PLoS ONE: reduceret ekspression af galectin-9 Bidrager til et dårligt resultat i tyktarmskræft ved at hæmme NK Cell Kemotaksis Delvist gennem Rho /rock1 signalvej

Abstrakte

galectin-9 er en bredt udtrykt protein, der er involveret i immun regulering og tumorpathogenesis og fungerer som en markør for en dårlig prognose i forskellige typer af kræft. Men den kliniske virkning og den præcise mekanisme, ved hvilken dette protein bidrager til colon tumor progression er uklare. I den foreliggende undersøgelse påvist vi ekspressionen af ​​galectin-9 og CD56-celler under anvendelse immunohistokemi. Spearman rang korrelation blev anvendt til at klarlægge associationen mellem galectin-9-ekspression og naturlige dræberceller (NK) celle infiltration. Indflydelsen af ​​galectin-9 på NK-92 cellemigrering blev evalueret in vitro under anvendelse Transwell kemotaksiassays. Rolle rh-galectin-9 i F-actin polarisering i NK-92-celler blev undersøgt ved anvendelse af laser scanning konfokal mikroskopi. Vi viste, at galectin-9 blev udtrykt i 101 (78,91%) kolon tumorvæv og der blev udtrykt på lavere niveauer i disse væv end i para-tumorvæv. Lave niveauer af galectin-9 udtryk var positivt korreleret med en dårlig histologisk kvalitet og lymfeknude metastaser (P 0,05). En Kaplan-Meier-metoden og Cox proportionel risiko regressions analyse viste, at den samlede overlevelse var længere hos patienter med høj galectin-9 udtryk i en 8-års follow-up (P 0,05). Spearman rang korrelation viste, at der var en lineær sammenhæng mellem galectin-9-ekspression og CD56

+ NK-celle infiltration (R

2 = 0,658; P 0,0001). Galectin-9 stimulerede migration i humane NK-92-celler ved at påvirke F-actin polarisering gennem Rho /rock1 signalvejen. Disse resultater antyder, galectin-9 ekspression potentielt repræsenterer en ny mekanisme for tumorer at undslippe immunovervågning i colontumorer

Henvisning:. Wang Y, Sun J., Ma C, Gao W, Song B, Xue H, et al. (2016) reduceret ekspression af galectin-9 Bidrager til et dårligt resultat i tyktarmskræft ved at hæmme NK Cell Kemotaksis Delvist gennem Rho /rock1 signalvejen. PLoS ONE 11 (3): e0152599. doi: 10,1371 /journal.pone.0152599

Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

Modtaget: December 21, 2015; Accepteret: 16 Marts 2016; Udgivet: 30 Mar 2016

Copyright: © 2016 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til Xun Qu (nr 31470885, 31270971, 81072406); National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til Jintang Sun (nr 31.300.752); National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til Qianqian Shao (nr 81.300.510); og National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til Meixiang Yang (nr 30.901.326)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hvert år omkring 1,2 millioner patienter udvikle tyktarmskræft (CRC) og 600.000 personer dør af denne sygdom i hele verden [1]. På trods af at der har været positive forbedringer i kirurgiske og farmaceutiske strategier, CRC stadig langt fra terapeutisk kontrol [2]. Den nuværende mangel på viden om de immunologiske og molekylære underliggende årsager til CRC er en væsentlig hindring for det er nødvendigt for den fremtidige udvikling af målrettede CRC behandlinger forbedre behandlinger for denne disease.Hence identificere nye biomarkører.

Udviklingen af ​​kræft er en multi-trins proces, der ikke kun er omfattet af talrige celle iboende faktorer, men også af ydre faktorer i tumormikromiljøet [3, 4]. Som vigtige komponenter i tumor mikromiljø, visse typer leukocytter indflydelse tumor progression og prognose [5-7]. Naturlige dræber (NK) celler er en af ​​de største celletyper i det medfødte immunsystem. I CRC, er omfattende intratumoral infiltration af NK-celler forbundet med en bedre prognose, afhængigt af deres cytotoksiske virkninger på cancerceller [8, 9]. Men en nylig undersøgelse viste, at NK-celler er generelt sjældnere i CRC mikromiljø end i det tilstødende normale slimhinde trods for tilstedeværelsen af ​​relativt høje niveauer af NK-celle-reaktion kemokiner i tumorvæv [10]. Denne modsigelse antydede, at chemokiner alene ikke være tilstrækkelig til at rekruttere NK-celler til tumoren.

Galectins er opløselige medlemmer af lectin superfamilien, der er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​et carbohydratgenkendelsesdomæne og β-galactosid bindingsaffinitet. I alt 15 pattedyr galectins er hidtil identificeret [11]. Blandt disse galectins, galectin-9 udviser immunregulatoriske virkninger hvorigennem den forstyrrer funktionen og biologiske adfærd af forskellige typer af immunceller, herunder T-celler, dendritiske celler og NK-celler [12, 13]. I tumorbærende mus, galectin-9 forøgede antallet af NK-celler i den peritoneale ekssudat [14], hvilket indikerer, at det spiller en potentiel regulerende rolle, der involverer NK-celler under tumorprogression. I særdeleshed har lavere niveauer af galectin-9 er observeret i de fleste typer af cancerceller, herunder mundtlig pladecellecarcinom [15], melanom [16], brystcancer [17] og gastrisk cancer [18], end i deres normale modstykker . På grund af den tætte forbindelse mellem galectin-9-ekspression og NK celle tal, er det rimeligt at spekulere, at et reduceret niveau af galectin-9 i en tumor bidrager til den dårlige infiltration af NK-celler ind i tumoren mikromiljø. Men fordi tilstedeværelsen og betydningen af ​​galectin-9-ekspression er endnu ikke blevet påvist i colon cancer væv, er det stadig uklart, om denne forening sker i coloncancer og hvilke regulatoriske mekanismer er involveret, hvis nogen.

I nærværende undersøgelse fandt vi, at galectin-9-ekspression blev reduceret i kolon tumorvæv, som er forbundet med dårlig prognose hos disse patienter. Vi tilbyder også beviser ved hjælp

in vitro

undersøgelser, galectin-9 forbedrer NK celle migration ved at udøve effekter på F-actin polarisering via Rho /rock1 signalvejen. Disse resultater repræsenterer en potentielt ny mekanisme, hvorigennem tumorer kan flygte fra immun overvågning.

Materialer og metoder

Patienter og væv

Vores undersøgelse omfattede data, der blev opnået fra 128 patienter med histologisk bekræftet tyktarmskræft, der blev opereret på Qilu Hospital i Shandong University mellem januar 2004 til december 2011 (Jinan, Shandong, Kina), dette herunder en gruppe af 38 patienter, hvor vi sammenlignede para-tumor med tumorvæv og en anden gruppe af 90 patienter blev inkluderet i overlevelse analyse. Indsamling og brug af vævsprøver overholdt de relevante retningslinjer og institutionelle praksis den etiske komité i Qilu Hospital i Shandong University, og skriftlig godkendelse blev opnået i hvert tilfælde før vævsprøve kollektion. Den etiske komité af Qilu Hospital Shandong University godkendt denne undersøgelse (Kyll-2013-069). De vigtigste klinisk-patologiske data er vist i tabel 1, og de supplerende Materialer og metoder (S1-fil).

Immunhistokemi og evaluering

Sektioner (4 pm) af formalin-fikseret paraffinindlejret colontumorvæv prøver blev afvokset, rehydreret og inkuberet med de følgende primære antistoffer: kanin polyklonalt anti-humant galectin-9 (sc-366.141, 1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) og monoklonalt muse-anti- human CD56 (3576, 01:50; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Snittene blev efterfølgende farvet med de tilsvarende sekundære antistoffer. To uafhængige patologer, der var blindet for den kliniske data, vurderet de immunhistokemiske resultater. Den anvendte metode til at evaluere vævene er beskrevet i den supplerende Materialer og metoder (S1 File).

Celler og behandlinger

Celler blev inkuberet ifølge standardprocedurer beskrevet i ATCC kultur guide. De humane colon tumorcellelinier SW480, SW620 og HT29 blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Invitrogen, USA) suppleret med 5% kalvefosterserum (FCS) (Bio International, USA). Den humane NK92 cellelinje var en gave fra The Second Military Medical University (Shanghai, Kina) [19] og dyrket med Alpha Minimum Essential medium (Gibco, USA), der indeholder 2 mM L-glutamin og 1,5 g /l natriumbicarbonat, men uden ribonukleosider og deoxyribonucleosider og forskellige komponenter blev tilsat for at opnå fuldstændig vækstmedium: 0,2 mM inositol (17508, Sigma, USA); 0,1 mM 2-mercaptoethanol (ES-007E, Merck Millipore, Tyskland); 0,02 mM folinsyre (F8758, Sigma, USA); 100-200 U /ml rekombinant IL-2; og tilpasning til en slutkoncentration på 12,5% hesteserum (16050, Gibco, USA) og 12,5% føtalt bovint serum. Alle celler blev inkuberet ved 5% CO

2 i henhold til standard procedurer i ATCC kultur guide.

Isolering af humane NK-celler Salg

Perifere mononukleare blodceller (PBMC’er) blev opnået efter centrifugering med Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences, Sverige). NK-celler blev isoleret ved anvendelse af NK Cell Isolation Kits (MiltenyiBiotec, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Renheden af ​​CD3

-CD56

+ celler blev konsekvent over 95%, målt gennem flowcytometrisk analyse.

RNA-interferens

Vi forbigående transficeret af siRNA mod humant galectin-9 (siRNA # 378 og siRNA # 690, GenePharma, Shanghai, Kina) eller scramble siRNA i HT-29 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (11.668-019, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Knockdown Virkningsfuldheden af ​​siRNA’er rettet mod galectin-9 blev undersøgt under anvendelse af RT-PCR, Western blot-analyse og ELISA ved 36 h efter transfektion. Følgende siRNA sekvenser rettet mod humant galectin-9 blev anvendt:

siRNA378: sense, 5′-GGAAGACACACAUGCCUUUTT-3 ‘; antisense, 5’-AAAGGCAUGUGUGUCUUCCTT-3 ‘; og siRNA 690: sense, 5’-CCAUUACCCAGACAGUCAUTT-3 ‘; antisense, 5’-AUGACUGUCUGGGUAAUGGTT-3 ‘.

Migration assay

Vi brugte transwell kamre med en 5-mm pore membran (Costar, Corning, NY, USA). NK-92-celler eller primære NK-celler blev udpladet i de øverste kamre. Colontumor cellekultursupernatanten eller varierende koncentrationer af rh-galectin-9 (2045-GA-050, R 0,001, figur 1D).

galectin-9 ekspression i colon tumor og para-tumor vævsprøver blev påvist under anvendelse af immunhistokemi under anvendelse af en isotypekontrol (A) eller et anti-galectin-9-antistof (B). (C), Repræsentant galectin-9

høj (til venstre) og galectin-9

lav (til højre) udtryk i tumor og para-tumorvæv. (D), grafisk illustration af den statistiske fordeling af galectin-9 ekspressionsniveauer i 38 coloncancer væv og deres tilsvarende normale mucosale prøver. Udtrykket intensitet blev repræsenteret som en histologisk score (Σpi), hvor p er den procentdel af galectin-9-positive cancerceller (scoret som 1, 1-10%, 2, 11-50%, 3, 51-80%; eller 4, 81-100%) og i repræsenterer farvningsintensiteten (scoret som 0, ingen farvning, 1, svag farvning, 2, moderat farvning, eller 3, stærk farvning). Stærk (++++), moderat (+++), mild (++), svag (+) og negative (-) farvning var 10-12, 7-9, 4-6, 1-3 og 0, henholdsvis.

galectin-9 udtryk og kliniske resultater i kolon kræftpatienter

Vi udforskes prognostiske værdi af galectin-9 i tyktarmskræft. I alt 90 tyktarmskræft sager og deres associerede kliniske og overlevelse oplysninger blev analyseret for at fastlægge den rolle galectin-9 udtryk. Baseret på medianen af ​​de observerede niveauer af galectin-9 blev kolon tumor patienter inddelt i lav (0-1, n = 39) og høj (2-4, n = 51), der udtrykker grupper. Signifikante forskelle blev fundet i galectin-9-ekspression var ifølge TNM stadie, lymfeknudemetastase, og histologisk grad, men ikke køn, alder, ordistant metastase (tabel 3).

univariat analyse af de klinisk-patologiske faktorer anført, at tidlig TNM fase (I /II) og ingen lymfeknudemetastase (N-) signifikant blev forbundet med gode resultater (P = 0.001and P = 0,001, henholdsvis). Især blev høj galectin-9 udtryk signifikant associeret med god overlevelse (hazard ratio (HR): 0,483; 95% konfidensinterval (CI): 0,269-0,867; P = 0,015) (tabel 4). De median overlevelse hos patienter med galectin-9

høj og galectin-9

lav var 87 og 34 måneder. Overlevelseskurverne er vist i figur 2A (log-rank test, P = 0,012). Resultaterne af Kaplan-Meier analyser stemte overens med den univariate analyse (Fig 2B og 2C). Desuden samlede overlevelse var bedre hos patienter med godt til moderat differentiering var bedre end i dårligt differentierede tilfælde, men denne forening nåede ikke signifikans (figur 2D, P = 0,051).

Kaplan-Meier kurver er vist at beskrive forholdet mellem galectin-9-ekspression og samlet overlevelse (A), lymfeknudemetastase og samlet overlevelse (B), TNM stadie og samlet overlevelse (C), og histologisk differentiering og samlet overlevelse (D). Test prøve (n = 90). Galectin-9

høj ekspression, ingen lymfeknude metastaser og TNM stadie (I /II) viste sig at forudsige længere overlevelsestid (P 0,05, log-rank test)

Desuden er de uafhængige parametre, som blev anset for at være af betydning i den univariate analyse, herunder TNM stadie og galectin-9 udtryk, blev derefter brugt i en anden multivariat analyse. Resultaterne antydede, at galectin-9 udtryk i tyktarmen tumorvæv (HR: 0,549, 95% CI: 0,303-0,995, P = 0,048) og TMN etape (HR: 2,371, 95% CI: 1,306-4,304, P = 0,005) var uafhængige prognostiske markører, hvilket viser, at galectin-9 ekspression i colon tumorvæv er en positiv prognostisk faktor for samlet overlevelse (tabel 4).

Relationer mellem densiteten af ​​CD56

+ NK celler og galectin-9-ekspression i CRC tumorceller

Vi næste undersøgt infiltration af CD56

+ NK celler i tyktarmskræft væv og sin tilknytning til galectin-9 udtryk. CD56

+ celler blev opdaget inden for tyktarmskræft celle reder, kolon kirtler og stroma (Fig 3A). Det mediane antal CD56

+ celler var 0,3 (interval: 0,0 ~ 26,6) pr enkelt høj-power felt (HPF) i tyktarmen tumorvæv og 16.25 (interval: 0,0-42,4). I para-tumorvæv

(A), blev CD56-ekspression påvist i colon tumor og para-tumor vævsprøver (38 tilfælde) under anvendelse af immunhistokemi med et anti-CD56-antistof eller en isotype kontrol. Pilen angiver NK-celler; Paneler viser antallet af CD56

+ NK celler, der blev observeret i hver mikroskopisk felt i tumor og para-tumorvæv. (B), et repræsentativt udvalg fra tumorer høje eller lave mængder af galectin-9 (øverst) og CD56 (nedenfor) på samme sted som udtrykker. (C), Paneler, der viser antallet af CD56

+ NK-celler, der blev observeret i hver mikroskopisk felt i galectin-9

høj eller galectin-9

prøver lave væv. (D), Sammenhængen mellem galectin-9 og CD56 udtryk i vævsprøver.

Så vi analyse den kliniske betydning af NK-celler i 38 patienter med tyktarmskræft. Baseret på medianen af ​​NK-celler infiltration blev kolon tumor patienter opdelt i negative og positive grupper. Signifikante forskelle blev fundet i NK-celler infiltration i henhold til TNM stadie (tabel 5).

Mængden af ​​CD56

+ celle infiltration var signifikant højere i para-tumorvæv end i tumorvæv (P range 0-42,4 vs. 0-0,8; P 0,0001) (fig 3B og 3C). Galectin-9-ekspression var signifikant korreleret med CD56

+ NK-celle infiltration i tyktarmskræft og para-tumor prøver (P 0,0001, R

2 = 0,658, Fig 3D)

galectin-9 øget kemotaksi i humane NK-celler

ovenstående resultater tyder en sammenhæng mellem galectin-9-ekspression og NK-celle infiltration i tyktarmskræft væv. Virkningerne af galectin-9 på NK-celler blev dernæst undersøgt in vitro. Vi først udforsket, om udskillelsen af ​​galectin-9 fra tumorceller havde en kemotaktisk virkning på migration i NK-celler. I disse eksperimenter vi bestemt niveauet for galectin-9 udtryk i 3 tyktarmskræft cellelinjer, herunder SW480, SW620 og HT29, hjælp QRT-PCR og western blot analyse. Resultaterne viste, at HT29-celler havde den højeste galectin-9 ekspressionsniveauet blandt disse 3 cellelinjer (Fig 4A og 4B), og disse celler blev derfor udvalgt til følgende test. Vi har designet siRNA at vælte galectin-9-ekspression i HT29-celler. Som vist i fig 4C-4E, galectin-9 mRNA og protein niveauer og koncentrationen af ​​galectin-9 i kultursupernatanten blev signifikant reduceret med to forskellige siRNA sekvenser, siRNA # 378 og siRNA # 690. Interessant, HT-29 kultursupernatanter induceret væsentligt højere kemotaxi i NK-92-celler, som er CD56

+ humane NK-celler [19]. Disse virkning af HT-29 supernatanter på NK-92 kemotaxi blev vendte markant ved tilsætning af galectin-9 siRNA’er # 378 og # 690 grupper (Fig 4F) .Derefter ved hjælp af andre koloncarcinomcellelinie SW620, vi konsekvent fundet, at galectin-9 udskilles fra SW620 havde også en kemotaktisk virkning på NK-92 migration celler (S1 fig).

galectin-9-ekspression blev undersøgt i colontumorcellelinier (HT29, SW480, og SW620) under anvendelse qRT- PCR (A) og Western blot-analyse (B). HT29-celler blev opdelt i 5 grupper: en kontrolgruppe (dyrket med kun medium), en lipo (behandlet med Lipofectamine 2000), en NC-gruppe (transficeret med den negative controlsiRNA), en galectin-9-siRNA (# 378) -gruppe og en galectin-9-siRNA (# 690) gruppe. Knockdown effektiviteter af siRNA’er rettet mod galectin-9 blev undersøgt under anvendelse QRT-PCR (C) og Western blot-analyse (D). * P 0,05 over for kontrol. (E), blev galectin-9 sekretionsniveauer målt i forskellige grupper ved hjælp galectin-9 ELISA kits. Alle resultater er vist som middelværdien og SEM af firdobbelte forsøg * P. . 0,05 over for kontrol (F), Kemotaksis fra NK-92 celler som respons på HT29 supernatanter behandlet med galectin-9 siRNA; * P 0,05 versus kontrol, og # P 0,05 vs. NC. Vi analyserede kemotaxi i NK-92-celler som respons på forskellige koncentrationer af galectin-9 (G). En migration indeks (MI) blev anvendt til at redegøre for den høje mængde af tilfældig migration, der fandt sted i NK-celler. IL-12 blev anvendt som en positiv kontrol til initiering kemotaxi i NK-92-celler. * P 0,05 over for kontrol, ** P 0,001 over for kontrol. Repræsentative data er vist fra mindst 3 eksperimenter.

Dernæst undersøgte vi, om galectin-9 er en kemoattraktant for NK-celler. I disse forsøg blev forskellige doser af rh-galectin-9 analyseres for at bestemme galectin-9 s kemotaktisk virkning på NK-92-celler. Resultaterne viste, at 25 og 50 ng /mL rh-galectin-9 induceret kemotaksi i NK-92 celler, men at forskellen var ikke signifikant. Ved en koncentration på 100 ng /ml, NK-92 cellemigration specifikt forøget over transwell membran ved ca. 2 gange (P 0,001, sammenlignet med kontrollen, Fig 4G)

galectin-9 fremmer. F-actin omlejringer i NK-celler ved at øge Rho familie ekspression i NK-celler

Lymfocytter undergå dramatiske cytoskelet-omlejringer under celle migration.The lille GTPase Rho er en central regulator af actincytoskelettet, og Rho-kinase, som også er kendt som Rho-associeret coiled-coil-kinase (ROCK), er en Rho effektor-protein. For at vurdere inddragelsen af ​​Rho /ROCK i transmigration af NK-celler, blev kemotaksiassays udføres i nærvær af den velkarakteriserede ROCK inhibitor, Y27632, og en anden Rho-specifik inhibitor, C3 transferase. Resultaterne viste, at Y27632 og C3 transferase signifikant inhiberede NK-92 cellevandring (Fig 5A).

(A), blev Kemotaksi inhiberet af Rho og ROCK inhibitorer i NK-92-celler. NK-92-celler blev stimuleret under anvendelse af medium alene i 4 timer eller medium indeholdende Y27632 (20 uM) eller C3 transferase (2 ug /ml) i 1,5 timer. En migration indeks (MI) blev anvendt til at forklare den høje tilfældige migration, der blev observeret i NK-celler. * P 0,05 over for kontrol. (B), Udtrykket for RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, RhoQ og RhoT1 mRNA ved hjælp af RT-PCR i NK-92 celler, der blev inkuberet i nærvær eller fravær af rh-galectin-9 i en koncentration på 100 ng /ml i 4 timer; * P 0,05 over for kontrol. (C), Ekspressionen af ​​rock1 protein i NK-92-celler, som blev inkuberet i nærvær eller fravær af rh-galectin-9 ved en koncentration på 100 ng /ml i 24 timer. (D), Repræsentative mikrografier af NK-92 celler, som var inkuberet i nærvær eller fravær af rh-galectin-9 ved en koncentration på 100 ng /mL i 4 timer. F-actin blev farvet med rhodamin-mærket phalloidin (rød), og cellekerner blev mærket med DAPI (blå) (630 ×). Repræsentative data er vist fra mindst 3 eksperimenter.

Ovenstående resultater viste, at galectin-9 regulerer NK-celle migration. Derfor vi næste undersøgt virkningerne af rh-galectin-9 på Rho familierelaterede molekyler i NK-celler. Resultaterne viste, at rh-galectin-9 forøgede ekspressionen af ​​multiple medlemmer af Rho-familien, herunder RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, og RhoT1 (Fig 5B) signifikant. Som vist i fig 5C, rock1 protein niveauer signifikant opreguleret i NK-celler, der blev stimuleret med rh-galectin-9 i 24 h.These resultater antydede, at galectin-9 regulerer en række Rho familie molekyler i NK-celler.

Vi undersøgte dernæst, om galectin-9 påvirker omlejringer i F-actin cytoskeleton i NK-92-celler. NK-92-celler blev behandlet med rh-galectin-9 ved en koncentration på 100 ng /ml i 4 timer, og ændringer i F-actin-polymerisation i NK-92-celler blev efterfølgende undersøgt. I kontrolgruppen, F-actin i NK-92-celler dannede et særskilt phalloidin-farvede ring omkring cellemembranen. Efter behandling med rh-galectin-9, blev F-actin aggregeret ved den ene ende af cellen, som vist i figur 5D.

galectin-9 øger primære NK-celle-kemotaxi

For for yderligere at validere vores resultater, vi udfører de vigtigste forsøg med primære NK-celler. Resultaterne viser, at migrering af primære NK-celler kan påvirkes af både galectin-9 udskilles af HT29 (Fig 6A) eller rh-galectin-9 (Fig 6B). Rho og ROCK hæmmere hæmmer kemotaksi af primær NK celle (Fig 6C). Desuden rh-galectin-9 også øge ekspressionen af ​​Rho-familien (fig 6D) og rock1 (Fig 6E).

Kemotaksis af primære NK-celler som respons på HT29 supernatanter behandlet med galectin-9 siRNA (A ) eller forskellige koncentrationer af galectin-9 (B). En migration indeks (MI) blev anvendt til at redegøre for den høje mængde af tilfældig migration, der fandt sted i primære NK-celler. IL-12 blev anvendt som en positiv kontrol for initiering kemotaxi primære NK-celler. * P 0,05 over for kontrol. Og # P 0,05 over NC. (C), Kemotaksis blev hæmmet af Rho og ROCK hæmmere primære NK-celler. Primære NK-celler blev stimuleret under anvendelse af medium alene i 4 timer eller medium indeholdende Y27632 (20 uM) eller C3 transferase (2 ug /ml) i 1,5 timer. * P 0,05 over for kontrol. (D), Udtrykket for RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, RhoQ og RhoT1 mRNA ved hjælp af RT-PCR i primære NK-celler, som blev inkuberet i nærvær eller fravær af rhGalectin-9 ved en koncentration på 100 ng /ml i 4 timer; * P 0,05 over for kontrol. (E), ekspressionen af ​​rock1 protein i primære NK celler, som blev inkuberet i nærvær eller fravær af rhGalectin-9 ved en koncentration på 100 ng /ml i 24 timer. Repræsentative data er vist fra mindst 3 forsøg.

Discussion

I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at galectin-9-ekspression er lavere i colontumorvæv end i tilsvarende normale væv og galectin-9-niveauer er forbundet med NK-celle infiltration og patientoverlevelse. In vitro undersøgelser viste, at galectin-9 forøgede NK-celle rekruttering ved at udøve effekter på Rho /rock1 udtryk og F-actin polarisering. Vi har derfor identificeret en ny mekanisme, som galectin-9 påvirkninger NK-celle rekruttering under kolon tumor udvikling, og det øger vores nuværende viden om den molekylære inddragelse af galectin-9 i tumor immunitet.

galectin-9 har været observeret at blive nedreguleret i forskellige tumortyper, såsom melanom [16], cervikal pladecellekræft [23], brystcancer [24] og hepatocellulært carcinom [25], og det potentielt tjener som en klinisk signifikant biomarkør for forudsige resultater hos disse patienter. Men lidt om detaljerne i forbindelse med ekspressionen af ​​galectin-9 i tyktarmskræft væv. Vores resultater viser, at selv om størstedelen af ​​tyktarmskræft celler udtrykker galectin-9, både den positive rate og niveauet af ekspression er lavere i disse væv end i normale colon væv. I tumorer, er højere galectin-9-ekspression er forbundet med tidlig TNM stadie, ingen lymfeknudemetastase, god histologisk differentiering og længere samlet overlevelse gange. Vigtigere, antyder disse resultater, at dette protein kan være en lovende biomarkør for overlevelse hos patienter med colon-tumorer.

Virkningerne af galectin-9 i tumorer er komplekse, som er impliceret i flere aspekter, herunder tumorcelleadhæsion [15] , apoptose og cellecyklus [16], migration [26], og angiogenese [27]. Desuden er det blevet rapporteret, at galectin-9 udøvede immunregulerende roller i tumor mikromiljø. Resultaterne viste, at galectin-9 inducerede makrofager til at differentiere til plasmacytoide dendritiske celle-lignende makrofager [14, 28], der steg Tim-3

+ dendritiske celler og CD8

+ T-celler [29].