PLoS ONE: ikke-småcellet lungekræft celler, der udtrykker CD44 er beriget for Stamcelleforskning-Like Properties

Abstrakt

Baggrund

kræft stamceller teori antager, at kræft er foreviget af stilken kræft celler (CSC) eller tumorfremkaldende celler (TIC) besidder selvfornyelse og andre stamcelle-lignende egenskaber, mens differentierede ikke-spindel /initierende celler har en begrænset levetid. For at undersøge om hypotesen gælder for lungekræft, identifikation af lunge CSC og demonstration af disse kapaciteter er afgørende.

Metode /Principal Finde

Udtrykket profiler af fem stamceller markører (CD34, CD44, CD133, BMI1 og OCT4) blev screenet ved hjælp af flowcytometri i 10 lung cancercellelinier. CD44 blev yderligere undersøgt ved at teste for

in vitro

in vivo

tumorigenecity. Dannelse af kugleformede organer og

in vivo

tumor initiering evne blev påvist i CD44

+ celler i 4 cellelinjer. Seriel

in vivo

tumor transplantability i nøgne mus blev demonstreret ved hjælp H1299 cellelinje. De primære xenografter indledt fra CD44

+ celler bestod af blandet CD44

+ og CD44

– celler i samme forhold som den parentale H1299 cellelinie, støtte

in vivo

differentiering. Semi-kvantitativ realtids-PCR (RT-PCR) viste, at begge frisk sorteret CD44

+ og CD44

+ celler afledt af CD44

+ – indledt tumorer udtrykte pluripotens gener

OCT4 /POU5F1

,

NANOG

,

SOX2

. Disse stemness markører blev ikke udtrykt af CD44

– celler. Desuden frisk sorteret CD44

+ celler var mere resistente over for cisplatin behandling med lavere apoptose niveauer end CD44

– celler. Immunohistokemisk analyse af 141 operativt fjernede ikke-småcellet lungekræft viste tumorcelle ekspression af CD44 i 50,4% af tumorer, mens ingen CD34, og CD133 ekspressionen blev observeret i tumorceller. CD44-ekspression var forbundet med planocellulært karcinom, men uventet, blev der observeret en længere overlevelse i CD44-udtrykkende adenokarcinomer.

Konklusion /Betydning

Samlet set vores resultater viste, at stamceller celle-lignende egenskaber er beriget i CD44-udtrykkende subpopulationer af nogle lungekræft cellelinier. Yderligere undersøgelser er påkrævet for at præcisere, hvilken rolle CD44 i tumor cellefornyelsen og kræft formering i

in vivo

miljø

Henvisning:. Leung EL-H, FISCUS RR, Tung JW, Tin VP -C, Cheng LC, Sihoe AD-L, et al. (2010) ikke-småcellet lungekræft celler, der udtrykker CD44 er beriget for stamcelle-lignende egenskaber. PLoS ONE 5 (11): e14062. doi: 10,1371 /journal.pone.0014062

Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina

Modtaget: May 5, 2010; Accepteret: 26 oktober 2010; Udgivet: November 19, 2010

Copyright: © 2010 Leung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Seed fond for Basic Research (HKU 10.400.863 til MP Wong), et lille projekt tilskud (HKU 200.907.176.141 til EL Leung) og en oversøisk uddannelse forskningsbevilling fra Kina Medical Board, University of Hong Kong, tildelt EL Leung. Dette arbejde blev også støttet delvist af National Institutes of Health Tilskud R01HL087948, National Cancer Institute Grant R21CA131522 (til Y. Ma). DOE Finansiering DOE-FG02-08ER64608 på Nevada Cancer Institute (til L. M. Fink), en Startup Funding fra Nevada Cancer Institute og University of Southern Nevada (R. R. FISCUS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald verdensplan. Den overordnede prognose er dårlig med lav 5 år overlevelse på grund af sen præsentation, sygdom tilbagefald og manglende helbredende systemisk terapi. For nylig har cancer stamceller (CSC) teori foreslår, at cancere vedligeholdes af subpopulationer af tumorceller, der besidder stam- eller progenitorcelle egenskaber. Disse celler kan initiere tumordannelse differentiere langs multipotente veje og er relativt resistent over for konventionel kemoterapi [1]. CSC er blevet påvist i hæmatologiske og nogle faste tumorer, såsom bryst-, hjerne-, tyktarms-, lunge- og leverkræft [2], [3], [4], [5], [6]. Forskellige stamcellemarkører af normale væv er blevet anvendt til CSC identificering og isolering. F.eks CD133 er den hyppigst påvist markør i cancere i lever, hjerne, colon og lunge osv [3], [4], [5], [6]. Den CD44

+ /CD24

– /lav profil kendetegner CSC i brystkræft og prostatakræft [7], [8]. Expression af de vigtigste “stemness ‘gener af embryonale (ES) og induceret-pluripotente stamceller (IPS) celler OCT4 og BMI1 [9], [10] er blevet fundet i CSC fra forskellige kræftformer [11], [12].

markøren profil lunge CSC mangler at blive udforsket. Nylige undersøgelser ved hjælp af NSCLC cellelinjer og frisk lunge tumorvæv tyder CD133 som lungerne CSC markør [3], [11], [13], [14], [15], [16]. Biokemiske undersøgelser viste, at CD133 spiller en funktionel rolle i cellecyklusregulering og proliferation, men ikke tumorinitiering [17]. Studier i tyktarmskræft viste, at CD133

+ celler har en højere DNA-indhold [18] og blive CD133

– under metastase, men begge CD133

+ og CD133

– celler indlede tumor i SCID-mus [ ,,,0],19]. CD133

– populationer fra coloncancer og melanom viste sig også at være tumorigen i SCID /nøgne mus [19], [20]. Markører såsom ESA, CXCR4, ALDH og ABCG2 har været anvendt med CD133 til isolering CSC fra lungekræft [13], [21], [22]. CD34 og Sca-1 er nyttige til identifikation af murine lunge stamceller, men Sca-1 ikke udtrykkes i humane væv [23]. At udforske yderligere lunge CSC markører, har vi screenet udtrykket profil CD34, CD44, CD133, BMI1 og OCT4 i 10 lunge cancer cellelinjer ved flowcytometri. Vi viste, at CD44

+ men ikke CD44

– celler fra selektive kræftceller kunne udvides og serielt formeret

in vitro

in vivo

. Vi foreslår, at CD44-udtrykkende celler er beriget til stamceller egenskaber. Vores undersøgelse viser ikke, at alle CD44

+ celler er bona fide CSC, men foreslår vi, at CD44 kunne være en markør for tumor initiering evne i nogle lunge kræftceller. Udtrykket mønster af CD44 blev også kendetegnet ved kliniske lungekræft.

Resultater

Stamcelle markør udtryk profil NSCLC cellelinjer

Vi analyserede udtryk profilen af ​​formodede overflade ( CD34, CD44, CD133) og nukleare markører (BMI1, OCT4) af stamceller i 10 lung cancer cellelinjer under anvendelse af flowcytometri (tabel 1). Af de overflademarkører blev CD34, CD44 og CD133 udtrykkes på forskellige frekvenser. CD44 var den store markør udtrykt af H1299 og H23. A549, H441 og H1648 viste ingen udtryk for de overflademarkører undersøgt. CD133 blev udtrykt i HCC1833 kun. blev ikke observeret nogen korrelation i udtryk frekvens mellem 2 markører. Både de nukleare markører, BMI1 og OCT4, blev udtrykt i de fleste cancerceller i alle cellelinjer undersøgt. Repræsentative diagrammer af flowcytometri analyse for CD44 og CD133 ekspressionen blev vist i fig 1. immunblotting og immunhistokemi (IHC) analyser blev også udført på cellelinier, som indeholdt CD44

+ og CD133

+ populationer (figur 2A). Immunoblot viste CD44 proteinekspression i H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827 og H23. CD133-protein blev kun udtrykt i HCC1833 og PLC8024 som blev anvendt som en positiv kontrol cellelinie til CD133 [4]. IHC viste også CD133 ekspressionen i HCC1833 men ikke H1299, og omvendt for CD44-ekspression. Således begge resultaterne af analyserne var i overensstemmelse med flowcytometri data.

Repræsentative diagrammer af flowcytometri analyse af CD44 (FITC) og CD133 (PE) udtryk i lungekræft cellelinier HKULC2, HCC827, HKULC4, H23, HCC1833, H1299 og H1650. Døde celler, blev cellerester og dubletter gated ud. Erstatning for baggrundsfluorescens blev udført ved at måle mål signaler af enkelt farve kontroller og negative kontroller. Data blev præsenteret i 2D diagrammer plotte enten PE eller FITC-signaler mod et irrelevant kanal ECD® (også kendt som PE-Texas Red). De gennemsnitlige procenter fra 3 individuelle analyser blev præsenteret i tabel 1.

A. Repræsentant immunoblot af H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827, H23, HCC1833 og PLC8024 total protein lysat ved hjælp af antistoffer mod CD44 og CD133. Actin blev anvendt som en loading kontrol. Blottet var repræsentativ for tre individuelle eksperimenter. B. Samlet henblik på at vise tætheden af ​​SB-dannelse fra CD44

+ og CD44

– H1299 celler efter dyrkning i RPMI medium med EGF, FGF og insulin tillæg for 21 dage (øverste panel), og morfologi af SB på ugentlig intervaller (midterste panel). Celler af den første generation SB blev splittet op og analyseret ved flowcytometri (nederste panel). Den CD44

+ til CD44

– (81,58% til 9,68%) forholdet var ligner forældrenes H1299 celler (81,3% til 18,7%, tabel 1). SSC, Side Scatter Channel. C. Repræsentative områder kolonidannelse af usorteret, CD44

+ og CD44

– H1299 celler i blød agar efter dyrkning i 21 dage. Mellemværker viser forstørrede visninger af repræsentative kolonier fra de respektive celler taget under samme forstørrelse. CD44

– undergruppe viste signifikant færre kolonier sammenlignet med både CD44

+ og usorterede undergrupper. (**, P 0,01). Histogrammer repræsenteret gennemsnit på 3 uafhængige observationer fra separate eksperimenter.

Sfæroide dannelse evne NSCLC cellelinjer

Vi næste vurderede klumpformet krop (SB) dannelse evne FASC-fraktioneret celler ifølge CD44 og CD133 ekspression i 7 cellelinier. 500 usorteret, markør

+ og markør

– celler, henholdsvis blev dyrket i ikke-klæbende og serum-fri betingelser med EGF, bFGF og insulin tillæg for 21 dage. Procentdelen af ​​SB dannelsen af ​​hver cellelinje blev talt ved tilfældig felt markering på dag 21 og resultaterne blev afbildet som histogrammer (Supplerende figur S1). Usorterede celler fra alle 7 cellelinier var i stand til at danne SB. SB blev også dannet af CD44

+ subpopulationer af 6 cellelinjer i hvilke CD44 blev udtrykt, men ikke fra CD44

– subpopulationer. Desuden HKULC2, H1299 og H1650, der indeholdt lavere initiale andele af CD44

+ -celler gav anledning til signifikant mere SB sammenlignet med usorterede celler (* p 0,05, ** p 0,01). For HCC1833, CD133

+ men ikke CD133

– celler dannede SB. Stigningen i SB numre fra CD133

+ sammenlignet med usorterede celler var ikke statistisk signifikant. Efter 21 dage, blev alle SB fra H1299 CD44

+ -celler dissocieres til enkeltceller og re-suspenderet i kulturmedier. Op til tre serielle passager blev etableret, hvilket indikerer

in vitro

selv-fornyelse af CD44

+ celler. Flowcytometri analyse af den første generation SB celler fra H1299 viste 81,58% af CD44

+ celler, som lignede den 81,3% af stamcellerne, demonstrerer, at

in vitro

tumorigenecity fra CD44

+ celler resulterede i et afkom med samme profil af CD44-ekspression (fig. 2B). Clonogenicity assay i blød agar viste også, at frisk isoleret H1299 CD44

+ celler dannede signifikant flere kolonier end CD44

– celler i 3 uger (** p 0,01), understøtter forbedret selvfornyelse kapacitet CD44-udvalgte celler (fig. 2C).

In vivo

tumor-initierende egenskaber CD44

+ celler og sekventiel stigning på transplantation effektivitet i nøgne mus

evne markør-udvalgte celler at initiere

in vivo

tumor blev undersøgt ved subkutan transplantation i nøgne mus. For H1299, HKULC4, H1650 og HCC827, så få som 10.000 CD44

+ -celler var i stand til at initiere tumorer i 30-68 dage (tabel 2), men ingen tumor blev dannet af det samme antal af usorteret eller CD44

– celler efter 90 dage. For usorterede celler af H1299, kunne tumorinitiering opnås ved 200.000 celler (3/4 mus), medens med CD44 + celler blev tumorer initieret med 10.000 (1/4 mus), 50.000 (3/4 mus) og 100.000 celler (4 /4 mus). For CD44

– celler blev der ikke tumor dannet selv bruger 200.000 celler (0/4 mus) (fig 3A-repræsentant tumorer, tabel 2.). Vi har dissekeret musene og undersøgt alle organer og fandt ingen metastatisk tumordannelse fra de sorterede eller usorterede celler under den observerede periode. For HKULC2 og H23, selvom blev observeret SB dannelse, blev der ikke xenograft tumor dannet ved hjælp af 200.000 usorteret, CD44

+ eller CD44

– celler. Ligeledes 200.000 usorteret, CD133

+ eller CD133

-. HCC1833 celler ikke danne tumorer

A. Repræsentative billeder af primær xenotransplantattumorer. Tumorinitiering blev opnået ved 200.000 usorterede celler (3/4 mus). Fra CD44

+ -celler blev tumorer initieret med 10.000 (1/4 mus), 50.000 (3/4 mus) og 100.000 celler (4/4 mus). Ingen tumor blev dannet med 200.000 CD44

– celler (0/4 mus). PBS, saltvand injektion kontrol. B. Flow cytometri analyse af disaggregerede primære og sekundære xenografter viste lignende CD44

+ til CD44

– undergruppe nøgletal som forældrenes H1299 celler. X-akse: CD44 ekspression, FITC-kanal; Y-akse: Døde celler farvet af PI, PE-kanal. C. Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse af primære xenografter viste udtryk for CD44 standardformular (CD44s) og pluripotens gener (

POU5F1

,

NANOG

,

SOX2

) i CD44

+ men ikke CD44

– undergrupper. D. IHC analyser af xenotransplantater fra sekventielle generationer af modtagende mus viste CD44-ekspression i cellemembranen distribution. Værtsceller af museoprindelse stede i tumoren stroma blev ikke farves. Tumorvækstkurver af primære, blev sekundære og tertiære xenotransplantattumorer dannet af usorterede og CD44-sorterede H1299 celler afbildet ved at observere og måle tumordannelse ugen i op til 9 uger blev afterwhich mus scarified at undgå overvækst af tumorer.

de næste eksperimenter testede, om tumor initiering kapacitet kunne opformeres

in vivo

. Da H1299 CD44 + viste den korteste ventetid tumordannelsesmekanisme (tabel 2), vi dissocieret H1299 primær tumor at demonstrere

in vivo

seriel tranplantability. Kun levedygtige tumorceller fra disaggregerede H1299 xenotransplantater blev udvalgt til seriel tumor transplantation i sekundær, og efterfølgende, tertiære modtagende mus. Tumorer blev dannet fra CD44

+ men ikke CD44

– celler (tabel 3). Især selvom andelene af levende CD44

+ -celler (47,73% til primære, 0,91% for sekundær) (Fig 3B) blev reduceret på seriel transplantation, effektiviteten af ​​tumorinitiering steg i successive generationer af tumor. Den latenstid tumordannelsesmekanisme fra 5000 CD44

+ celler gradvist forkortet fra 30 dage efter første generation, til 21 dage efter anden og 14 dage den tertiære generation, hhv. Antallet af celler, der er nødvendige for at iværksætte tertiære tumorer også faldet til 1.000 CD44

+ celler.

For at analysere differentiering kapacitet CD44

+ celler, de høstede tumorer var opdelt og udsat for flowcytometrianalyse. CD44

+ :CD44

– forholdet mellem den primære tumor var 80.72:17.0, og den afledte tumor var 85.4:12.53. Disse var i samme størrelsesorden som de parentale celler (81.3: 18,7), viser lignende CD44 udtryk hierarki af sekventielle generationer af xenografter (fig. 3B). Yderligere analyse af den primære tumor ved RT-PCR afslørede udtryk for pluripotens markører

POU5F1

,

NANOG

SOX2

i CD44

+ men ikke CD44

-. subpopulationer (. figur 3C)

fig. 3D viser repræsentative IHC farvning for CD44 og tumor vækstkurver de primære og serielt transplanterede xenotransplantater. Som det fremgår af kurven tumor vækst, de primære og serielt transplanterede tumorer initieret fra 50.000 CD44

+ celler voksede hurtigere end 200.000 usorterede celler.

CD44

+ celler udtrykte pluripotens og Epithelial-Mesenchymale-Transition (EMT) markører og besad differentiering potentialer

udtryk for pluripotens gener og erhvervelse af mesenkymale træk har vist sig at indikere en stamcelle-fænotype. Vi demonstrerede co-ekspression af de embryonale proteiner OCT4, NANOG og SOX2 ved IF undersøgelser af SB fra CD44

+ H1299 celler. Semikvantitative RT-PCR blev også udført på frisk sorteret CD44

+ og CD44

– H1299 celler. Angivelse af

OCT4

,

NANOG

,

SOX2

og mesenkymale markører

SNAI1

,

CDH2

og

VIM

blev vist i CD44

+ celler, men var lavere eller ikke påvises i CD44

– celler. Da forskellen udtryk for standarden (

s

) og variant former (

v3

,

v5

,

v6

og

v10

) af CD44 er blevet påvist i stam- eller differentierede celler, undersøgte vi mønsteret for

CD44

mRNA splejsning ved RT-PCR. Både standard- og variant former blev fundet i CD44

+ men ikke CD44

– celler, hvilket tyder på fastholdelse af

CD44

mRNA differential splejsning potentialer i CD44

+ i forhold til CD44

– delpopulation (. figur 4A B).

A. Immunofluorescens karakterisering af SB fra CD44

+ delpopulation, viser co-ekspression af OCT4, NANOG og SOX2. DAPI, kontrol; Green, OCT4-FITC; Rød, SOX2-Texas Red; Blå, pseudofarve af NANOG af PE-konjugeret antistof. B. Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse viste pluripotens gener,

SNAI1

,

CDH2

,

VIM

,

CD44s

og

CD44 v3 , 5,6,10

udtryk i CD44

+ celler. CD44

– H1299 celler mangler disse udtryk undtagen

CDH2

og

VIM

. C. CD44

+ -celler var mere resistente over for de apoptotiske virkninger af 5 uM cisplatin sammenlignet med CD44

– i H1299 og H1650 celler efter 24 timers inkubation. Histogrammer repræsenterede gennemsnit på tre individuelle eksperimenter usorteret, CD44 + og CD44- celler før og efter cisplatin behandling.

CD44

+ celler cisplatin-resistente

Frisk sorteres CD44

+, CD44

– og usorterede celler af H1299 og H1650 blev dyrket i serumfrit RPMI-medium og underkastet 5 pM cisplatin behandling i 24 timer. Histogrammet i fig. 4C repræsenterede gennemsnittet af tre individuelle eksperimenter for begge cellelinier. Apoptotiske og ikke-levedygtige celler blev målt ved Annexin V og PI-farvning ved anvendelse af flowcytometri, hhv. For H1299, cisplatin-behandling af usorteret eller CD44

+ -celler resulterede ikke i nogen signifikant stigning af apoptotiske celler sammenlignet med deres ubehandlede kontrol, hvilket indikerer relative cisplatin modstand. CD44

– celler viste en betydelig stigning i apoptose (*** p 0,001) efter behandling indikerer cisplatin følsomhed. Ved sammenligning mellem grupperne, CD44

– viste celler betydelige stigninger (### p 0,001) af apoptose i forhold til både usorterede og CD44

+ celler, hvilket indikerer, at CD44

– celler var de mest cisplatin følsomme af de 3 grupper. Sammenlignelige resultater blev også observeret for H1650, hvilket indikerer relative cisplatin modstand af usorteret og CD44

+ -celler. Endvidere resistente H1299 celler, der stabilt udvalgt af langvarig cisplatin behandling viste en højere basal procentdel (96,2%) af CD44

+ -celler sammenlignet med de parentale celler (82%). Ligeledes for H1650, basal CD44

+ procentdel steg fra 61,5% til 92,9%. Resultaterne viste modstand og en overlevelse fordel af CD44

+ celler under kronisk cisplatin behandling (Supplerende figur S2).

immunhistokemisk analyse af kræft stamceller markører i NSCLC prøver

For at vurdere

in vivo

protein ekspression af CD44-ekspression, blev IHC udført på grupperede tumor kerner af 141 primære lungecarcinomer og reaktive eller føtale lungevæv. I kontrol væv, blev cellemembran udtryk for CD44 observeret i basale celler i luftvejene eller metaplastisk skællede bronkieepitel, og regenererende kubisk pneumocytter af sårede lunge. Ingen ekspression blev observeret i terminalt differentierede epitelceller såsom cilierede eller ikke-cilierede søjleformede celler i bronkieepitel eller type I flade pneumocytter foring alveolære rum. I første trimester human føtal lunge blev CD44 udtrykt i epitelet af primitive luftveje (fig. 5A). I lungekræft, udtryk var til stede i alveolære makrofager og små lymfocytter, der tjente som interne positive kontroller. Helt viste CD44 udtryk 62/141 (50,4%) tilfælde. SCC var signifikant associeret med moderat til stærk ekspression (21/27, 77,8%) sammenlignet med AD (41/96, 42,7%) (p = 0,002) (fig 5B). I SCC viser moderat til godt differentiering, blev CD44 udtrykt meget stærkere i den basale forhold til modning tumorceller (Fig. 5B), i overensstemmelse med de forventede stamcelle nicher. Når kun AD blev betragtet viste CD44-ekspression en svag sammenhæng med ikke-rygere (p = 0,024). For AD viste Log Rank test, at patienter med negativ eller svag CD44-ekspression havde en betydeligt værre samlet (p = 0,015), men ikke progressionsfri overlevelse. For SCC, observeredes ingen signifikant relation for at overleve med det niveau af CD44-ekspression. Ingen sammenhæng med andre klinisk-patologiske parametre, herunder patientens alder, køn, tumor kvalitet, størrelse, scene, lymfeknude status eller patologisk stadium blev observeret (Supplerende tabel S2). CD133 ekspressionen blev detekteret kun i spredte små celler i stromaet af føtale og reaktive voksen lungevæv. Den basale bronchiolar epitel, regenererende pneumocytter eller tumorceller var negative. CD34 blev påvist i endotel og reaktive stromale celler i nogle tumorer men ikke cancerceller. For at sikre, at fraværet af farvningen ikke skyldtes regional variation af cellulære fordeling, blev resultaterne valideres ved at gentage IHC analyse på fuld sektioner af kræft i selektive sager.

A. CD44-ekspression i pseudoglandular fase af embryonale lunge (til venstre) og regenererende pneumocytter af lunge med diffus alveolær skade (til højre). Indsat viser CD44

+ basale celler i normal bronkieepitel. B. Repræsentative tilfælde af adenokarcinomer (AD), der viser moderat (til venstre) og stærk (højre) CD44-ekspression i cellemembranen distribution. I nogle tilfælde af pladecellecarcinomer (SCC), CD44-ekspression var særlig fremtrædende i tumorceller i periferien (pil) end de centrale områder (asterisker) af tumor øer som generelt anses som stamcellelinjer sites. Spredte små lymfocytter og marcophages viste også CD44-ekspression i tumoren stroma. C. Kaplain Meier overlevelsesanalyse af patienter med AD (øverste panel) og SCC (nederste panel) stratificeret efter CD44

+ (tumorer med moderat /stærkt udtryk) eller CD44

– (fraværende /svag, fokal farvning) . PFS, progressionsfri overlevelse i måneder; OS, ovrall overlevelse i måneder.

Diskussion

hypotese om, at kræft vedligeholdes af en subpopulation af stamceller eller progenitor-lignende celler, mens ikke-stamceller /progenitorceller har en begrænset levetid span rejser muligheden for, at målrette specifikke komponenter af de regulatoriske veje for kræft stamceller vedligeholdelse kunne give et middel til cancer kontrol. Som et indledende skridt til at undersøge, om denne hypotese er gældende for lungecarcinomer, er det nødvendigt at identificere og isolere kræft initierende celler med egnede markører. Mens den optimale tilgang til dette formål stadig at blive undersøgt, flowcytometrisk analyse og sortering af markør-positive celler er i øjeblikket den mest anvendte metode [24]. Blandt de overflademarkører undersøgt, har vi vist, at CD44

+ celler er beriget for tumor formerings- kapacitet og CD44 er en potentiel CSC markør for NSCLC cellelinier. I en nylig undersøgelse om metastatiske lungekræft i malignt pleura effusion blev CD44 også rapporteret som en mulig stamcelle markør men karakteriseringen af ​​stamcelle-lignende egenskaber var baseret på

in vitro

molekylær analyse og cellulære kun ekspansion [ ,,,0],16]. I vores undersøgelse,

in vitro

in vivo

tumorigenecity af CD44

+ celler blev vist. Endvidere viste vores xenograft eksperimenter en progressiv forøgelse af transplantation effektivitet i successive tumor generationer med afkortning af latensperiode og nedsat minimal cellulær dosis af indpodning. Et stigende kapacitet tumordannelse blev også rapporteret af Du et al. der undersøgte CD44

+ subpopulationer af tyktarmskræft celler [25]. Breast epitelceller induceret til at undergå EMT blev vist at erhverve stamcelle-lignende og tumorigene tegn [26]. I vores undersøgelse blev CD44

+ celler også forbundet med udtryk af markører implicerer EMT såsom

SNAI1

,

CDH2

og

VIM

. Kun CD44

+ celler udtrykte pluripotens gener

POU5F1

,

NANOG

SOX2

[10], [27], [28], [29], mens disse markører blev tabt i CD44

– celler, hvilket tyder på, at EMT kan være involveret i at opretholde stemness. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at belyse den underliggende mekanisme og interaktion mellem disse transskription komplekse proteiner og CD44-ekspression.

I dyrkede H1299 og H1650 celler, CD44

+ celler vist lavere basal apoptotisk niveau og relativ modstand mod cisplatin behandling i forhold til CD44

– celler. Dette indikerer deres modstandsdygtighed mod kemotoksicitet og evne til at opretholde vævshomeostase, funktioner menes at være forbundet med vævet stamcelle-fænotype. På den anden side, når CD44

+ -celler blev transplanteret fra

in vitro

til

in vivo

miljø udløsning mærket celletab gennem apoptose, en 100 gange reduktion af tumorceller var i stand at indlede tumorer i et hurtigere tempo i sekventielle mus generationer, hvilket viser robustheden af ​​stamcelle-lignende delpopulation indeholdt i de markerede celler. Dette kunne også indikere, at kun en del af CD44

+ -celler var nødvendige for tumorinitiering, og at den stigende tumorigenecity af CD44

+ -celler skyldtes

in vivo

berigelse af CSC. Yderligere markør undersøgelser og udvælgelseskriterier raffineret er nødvendige for mere specifikke

in vitro

CSC isolation.

CD133 er den mest almindeligt rapporterede markør og har været brugt til at isolere CSC fra friske lungekræft [13] , [15], men i vores undersøgelse, viste de fleste cancercellelinier ingen signifikant CD133 ekspression ved enten semi-kvantitativ RT-PCR (data ikke vist), IHC, immunoblotting (fig. 2A) eller flowcytometri analyse (tabel 1). Under anvendelse af samme anti-CD133-antistof, Chen et al. kun observeret 0,7% CD133 ekspression i H1299, mens ingen ekspression blev fundet i vores undersøgelse [11]. Blandt vores studeret cellelinjer, kun HCC1833 viste SB formation på CD133-udvælgelse, men

in vivo

tumorigenecity kunne ikke påvises. Anvendelse af andre mus arter, som er immunologisk mere tolerante over for xenografter kan afsløre forskellige resultater. Ingen data om HCC1833 er tilgængelige i litteraturen til sammenligning. Stuelten et al fandt også sjældne CD133 ekspression i NCI60 cancercellen panel [30]. CD44-ekspression blev observeret, men i to cellelinjer, deres resultater afveg fra vores. Vi observerede 0% og 95,9% af CD44 i A549 og H23, men 84,41% og 30,95%, henholdsvis blev opdaget af efterforskere [30]. Vi kan ikke forklare forskellene, men data fra andre kræftformer også rapporteret afvigende observationer. For eksempel er en undersøgelse rapporteret 38-72% af CD133 + celler i æggestokkene cancercellelinie SKOV3 mens andelen fundet af Stuelten et al var kun 0,78%. Forskellige markør procenter er også fundet i colon og lever kræftceller [30], [31], [32]. Den manglende sammenhæng i CSC markør profil udtryk blandt forskellige undersøgelser kunne relateres til individuelle kræft variation, men de kunne også skyldes forskellige potens stater, sammensætning eller funktionelle egenskaber af kræft stamceller eller progenitorpopulationer. I mangel af en specifik markør, den sande procentdel af CSC i en tumor, især at der i veletablerede cancer cellelinjer, er kontroversiel [24]. Variationen i miljø- og selektive pres opleves af kræftceller

in vitro

in vivo

kan udløse eller undertrykke forskellige veje for de molekylære netværk, der regulerer CSC-funktioner, og det er ikke klart, om CSC markør profil kunne variere med omstændighederne. Mens vi har vist, at CD44

– celler er ude af stand til tumor fortsættelse, er klart behov for mere raffinerede metoder til CSC udvælgelse og karakterisering. Det ville være umagen værd at undersøge, om CD44 kunne kombineres med andre potentielle CSC markører såsom ALDH, CXCR4, ABCG2, side befolkning markør, ESA, osv, for at forbedre effektiviteten og specificiteten af ​​CSC valg [13], [21], [22], [33].

CD44 er et membranbundet glycoprotein der medierer en kompleks række funktioner. Nylige undersøgelser har ydet støtte til sin rolle som CSC markør. For eksempel den klonale ekspansion og xenograft indledning kapacitet CD44

+ – kunne vælges kolorektal cancer CSC inhiberes af CD44 knockdown [25]. Homozygot CD44 sletning intestinal crypt celleoverlevelse og svækket tumorigenecity uden at påvirke proliferation i en primær mus coloncarcinom model [34]. Mekanistisk kan invasiv og metastatisk vækst medieres gennem interaktion mellem celleoverfladen CD44 med ekstracellulære matrixkomponenter, såsom hyaluronan med efterfølgende ændringer induceret i cytoskeletale maskiner af cancerceller [35]. CD44 udtrykt på overfladen af ​​coloncancerceller har vist sig at lette binding til endotel P- eller L-selectin og øge tumor adgang til hæmatogen spredning [36]. CD44 er også i netværk til mange signalleringskaskader der medierer tumor-fremmende funktioner. Det fungerer som en co-receptor med tilstødende EGFR eller andre ErbB familien receptorer tyrosinkinaser [37], og kan aktivere celleproliferation pathways indirekte gennem ligand præsentation såsom spredningsfaktor til dets receptor c-MET [38]. Tumor celle overlevelse kunne også styrkes gennem aktivering af anti-apoptotiske veje såsom PI3K /AKT kaskade [39], [40] og Bcl2 og Bd-XL transkriptionsfaktorer [41]. En rapport om småcellet lungekræft viste, at aktivering af CD44-MAPK-PI3K signalering førte til forøget ekspression af uPA /uPAR og MDR1, hvilket resulterer i forbedrede invasive og multiresistente kræft fænotyper [42]. Det er blevet foreslået, at variantformer af CD44, især CD44v6 som udtrykkes forbigående under embryonisk lunge udvikling, medierer tumorcellemigration og invasion og kan være tilstrækkeligt for en CSC markør [43]. Især i vores CD44

+ – afledt SB og xenografter, mRNA af både standard og varierende former af CD44 blev udtrykt

immunhistokemisk analyse ved hjælp af et monoklonalt antistof mod standard form af CD44 viste, at i ikke. -cancer lunge, er CD44 ikke udtrykkes i terminalt differentierede lunge epitel, men er opreguleret i lokaliteter generelt betragtes som reserve eller stamcelletransplantation nicher og regenerere alveolære foring celler sårede lunger.