspression med RNA’er. I den aktuelle undersøgelse påviste vi, at siRNA og shRNA målretning TSS inducerede TGS på heparanase i humane cancerceller, mens de små RNA’er målretning opstrøms-promotorområdet indeholdende CpG-loci ikke undertrykke ekspressionen af ​​heparanase, hvilket antyder, at de loci de målrettede might ikke være modtagelige for TGS. Desuden har vi bemærkede også lignende effektiviteten af ​​siH3 og kodning region målrettet SiH4 i formildende udtryk og funktion af heparanase. Disse resultater indikerer den værdifulde rolle TSS-målrettede små RNA i reguleringen af ​​genekspression ved TGS, især når RNA rettet opstrøms promoter region undlader at producere en markant effekt.

En mekanisme i stedet genetisk og epigenetisk regulering understreger TGS af heparanase induceret af TSS-målrettet siRNA i humane cancerceller. Tilsvarende er ingen methylering observeres omkring TSS of AR og PR [34], og agRNAs-medieret TGS forekommer uanset om promotoren indeholder en TATA-boks [36], [37]. Tidligere undersøgelser viser, at TFIIB binder kernepromotoren DNA og dirigerer RNA Pol II til TSS, fremme samling af den funktionelle transskription præinitieringskomplekset (PIC) [38]. I denne undersøgelse viste vi, at siRNA’er rettet mod TSS lokalisering på 101 bp opstrøms for ATG forstyrrede transkriptionsinitiering af heparanase, og det ledsagende tab af TFIIB og RNA Pol II foreslået, at siRNA’er reduceret samlingen af ​​PIC-dannelse på dette TSS. Det er blevet anført, at når pattedyr-RNA-polymerase binder til DNA ved TSS, det danner en åben kompleks, hvor baserer -9 til +2 er tilgængelige for kemiske midler, som modificerer enkeltstrenget DNA, hvilket antyder, at TSS kan være tilgængelige for hybridisering [36 ], [37]. Nylige undersøgelser har indikeret tilstedeværelsen af ​​ikke-kodende promotor-associeret RNA (pRNA) og konsekvenserne af deres målretning af siRNA’er i humane celler [39], [40]. Low-kopi pRNA’er er anerkendt af antisense streng af siRNA og fungere som en anerkendelse motiv til direkte epigenetisk inaktivering komplekser til de tilsvarende målrettede initiativtagere at mægle TGS i humane celler [39]. Desuden dannelsen af ​​siRNA-pRNA kompleks med bidraget fra Ago2 er ansvarlig for den reducerede samling af funktionelle PIC og blokade af transkriptionsinitiering i c-myc-promotoren [40]. Således, uanset om pRNA eksisterer for at dirigere siH3-induceret TGS af heparanase garanterer vores yderligere undersøgelser. Fordi et åbent kompleks dannes under transskriptionen af ​​hvert gen, er det muligt at direkte designe agRNAs ethvert gen, som har en kendetegnet TSS [41]. Derfor mener vi, at TGS strategi via TSS-målrettet siRNA også kan anvendes på andre gener, som berettiger vores yderligere undersøgelse.

Ago protein komplekser indeholdende enkeltstrengede små RNA kaldes modne RNA-induceret lyddæmpning kompleks (RISC) [42]. Siden proteiner er positivt ladede overflader, der er velegnede til binding siRNA og tilpasse den til den komplementære målsekvens, hvilket antyder, at siden proteiner kan spille en central rolle i dannelsen af ​​RNA-induceret initiering af TGS kompleks, der initierer heterochromatin formation [37] .