PLoS ONE: Prohibitins er nødvendige for Cancer Cell Proliferation og Adhesion

Abstrakt

prohibitin 1 (PHB1) er et stærkt konserveret protein, der sammen med sin homolog prohibitin 2 (PHB2), hovedsagelig lokaliserer til den indre mitokondrielle membran. Selv om det oprindeligt blev identificeret ved dets evne til at inhibere G1 /S progression i humane fibroblaster, er dets rolle som tumorsuppressor drøftet. For at bestemme funktionen af ​​prohibitins i opretholdelsen cellehomeostase, genereret vi cancercellelinier udtrykker prohibitin-directed shRNAs. Vi viser, at prohibitin proteiner er nødvendige for proliferationen af ​​cancerceller. Nedregulering af prohibitin udtryk drastisk reduceret antallet af celledeling. Endvidere blev mitokondrie morfologi ikke påvirket, men tab af prohibitins førte til nedbrydning af fusionsproteinet OPA1 og i visse cancercellelinier, til en reduceret evne til at udvise forankringsuafhængig vækst. Disse cancerceller udviste også reducerede adhæsion til den ekstracellulære matrix. Tilsammen disse observationer tyder prohibitins spiller en afgørende rolle i vedhæftning processer i cellen og derved opretholde kræft celle formering og overlevelse

Henvisning:. Sievers C, Billig G, Gottschalk K, Rudel T (2010) Prohibitins Er Nødvendig for Cancer Cell Proliferation og vedhæftning. PLoS ONE 5 (9): e12735. doi: 10,1371 /journal.pone.0012735

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: 15 juli, 2010; Accepteret: August 6, 2010; Udgivet: 14 September, 2010

Copyright: © 2010 Sievers et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af ved at finansiere under det sjette rammeprogram for forskning i EU, Projekt RIGHT (LSHB-CT-2004 til 005.276) til TR. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prohibitins (PHB1 og PHB2) er meget homologe proteiner, som er konserveret gennem hele udviklingen og ubikvitært [1] – [3]. Prohibitins hovedsagelig lokalisere til mitokondrierne, men findes også i kernen og i lipidklumper i den cytoplasmatiske membran [1], [4] – [7]. Lokalisering til lipidklumper er også en funktion af andre medlemmer af stomatin /prohibitin /flotilin /HflK /C-domæne (finsnitter) familie af proteiner [8].

Undersøgelser til dato har tilknyttet PHB1 med forskellige roller i opretholdelsen af ​​cellulær homeostase. Indledende arbejde foreslog det fungerer som en inhibitor af DNA-syntese, en rolle, som senere fik sin 3’UTR [9], [10]. En T-allelisk ekspression form af PHB1 var forbundet med en øget risiko for brystcancer [11]; men denne forening blev ikke bekræftet i et klinisk miljø [12], [13]. PHB1 co-lokaliseres med transkriptionsfaktorer af E2F-familien i kernen af ​​brystkarcinomceller [14], og samvirker med Rb tumorsuppressorproteinet pRB i kernen medfører inhibering af cellecyklussen [15]. Tilsvarende blev siRNA-medieret inaktivering af PHB1 ekspression sig at stige brystcancercelleproliferation [16]. På trods af disse tegn på en tumor suppressor aktivitet, de seneste undersøgelser har også vist reduceret celledeling ved tab af PHB1 udtryk i muse embryonale fibroblaster og andre primære celler; . Og redningen af ​​celleproliferation ved overekspression af mitokondrie-målrettet PHB2 [17]

Vores seneste arbejde indikerer PHB1 også spiller en rolle i celle migration: Forbigående lyddæmpning af PHB1 af siRNA-medieret knockdown førte til en sammenklumpning fænotype i HeLa-celler, der kan sammenlignes med en Her2 /ErbB2 eller Rac defekt, viste nemlig klumpet celler markant membran farvning for pan-cadherin og β-catenin. Forfatterne foreslog kontakt mellem Cellerne blev sprængt i tumorceller på grund af tabet af PHB1 [6]. Studier i gær har konsekvent vist, at PHB1 og PHB2 fungere som mitokondrielle chaperones i den indre mitokondrielle membran [3], [18] – [20]. PHB1 og PHB2 er indbyrdes afhængige på proteinniveauet og tab af en samtidig fører til tab af den anden [21]. De interagerer med mitokondrie proteaser, især mAAA, som er nødvendig i samlingen af ​​respiratoriske kæde komplekser [22], [23]. En knock-out af prohibitins i gær førte til en reduceret replikativ levetid og en defekt i mitokondrie-membran potentiale [18], [24]. Adskillige nyere undersøgelser har også rettet mitokondriefunktionen af ​​prohibitins i humane cellelinier: Overekspression af PHB1 viste sig at beskytte mod oxidativt stress [25]; derudover siRNA-medieret knockdown af PHB2 førte til nedbrydning af det mitokondrielle fusionsprotein OPA1 [17] og fragmentering af det mitokondrielle netværk [21]. Det er dog stadig uklart, om prohibitin ekspression stabiliserer potentiale mitochondriemembran (MMP) [17], [26], [27].

Her viser vi prohibitins spiller en rolle i bevarelsen cellulær homøostase og proliferation i cancerceller og primære celler. Udtømning af prohibitins haft nogen større effekt på mitokondriefunktionen men gjorde påvirke vedhæftningen af ​​celler til den ekstracellulære matrix.

Materialer og metoder

Celledyrkning

HEK293 og HeLa-celler blev opnået fra tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ). HT1080wt, Jurkat og Capani celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). IF6 celler en gave fra U. Rapp, Würzburg. HeLa-celler blev testet og bekræftet af DSMZ via STR-fingeraftryk. HEK293-celler og HT1080wt celler blev dyrket i DMEM med 10% FCS, 1% Penicillin /Streptomycin, 10 mM HEPES pH 7,4 og 4 mM L-Glutamin. HeLa-celler, IF6 celler og Jurkat-celler blev dyrket i RPMI med 10% FCS, 1% penicillin /streptomycin. HT29-celler blev dyrket i McCoys medium, suppleret med 10% FCS og 1% penicillin /streptomycin. Capan I celler blev dyrket i RPMI med 20% FCS og 1% penicillin /streptomycin. Alle celler blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO2.

Generation of shRNA knockdown cellelinier

shRNA-udtrykkende vektorer blev konstrueret ved kloning forskellige shRNAs i pLL3.7 eller pLVTHM vektor. For at generere et inducerbart vektorsystem, blev shRNAs fra den konstitutive ekspressionssystem pLVTHM subklonet i inducerbare vektorsystem pLVPT, ved at overføre kassetten indeholdende shRNA og H1-promotoren via Xhol /Xbal restriktionssites. Alle konstruktioner blev verificeret ved sekventering. Nukleotidsekvenser af shRNA mål anvendes, er som følger: shLuci, 5′-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ‘; PHB1-0, 5’GCGGAGAGAGCCAGATTTG-3 ‘; PHB1-3, 5’-GACACATCTGACCTTCGGGAA-3 ‘; og PHB2-0, 5’-GACAGAGAGGGCCAAGGAC-3 ‘. Stabilt transducerede, konstitutive eller inducerbare Knockdown cellelinier blev konstrueret som tidligere beskrevet [28]; se også https://tronolab.epfl.ch/). Kort fortalt blev HeLa-celler transduceret med den respektive lentiviral vector i nærvær af Polybrene (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). For transduktionen af ​​pLVPT lentivirusvektorer blev shRNA ekspression induceret ved behandling med 1 ug /ml doxycyclin (Sigma) i 3 dage og celler blev sorteret til eGFP ekspression med MoFlo® flowcytometer (Dako Danmark A /S, Glostrup, Danmark) . For validering af de Knockdown niveauer, blev RNA isoleret ved hjælp af RNAeasy Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Kvantitativ realtids-PCR blev udført med QuantiTect SYBR Green real-time PCR-kittet (Qiagen) ifølge producentens protokol. Alle vektorer blev opnået fra D. Trono, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Frankrig.

Soft agar assay

Celler (2 × 10

3) blev podet i 0,3% lav smeltetemperatur agarose (Sigma) i DMEM suppleret med 10% FCS, og kolonier blev talt efter 2-4 ugers inkubation ved 37 ° C og 5% CO

2.

Celleproliferation og cellecyklusanalyse

i CFSE-farvning, celler blev høstet og vasket to gange i PBS, derefter farvet med 5 uM CFSE i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Resterende CFSE fjernedes ved vask to gange med PBS, og celler blev podet i plader med 6 brønde og dyrket i celledyrkningsmediet. The CFSE Fluorescensintensiteten blev målt ved FACS-analyse hver 24. time i 5 dage. BrdU-assays blev udført ved anvendelse af

Cell Proliferation ELISA, BrdU (kemiluminescerende)

kit (Roche) ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev celler podet ved 3,5 x 10

3 i en hvid kantede plade med 96 brønde. BrdU blev tilsat til en slutkoncentration på 10 uM i 1 time. Peroxidasekonjugeret anti-BrdU-antistof blev tilsat til cellerne i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur og luminescens blev målt efter en inkubation på 3 til 10 minutter under anvendelse af en Monolight 3096 mikroplade-luminometer (BD Bioscience).

TMRE farvning

at analysere mitrokondriemembranen, 100 nM TMRE blev tilsat til dyrkningsmedium og celler blev yderligere inkuberet i 30 minutter under normale dyrkningsbetingelser. Inkorporering blev målt ved FACS. For at kontrollere for fuldstændigt tab af membranpotentiale, blev 1 pM CCCP tilføjet i 5 min.

ATP niveauer

Cellulær ATP-syntese blev målt ved hjælp af en ATP

bioluminscensassayet Kit HSII

(Roche) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt 10

5 til 10

7 celler /25 pi per brønd af en 96 brønds plade blev lyseret i det samme volumen cellelysereagens ved inkubation i 5 minutter ved stuetemperatur. Halvtreds mikroliter af det rekonstituerede luciferase-reagens blev tilsat til brønden ved automatiseret injektion (BD Bioscience, Monolight luminometer). Målinger (varighed på 2 sekunder) blev udtaget efter en 1 sekunds forsinkelse.

Western blotting

Celler blev lyseret i 2 x prøvebuffer indeholdende 200 mM DTT og proteiner blev separeret ved anvendelse af 10% SDS- SIDE. Efter elektroforese blev proteinerne elektrooverført på en polyvinylidenfluorid mikroporøs membran og immunodetekteret anvendelse af antistoffer mod OPA1 (BD Biosciences), PHB1 og PHB2 (NeoMarkers) og Actin (Sigma). OPA1 fragmentering blev kvantificeret under anvendelse af AIDA software.

Immunfluorescensfarvning

celler dyrket på dækglas blev fikseret med 4% paraformadehyde i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter permeabiliseret i 0,5% Triton X-100. Derefter blev cellerne immunfarvet under anvendelse af de følgende antistoffer: muse-anti-Tom20 (BD Biosciences) (1:100 fortynding, 2 h stuetemperatur), muse-anti-paxillin-1 (BD Transduktion) (1:100), phalloidin-Alexa 488 ( MoBiTec) (1:200) og æsel-anti-muse, Cy ™ 3 (1:100). Kvantificering af det mitokondrielle netværket blev gjort ved hjælp ImageJ software.

Transmission elektronmikroskopi

Celler forarmet af prohibitins ved at inducere shRNA udtrykket for 10 dage blev fikseret med 2,5% glutaraldehyd, efterfikseret med 0,5% osmiumtetroxid og kontrast under anvendelse garvesyre og uranylacetat. Prøver blev dehydreret i en gradueret ethanol serie og indlejret i Polybed. Ultratynde snit blev analyseret i en Leo 906E transmissionselektronmikroskop (Leo GmbH).

Adhæsion assay

For at måle adhæsion af celler, mikroplader blev overtrukket med 1 mg /ml fibronectin, 2 mg /ml collagen eller 3 mg /ml BSA, hhv. GFP-ekspression var under følsomhed fluorometer (ved 488 nm), derfor vi farvede celler med CFSE før podning. Celler blev inkuberet på overtrukne brønde i 30 minutter ved 37 ° C.

At analysere cellulær migration og adhæsion, celler induceret med doxycyclin i 8 dage blev podet under subkonfluente betingelser, i cellekultur plader eller dækglas, i 20 timer efterfulgt af 4 timer serumudsultning. Cellerne blev behandlet med 50 pM forskolin i 20 min for at inducere cAMP /PKA-aktivering og dermed lamellipodia og fokal adhæsionsdannelse. Actinfilamenter og fokale sammenvoksninger blev visualiseret via immunocytokemi og fokale sammenvoksninger blev talt manuelt.

Resultater

Selektiv tab af PHB1 udtømte celler

Til dato ingen konsensus på funktionen af ​​PHB1 er nået; i brystcancerceller, er PHB1 blevet rapporteret at virke som en tumorsuppressor [15], [16], hvorimod nedbrydningen af ​​PHB1 i primære endotelceller resulterede i reduceret celleproliferation [26]. For at definere den rolle, PHB1 i HeLa-celler, en adenocarcinom cellelinje, genereret vi stabile cellelinjer, der udtrykker PHB1-rettet shRNAs hjælp af konstitutive pLL3.7 lentiviral shRNA ekspressionssystem [29]. Ekspression af tre forskellige shRNAs, shPHB1-2, shPHB1-3 og shPHB1-0, målrettet den kodende region af PHB1 inducerede udtømningen af ​​PHB1 ved RNA-interferens (RNAi) på mRNA (fig. 1A) og protein (fig. 1B) niveau. Udtømningen af ​​PHB1 korreleret med den samtidige ekspression af markørproteinet eGFP (fig. 1C), hvilket indikerer den vellykkede lentiviral transduktion af disse celler. Vi voksede derefter de forskellige cellelinier og overvåges sammensætningen af ​​cellepopulationen under anvendelse mikroskopi og FACS-analyse. En selektiv reduktion af shPHB-udtrykkende celler fra cellen pulje blev observeret, synlig ved en reduktion i EGFP-positive cellepopulation (fig. 1D). Dette tab skyldtes ikke øget apoptose af de shRNA-udtrykkende celler (data ikke vist), men hurtigere vækst af ikke-transducerede, PHB1 protein-udtrykkende celler, og derfor eGFP-negative celler, som viste normal proliferation.

(A, B) PHB1 mRNA og protein niveauer blev effektivt reduceret i celler, der udtrykker shPHB1-0, shPHB1-2 og shPHB1-3 hjælp den konstitutive lentivirale ekspressionssystem pLL3.7 som blev vist ved QRT-PCR og Western blots hhv. (C) Ved lentiviral transduktion stabil integration er angivet med GFP-ekspression. (D) med ekspressionen af ​​positivt validerede shRNAs målrettet PHB1 mRNA den del af GFP-udtrykkende celler blev reduceret inden for ti dage transduktion fra en pulje af transducerede celler inden for, som vist ved FACS-analyse. (E) transducerede HeLa-celler, der udtrykker styrevektor eller PHB1 målretning shRNAs blev podet i blød agar. Kun kontrol celler voksede under forankringsuafhængige forhold og dannede kolonier.

For at teste, om denne observation var specifik for HeLa-celler, en række forskellige cancer cellelinjer, herunder Capan1 celler, HT1080wt, Jurkat T-celler , IF6 og HT29-celler, blev transduceret med samme lentivirale shRNA konstruktion og deres vækst overvåges som før. Western blot-analyse afslørede ekspression af shPHB1-0 resulterede i nedbrydning af PHB1 i alle testede cellelinier (fig. S1A). Desuden ligner HeLa-celler, langvarig dyrkning resulterede i et tab af eGFP-positive celler (Fig. S1B), udelukker en cellelinje-specifikke virkning. Interessant nok blev en lignende fænomen observeret i prolifererende primære humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC) efter transduktion shPHB1-0 (data ikke vist), hvilket antyder, at tabet af PHB1 forstyrrer proliferation.

Siden forankringsuafhængig vækst er kendetegnende for cancerceller [30], vi vurderede også denne fænotype i vores cellelinjer konstitutivt udtrykke shRNAs målrettet PHB1. Celler blev podet i blød agar og deres vækst overvåges som før. Kontrol- og ikke-transducerede celler udviste normal vækst egenskaber, der danner kolonier og prolifererende, mens PHB1-knockdown celler forblev som enkelte celler (fig. 1E), hvilket indikerer PHB1 spiller en rolle i forankringsuafhængig vækst.

PHB1 /PHB2 er nødvendige for spredning af cancerceller

Siden betinget lyddæmpning af PHB1 udtryk ført til tab af spredning og dermed en overvækst af utransducerede celler, langvarige undersøgelser af virkningen af ​​reduceret PHB1 udtryk på det molekylære niveau ikke var mulig. Derfor udtrykte vi den samme valideret shRNAs for den funktionelle knockdown af PHB1 i en lentiviral vektor under kontrol af en doxycyclin promotor [28]. For at analysere den rolle, PHB2 og dets samspil med PHB1, vi designet en ekstra shRNA specifikt rettet PHB2 mRNA (for detaljer se materialer og metoder).

Reduktioner i PHB1 og PHB2 proteinekspression blev observeret 3 til 4 dage efter tilsætning af doxycyclin, bliver markant reduceret på 5-6 dage og derefter resterende stabilt reduceret i op til 10 dage (fig. 2A, B). Udtømning af én prohibitin protein førte til tab af den anden (fig. 2C). Denne virkning skyldtes sandsynligvis protein destabilisering som mRNA-niveauer af ikke-lyddæmpet gen forblev konstant (data ikke vist). Som tidligere observeret ved konstitutiv silencing af PHB1 (fig. 1D), inducerbar inaktivering af prohibitins førte til reduceret proliferation af celler. BrdU-inkorporering assays afslørede reduceret DNA-syntese 5 dage efter induktion af PHB1 og PHB2 depletion (Fig. 2D). For at vurdere proliferationshastighed på en enkelt-celle niveau blev celler farvet med carboxy fluorescerende succinidylester (CFSE); denne plet er jævnt fordelt i cytoplasmaet og støkiometrisk distribueret til datterceller ved celledeling. Celleproliferation blev klart faldet i PHB1- eller PHB2-depleterede celler i sammenligning med kontrolceller (fig. 2e). Desuden viste disse celler reduceret forankring uafhængighed og undlod at vokse på blød agar (fig. 2F). Således er vores data viser, at prohibitins spille en rolle i celleproliferation.

(A, B) Transduktion med pLVPT lentiviral system tillader doxycyclin inducerbar shRNA ekspression. Inden for den angivne tid for induktion PHB1 og PHB2 proteinekspression blev effektivt reduceret. (C) Den inducerbare ekspression af enten PHB1 målrettede eller PHB2 målrettet mRNA førte til en reduceret ekspression af begge proteiner, som vist ved Western blot. (D) BrdU-inkorporering analyse viser HeLa-celler, der udtrykker shPHB1-0, shPHB1-3 eller shPHB2-0 i 10 dage udviser en reduceret proliferationshastighed sammenlignet med celler, der udtrykker kontrol shRNA (shLuci). (E) CFSE intensitet som målt ved FACS ved 0 timer (1), 24 timer (2), 48 timer (3), 72 timer (4), og 96 timer (5) er højere i prohibitin knockdown celler angivelse af nedsat fortynding af CFSE til hurtigt at gentage datterceller. (F) CFSE intensitet blev målt ved FACS hver 24 timer i 5 dage og medianen af ​​hver top blev plottet mod hinanden. (G) Inducerbar ekspression af shRNAs resulterede i den samme fænotype af reduceret /tab af forankringsuafhængig vækst i PHB1 (shPHB1-0, shPHB1-3) og PHB2 (shPHB2-0) knockdown celler som observeret med den konstitutive ekspressionssystem.

Tab af prohibitins fører til fragmentering af mitokondrier

Da prohibitins er primært lokaliseret til mitochondrier [1], besluttede vi at teste, om udtømning af prohibitins påvirket integritet mitokondrier. Brug immunfluorescensmikroskopi vi observeret en klar opsplitning af mitokondrie netværk i celler, der udtrykker shPHB1-3, som steg over tid (figur 3A, B.); Ekspression af shPHB2-0 inducerede ikke en væsentlig stigning i fragmentering af mitokondrie netværk (fig. 3A, B). Desuden ekspression af shPHB1-3 resulterede i en mere effektiv knockdown af begge prohibitins.

(A, B) Mitokondrier fra prohibitin knockdown celler blev farvet med anti-Tom 20 og mitokondriel fragmentering blev kvantificeret under anvendelse ImageJ software. En udvidet induktion med doxycyclin førte til en øget fragmentering i shPHB1-3 udtrykkende celler. (C) Western blot viser, at langvarig doxycyclin-induceret shPHB1-3 udtryk førte til en stærkere prohibitin knockdown end shPHB2-0 udtryk, korrelerer med en stigende fragmentering af fusion kompetente fragmenter a og b af OPA1. (D) Kvantificering viste, at fusion kompetente former blev nedbrudt til de mindre fragmenter c og e. (E) Kvantificering af OPA1 mønsterdannelse i kontrolceller (shLuci), PHB1-udtømte celler (shPHB1-3) og celler behandlet med 60 pM CCCP i 80 min (CCCP) for at inducere tab af A ^ m. Den OPA1 mønster i CCCP-behandlede celler var forskellige fra shPHB1-3 udtrykkende celler, som fragmenterne A og B blev fuldstændig tabt, mens de mindre fragmenter d og e blev forøget. (F) TEM billeder af celler med en prohibitin knockdown induceret i 10 dage viste en mere tæt udseende mitokondrier end shLuci-udtrykkende kontrolceller, men morfologien af ​​cristae struktur blev ikke ændret.

Blandt mange andre proteiner, OPA1 spiller en stor rolle i reguleringen af ​​mitokondrie fusion [31] og cristae integritet [32]. Da tidligere publikationer har vist, at prohibitins er nødvendige for stabil ekspression af OPA1 [17], [21], vi analyserede effekten af ​​PHB1 og PHB2 udtynding på niveauerne af mitokondrie fusionsprotein OPA1. OPA1 Proteinerne udtrykkes som syv splejsningsvarianter, synlige som fem bånd (a-e) på et Western blot, tilskrives til dels fusion aktiviteten af ​​OPA1 [33]. Vi observerede nedbrydning af OPA1 i celler udtømt for prohibitins, som korrelerede med effektiviteten af ​​prohibitins udtynding. Især blev den fusion kompetente fragmenter a og b tabt, og små fragmenter c-e forøget ved PHB1 depletion i længere tidsperioder (fig. 3C, D). Interessant nok i celler, der udtrykker shPHB2-0 bands a og b forblev intakt, og kun stiger i band e blev observeret (Fig fig. 3C). Virkningen var specifik for OPA1 eftersom nedbrydning af andre mitokondrieprotein, herunder Hsp60, ATP syntase og Tims og Toms blev ikke observeret (data ikke vist). Disse resultater understøtter en selektiv aktivitet af shPHB1-3 i mitokondrie fragmentering og OPA1 nedbrydning.

Fra tidligere undersøgelser var det kendt, at spredning af MMP inducerer OPA1 nedbrydning og mitokondriel fragmentering [33]. Derfor testede vi, om mønstret for OPA1 fragmentering fremkaldt af PHB1 udtømning og MMP var ens. Celler blev behandlet med frakoblingen reagens carbonyl cyanid

m

chlorphenyl hydrazon (CCCP), og de OPA1 bånd blev detekteret ved immunoblot. OPA1 proteinmønstre var klart forskellige i celler uden MMP i forhold til dem tømt for PHB1 (fig. 3E). De fusion kompetente fragmenter af OPA1 blev nedbrudt og udtryk for fragmenter c, d og e blev øget i fravær af MMP. I prohibitin-udtømte celler blev udtryk for bandet d udtryk stærkt reduceret, mens bandet b var kun faldet lidt, hvilket tyder på, at forskellige mekanismer udgør de observerede virkninger. I en tid-retters eksperiment, observerede vi, at CCCP forårsager mitokondrier fragmentering før OPA1 nedbrydning (data ikke vist), hvilket indikerer, at OPA1 nedbrydning kan være en konsekvens af mitokondrie opsplitning i dette tilfælde.

For at teste, om tavshed af PHB1 inducerer tab af MMP farvede vi shPHB1-3 udtrykkende celler med tetramethylrhodamin ethylester perchlorat (TMRE), en celle-permeabelt farvestof, der er sekvestreret af aktive mitochondrier. TMRE farvningsintensitet var ens i kontrol- og PHB1-udtømte celler (Fig. S2a), hvilket antyder, at den mitokondriske membran forbliver intakt på trods fragmentering af mitokondrier i disse celler. I overensstemmelse ATP niveauer forblev uændret i celler forarmet af prohibitins (fig. S2B). Da OPA1 nedbrydning også har vist sig at føre til ændringer i cristae morfologi [32], undersøgte vi cristae struktur mitokondrier i celler udtømt for prohibitins vha Transmission Electron Microscopy (TEM). I PHB1-tavshed og kontrol celler, cristae struktur forblev intakt (fig. 3F), tegn på en normal mitokondrie fysiologi.

celle- til- celle kontakt hæmmes i prohibitin udtømte celler

Under vores indledende undersøgelser af prohibitin knockdown cellelinier, observerede vi, at tabet af prohibitin-udtømte celler var afhængig af densitet ved hvilket cellerne blev podet i celledyrkningsplader. Ved høje celledensiteter, blev tabet af knockdown-celler reduceret, men ikke forhindret (fig. 4A). Endvidere tab af prohibitins ekspression forårsagede en ændring i cellemorfologi i visse cancercellelinier: HeLa-celler, især når podet ved lav densitet tendens til at forblive som enkelte celler med en langstrakt morfologi, der minder om fibroblaster (figur 4B.). blev observeret en lignende fænotype når HeLa-celler blev holdt under suspension betingelser ved såning dem på agarose-dækket cellekultur retter: kun styre celler dannede kolonier, mens prohibitin-lyddæmpet celler undladt at danne celle- til-celle kontakter og kolonier (Fig 4C. ).

(a, B) Opkaldsfrakoblingstast prohibitin ekspression i 10 dage resulterede i en strakt cellemorfologi med kernen let løftet. (A) Når podet ved lav densitet prohibitin knockdown celler forblev som enkelte celler med minimal celle-celle-kontakt. (B) Ved højere frø densitet, prohibitin-knockdown celler viste stadig en langstrakt morfologi men enten dannede klynger (shPHB1-3) eller forblev overvejende som enkeltceller med reduceret kontakt celle-celle. Proliferationshastigheden af ​​prohibitin knockdown celler blev også forøget i sammenligning med celler podet ved lav til normal tæthed. (C) Forebyggelse forankring ved såning celler på agar-coatede vævskulturplader stærkt reducerede spredning sats og kolonidannelse i prohibitin knockdown celler, hvorimod kontrol celler (shLuci udtrykkende celler) dannet store celle klumper. (D) prohibitin-depleteret og kontrolceller blev behandlet med CFSE at øge fluorescensintensiteten og podet på ekstracellulære matrixproteiner collagen eller fibronectin, eller på BSA i 30 min. Ikke-adhærente celler blev vasket af og fluorescensintensiteten blev målt. Prohibitin knockdown væsentligt reduceret vedhæftning. (E) doxycyclin-inducerede celler blev podet på dækglas i 20 timer efterfulgt af serum sult i 4 timer. Efter behandling med 50 pM Forskolin i 20 min, viste lysfelt billeder lamellipodia dannelse i kontrol- celler, men ikke i prohibitin- udtømte celler. Endvidere prohibitin-udtømte celler viste nedsat dannelse af fokale adhæsioner som vist ved immunocytokemi farvning under anvendelse phalloidin og anti-paxillin antistoffer. (F) til kvantificering af fokale sammenvoksninger i kontrol og prohibitin knockdown celler, α-paxillin 1 farvede pletter blev talt i 30 celler pr tilstand.

At studere celle-matrix kontakt dannelse, celler blev podet på plader coatet med det ekstracellulære matrixproteiner fibronectin eller collagen. Adhæsion af PHB1- og PHB2-udtømte celler til disse matrixproteiner blev signifikant inhiberet (fig. 4D). For yderligere at kvantificere celle-matrix vedhæftning blev fokal adhæsionsdannelse induceret af forskolin efter serum sult. Immunfluorescensmikroskopi afslørede reduceret spredning og dannelse af actinfilamenter (fig. 4E), plus en reduktion i antallet af fokale adhæsioner (fig. 4E, F). Disse data antyder, at prohibitins også spille en rolle i celle-matrix-interaktion.

Discussion

Siden opdagelsen af ​​deres anti-proliferative aktivitet, har prohibitins været impliceret i flere cellefunktioner [10] [18], [34]. Men flere linjer af indirekte beviser, som f.eks deres overekspression i talrige cancerceller [35], viste, at prohibitins ikke fungerer som en klassisk tumor suppressor. Her viser vi prohibitins er en afgørende forudsætning for kræft celledeling og overlevelse. Vi brugte lentivirus-medieret shRNA udtryk for specifikt at reducere PHB1 og PHB2 mRNA og protein niveauer, hhv. Brug af den konstitutive ekspressionssystem pLL3.7, vi viste i alle testede cancercellelinier blev antallet af celler, der udtrykker et PHB1 mRNA målretning shRNA faldet fra inden for en pulje af transducerede og non-transducerede celler. Endvidere PHB1-udtømte celler var ude af stand til at vokse under forankringsuafhængige betingelser. Vores resultater er i overensstemmelse med to nylige undersøgelser, der påviser, at RNAi-medieret dæmpning af PHB1 eller PHB2 henholdsvis fører til reduceret spredning i primære endotelceller og mus embryonale fibroblaster [17], [26]. Disse data er i skarp kontrast til en tidligere undersøgelse, der viser en øget spredning i brystkræft melanom MCF-7 på siRNA-medieret dæmpning af PHB1 [16]. Det er muligt prohibitins spille en anden rolle i brystkræftceller i forhold til andre cancer celletyper.

Efter aftale med den indledende konstatering af, at RNA af 3’UTR af PHB1 udøver cytotoksiske virkninger på cancerceller [9] , [10], ekspressionen af ​​et T-allele PHB1 3’UTR har været forbundet med en øget modtagelighed for brystkræft [11]: dog adskillige kliniske undersøgelser har modsagt disse resultater [12], [13]. Desuden sekventering af PHB1 3’UTR af forskellige cancercellelinier, herunder MCF-7, viste en højere frekvens af samlede sekvens variation i sammenligning med primære ikke-cancerceller snarere end en fremherskende ekspression af en specifik T-allel (CS og TR, ikke publiceret). Disse resultater antyder, at prohibitins spiller en rolle i carcinogenese, men det niveau, hvor den virkning opnås, dvs. 3’UTR RNA eller protein, fortsat uklar: Silencing af enten PHB1 eller PHB2 mRNA ved RNAi resulterede i reduktion af den respektive 3 ‘ UTR men også i en knockdown af begge prohibitin proteiner. Eftersom ekspression af alle testede shRNAs førte til en langsommere proliferationshastighed, denne fænotype er sandsynligvis en konsekvens af tabet af prohibitin-proteiner.

For at vurdere den langsigtede virkning af prohibitin udtømning, genereret vi HeLa cellelinier med inducerbar shRNA ekspression. I disse celler PHB1 og PHB2 mRNA’er var effektivt og selektivt nedreguleres efter induktion af genspecifikke shRNA og prohibitin proteiner reversibelt blev undertrykt. Svarende til den konstitutive silencing af PHB1 eller PHB2, induktion af shRNA ekspression reducerede proliferation af celler og forhindrede kolonidannelse på bløde agarplader, der indikerer en defekt i forankringsuafhængig vækst. Disse cellelinjer muligt for os at finjustere PHB1 og PHB2 lyddæmpning under standardiserede forhold og til at undersøge mekanismen bag den stærke fænotype forbundet med prohibitin udtynding. Vi analyserede først effekten af ​​prohibitin udtynding på niveauerne af mitokondrie fusionsprotein OPA1 som tidligere publikationer har vist, at prohibitins er nødvendige for stabil ekspression af OPA1 [17], [21]. Vi kunne vise, at OPA1 udtryk er afhængig af niveauet af prohibitins. En mindre reduktion af prohibitins, set tidligt efter induktion af shRNA produktion, førte til en delvis fragmentering af fusion kompetent OPA1 fragmenter a og b. På senere tidspunkter af induktion og dermed stærkere udtømning af prohibitins, OPA1 fragmentering steget og mitokondrier optrådte fragmenteret. En ufuldstændig reduktion af prohibitin proteiner, som set med udtryk for shRNAs shPHB1-0 og shPHB2-0, resulterede kun i mild OPA1 fragmentering og ingen fragmentering af det mitokondrielle netværk. Yderligere analyse viste, at selv stærk og langvarig udtømning af PHB1 f.eks i celler, der producerer shPHB1-3, var ikke årsag til spredning af MMP

Til dato, virkningerne af prohibitin tab i pattedyrceller er stadig uklart:. Schleicher et al. [26] og Ross et al.