PLoS ONE: schisandrin B Dæmper Cancer invasion og metastase Via Inhibiting Epithelial-Mesenchymale Transition

Abstrakt

Baggrund

Metastase er den største årsag til kræft dødsfald og målrette processen med metastaser er blevet foreslået som en strategi til bekæmpelse af kræft. Derfor, for at udvikle lægemiddelkandidater, der er målrettet processen med metastase er meget vigtig. I de indledende undersøgelser fandt vi, at schisandrin B (Sch B), et naturligt forekommende dibenzocyclooctadiene lignan med meget lav toksicitet, kunne undertrykke cancermetastase.

Metode

BALB /c-mus blev inokuleret subkutant eller injiceres via halevenen med murint brystkræft 4T1-celler. Mus blev opdelt i Sch B-behandlede og kontrolgrupper. Den primære tumorvækst, lokal invasion, lunge og knoglemetastase, og overlevelsestiden blev overvåget. Tumorbiopsier blev undersøgt immuno- og histo-patologisk. Den hæmmende aktivitet af Sch B på TGF-β induceret epithelial-mesenkymale overgang (EMT) af 4T1 og primære humane bryst kræftceller blev analyseret.

vigtigste resultater

Sch B betydeligt undertrykt den spontane lunge og knoglemetastaser af 4T1-celler inokuleret sc uden signifikant virkning på primær tumorvækst og væsentligt forlængede overlevelsestiden for disse mus. Sch B inhiberede ikke lunge metastase af 4T1-celler, som blev injiceret via halevenen. Forsinket start af behandling med Sch B i mus med allerede eksisterende tumorer ikke reducere lunge metastase. Disse resultater tydede på, at Sch B handlet på trinnet med lokal invasion. Histopatologiske beviser viste, at de primære tumorer i Sch B-gruppen var signifikant mindre lokalt invasiv end kontrol tumorer. In vitro demonstreret assays at Sch B kunne hæmme TGF-β inducerede EMT af 4T1-celler og primære humane brystcancerceller.

Konklusioner

Sch B undertrykker lungen og knoglemetastaser af 4T1-celler væsentligt via hæmme EMT, tyder på anvendelsesmuligheder i at målrette processen med kræft metastaser

Henvisning:. Liu Z, Zhang B, Liu K, Ding Z, Hu X (2012) schisandrin B Dæmper cancer invasion og metastase via Inhibiting epiteliale-Mesenchymale Transition. PLoS ONE 7 (7): e40480. doi: 10,1371 /journal.pone.0040480

Redaktør: Jonas Fuxe, Karolinska Instituttet, Sverige

Modtaget: Januar 30, 2012; Accepteret: 8 jun 2012; Udgivet: 25 Jul 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National 863 projekt (2007AA02Z143), Kina Naturvidenskab Foundation projekter (30772544, 81.071.802) og grundforskning Midler til de centrale universiteter, nationale undervisningsministerium, Kina, til X. Hu. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Brystkræft er den førende trussel mod kvinder, med en anslået 1,4 millioner nye tilfælde og 458.000 dødsfald i 2008 på verdensplan [1]. I de sidste to årtier, integrationer af kirurgi, kemoterapi, strålebehandling, overgangsalderen hormonbehandling, og anti-HER2 lægemidler bidrager væsentligt til dødeligheden faldet [2]. Trods de betydelige etableres, distal metastase af brystcancer til indre organer og knogler er stadig dårligt løst [1], [3], [4].

Kræft metastase er en multi-trins proces, der omfatter lokal invasion, intravasation til lymfeknuder og blod systemer, overlevelse i blodbanen, ekstravasation fra mikrokar og kolonisering på et andet sted [5], [6]. Talrige undersøgelser har afsløret indsigt i mekanismerne i hvert trin af cancermetastase [7], [8]. Den flertrins af kræft metastase og forståelsen af ​​de tilhørende mekanismer giver mange muligheder for kemiske interventioner [9].

5 × 10

4 levedygtige 4T1 celler blev inokuleret

sc

i den rigtige andet brystfedtpude område at etablere spontant metastatisk model. Sch B (100 mg /kg legemsvægt) eller bærer (0,5% paraxamer) blev doseret intragastrisk hver dag i i alt 7 doser. Mus (n = 20 for hver gruppe) blev aflivet på dag 30. (A) De vækstkurver primær tumor (B) Mouse legemsvægt. (C) Primære tumorvægt på dagen aflivet. (D) Antal synlige lunge metastatiske knuder. (E) Lungen metastatisk indeks. *, P 0,05, ** P 0,01

schisandrin B (Sch B) er den mest udbredte dibenzocyclooctadiene lignan stede i traditionel kinesisk lægeurt

Schisandra chinensis

(.

Turcz.

)

Baill

. I de sidste mange år har Sch B blevet afsløret at besidde flere funktioner mod kræft. Vi og andre tidligere rapporteret, at Sch B var en dobbelt hæmmer af P-glycoprotein og multiresistens protein 1 (MRP1) [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Sch B kunne også øge doxorubicin-induceret apoptose i kræftceller, gennem aktivering af mitokondrie apoptosecyklus, uden åbenlyse forbedrede toksiciteter mod normale celler [16], afbøde doxorubicin-induceret akut og kronisk kardiotoksicitet [17], [18], dæmpe cisplatin induceret oxidativ stress, genotoksicitet og neurotoksicitet [19], og inhibere ATR proteinkinaseaktiviteten som respons på DNA-skade [20]. I en pilotundersøgelse, der havde til formål at observere effekten af ​​Sch B om forbedring af det anti-tumor effekt af doxorubicin på murine brystkræft 4T1 celler, bemærkede vi, at Sch B alene væsentlig grad kan formindske spontane lunge metastase af 4T1. Denne indledende bemærkning fik os til at udføre denne undersøgelse for at undersøge den hæmmende effekt af Sch B på 4T1 in vivo metastaser.

5 × 10

4 levedygtige 4T1 celler blev inokuleret

sc

i den anden højre brystfedtpuden område at etablere spontant metastatisk model. Mus blev behandlet med Sch B (100 mg /kg legemsvægt) eller bærer hver dag i i alt 7 doser. Primære tumorer blev reseceret på dag 10. To tredjedele af mus (n = 20 for hver gruppe) blev aflivet på dag 30 og en tredjedel af musene (n = 10 for hver gruppe) var for overlevelse eksperiment. (A) Antallet af synlige 4T1 lunge metastase. (B) Lung metastatisk indeks beregnes som H 0,05, **, P. 0,01

Mus (n = 8 for hver gruppe), der modtager Sch B (100, 30, 10 mg /kg legemsvægt) eller bærer hver dag i alt 7 doser, og primære tumorer blev reseceret på dag 10. (A) Mouse overlevelsestid. (B) Mouse legemsvægt. (C) Tumor vægt resektion på dag 10. *, P 0,05, ** P 0,01, Sch B versus kontrolgruppen

Materialer og metoder

Kemikalier og antistoffer.

Sch B var fra det nationale institut for kontrol med farmaceutiske og biologiske produkter (Beijing, Kina). Rekombinant human tumor vækstfaktor-β1 (TGF-β) blev indkøbt fra PeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ). Epiteliale-mesenkymale overgang antistof sampler kit (# 9782, herunder E-cadherin, Snail, Slug ZEB1 antistoffer) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vimentin (# 550.513) og fibronectin (# 610.078) antistoffer var produkter af BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Rhodamin phalloidin (# R415) blev købt fra Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA)

Bone metastase af 4T1 i mus demonstreret i figur 2 blev vurderet ved anvendelse H 0,05, Sch B versus kontrolgruppen

Cell Culture

4T1 celler fra Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection (Shanghai, Kina) og dyrket i monolag i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 pg /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. MDA-MB-231-celler blev erhvervet fra American Tissue Culture Collection (nr HTB-26; ATCC, Manassas, VA) og holdt i Leibovitz L-15 medium med 10% FBS, 100 pg /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alle fra Invitrogen). Begge celler blev holdt i en fugtig inkubator ved 37 ° C 5% CO

2 atmosfære

(A) haleveneinjektion model:. Mus (n = 10 for hver gruppe) blev tvangsfodret med Sch B ( daglige doser: 30 eller 100 mg /kg kropsvægt eller bærestof) i 3 dage før 4T1 celleinokulering. Derefter blev hver mus inokuleret med 2 x 10

5 4T1 celler via haleveneinjektion, efterfulgt af behandling med Sch B (daglige doser: tvangsfodret med 30 eller 100 mg /kg legemsvægt eller køretøj) i de følgende på hinanden følgende 7 dage og aflivet på dag 18. (B) Forsinket behandling model. Mus (n = 10 for hver gruppe) blev podet med 5 x 10

4 4T1 celler

s.c.

. ind i den anden højre brystfedtpuden område, og de primære tumorer blev reseceret på dag 10. Sch B (100 mg /kg legemsvægt) eller vehikel blev givet hver dag fra dag 13-19 i i alt 7 doser, og musene var aflivet på dag 30. Den lunge metastase blev scoret af makroskopiske metastatisk knude som beskrevet i Materialer og Metoder. *, P 0,05, Sch B versus kontrolgruppen

primær cellekultur

Friske brysttumorer blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgi med skriftligt informeret samtykke.. Enheder af infiltrerende duktalt brystcarcinom uden kemoterapi blev udvalgt til cellekultur som beskrevet af Speirs et al. [21]. Cellerne blev dyrket i HuMEC Ready Medium (Invitrogen) suppleret med 2% FBS i en fugtig inkubator ved 37 ° C 5% CO

2 atmosfære.

Mus (n = 20 for hver gruppe) blev behandlet med Sch B (100 mg /kg legemsvægt) eller vehikel intragastrisk dagligt i 7 dage. (A) Primære tumorer og omgivende væv blev resektion på dag 15 for hæmatoxylin-eosin farvning (øverste, × 40, lavere, × 100). (B) immunfarvning af E-cadherin og vimentin. (× 100).

Dyr

BALB /c og BALB /c nu /nu mus (18-22 g) blev opnået fra Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, Kina, Animal certifikat: Nej SCXK [Hu] 2007-0005). Dyr blev opstaldet i en standard polypropylen bur indeholdende steril strøelse under en kontrolleret tilstand af temperatur (23 ± 2 ° C), fugtighed (50 ± 5%), og lys (10 og 14 timer af lys og mørke) i Zhejiang University Laboratory Animal center (nr SYXK [Zhe] 2007-0029).

4T1 Syngene xenograftmodel

dyremodel er baseret på den tidligere rapport [22]. Hver mus blev podet med 5 x 10

4 levedygtige 4T1 celler

s.c.

. i den anden højre brystfedtpuden område. Musene blev randomiseret til Sch B eller kontrolgruppe den næste dag efter podning. Hver mus blev tvangsfodret med enten Sch B (100, 30 eller 10 mg /kg legemsvægt) eller bærer (0,5% paraxamer, Sigma) hver dag i i alt 7 doser. For at undersøge virkningen af ​​Sch B på 4T1 metastase, vi brugte 3 protokoller. Først blev musene sondetilføres Sch B (100 mg /kg legemsvægt), og tumorerne voksede uafbrudt. For det andet blev mus doseret med Sch B (100 mg /kg legemsvægt) og derefter primære tumorer blev reseceret på dag 10 som tidligere beskrevet [23]. Tredje blev mus administreret med tre doser af Sch B (100, 30 eller 10 mg /kg legemsvægt) og primære tumorer blev udskåret på dag 10. tumorvolumen blev målt ved skydelære to eller tre gange ugentligt, og beregnes som en ellipse volumen formel V = (L × B

2) × 0,5, hvor L er længden og W er bredde. Lungemetastaser blev bedømt ved at tælle de makroskopiske metastatiske knuder baseret på de tidligere rapporter [24], [25], og det gennemsnitlige antal lungemetastaser per mus blev bestemt som en indikator for generelle cancer dataudsendelser [23], [26].

Celler blev behandlet med Sch B (5 ug /ml) og TGF-β (5 ng /ml) som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) Repræsentative billeder af TGF-β inducerede morfologisk ændring af 4T1-celler med eller uden forbehandling af Sch B. (B) Fluorescence immunfarvning af cellulær E-cadherin, vimentin, fibronectin, og F-actin. (C) Western blotting af E-cadherin, vimentin, sneglen, Slug, ZEB1, med β-actin som intern kontrol. (D) og (E), TGF-β induceret migration og invasion af 4T1-celler med eller uden forbehandling af Sch B. (F) Repræsentative billeder af TGF-inducerede morfologiske ændringer af primær brystcancerceller med eller uden forbehandling af Sch B og western blotting af E-cadherin og vimentin af primære brystkræftceller fra tre individuelle patienter.

Forsinket behandling Model

primære tumorer blev resektion på dag 10, og Sch B (100 mg /kg legemsvægt) eller vehikel blev tvangsfodret på dag 13-19. Alle dyr blev aflivet på dag 30 for dataindsamling.

haleveneinjektion Model

Denne in vivo model er baseret på den tidligere rapport [27]. Før podning med 4T1-celler blev hver mus sondetilføres Sch B (30, 100 mg /kg) eller bærer (0,5% paraxamer) i 3 på hinanden følgende dage. Hver mus blev derefter podet med 2 × 10

5 celler intravenøst ​​via haleveneinjektion, efterfulgt af Sch B eller behandling køretøj i de næste 7 dage i træk. Alle mus blev aflivet på dag 18.

MDA-MB-231 in vivo dyremodel

Hver mus blev podet med 5 x 10

6 MDA-MB-231 celler

sc

. i den anden højre brystfedtpuden område. Musene blev randomiseret til Sch B eller kontrolgruppe den næste dag efter podning. Hver mus blev tvangsfodret med enten Sch B (100 mg /kg legemsvægt) eller bærer (0,5% paraxamer, Sigma) i de næste 7 dage i træk med i alt 7 doser. Mus blev aflivet på dag 30 efter podning

Kriterium at Vurdere Mouse Moribund status

En døende mus er defineret som en, der udviser mere end et af de følgende seks kliniske tegn:. Manglende evne til at spise eller drikke; svær sløvhed (modvilje mod at bevæge sig, når forsigtigt prikkede med en pincet); svær balance eller gangforstyrrelse ifølge NIH kriterium [28].

Histologiske Analyser

Tumor væv blev fikseret, indlejret, og skåret i 5 um tykke sektioner. Paraffinsnit blev farvet med hematoxylin og eosin (H B . Figur S1) betydeligt. Eksperiment 2 var at observere overlevelsestiden. Fig. 2C viste, at mus, der modtog Sch B levede betydeligt længere end kontrol og denne virkning var dosisafhængig (fig. 3A). De vækstkurver mus og vægt af tumorer var sammenlignelige mellem Sch B og kontrolgruppen (Fig 2D .. E, figur 3B . 3A) overlevede i 3 måneder, hvorefter eksperimentet blev afsluttet. Dette fænomen blev observeret i tre uafhængige forsøg. Disse mus blev henrettet og undersøgt patologisk. Der var ingen synlig lunge metastase i disse mus (data ikke vist). Det er blevet demonstreret af Pulaski og Demaria [37], [38], at metastase af 4T1 syngen tumor kunne forekomme ved meget tidligt tidspunkt (f.eks inden for den første uge efter sc inokulering), og vores undersøgelse tyder på, at Sch B kunne interferere med tidlig metastase. Konsekvent, viste vi, at Sch B kunne dæmpe 4T1 lokal invasion in vivo og inhibere EMT in vitro (se nedenfor). Resultaterne antyder, at tidlig kirurgi (fx kirurgi udført inden for 10 dage efter inokulering) kombineret med Sch B behandling kan fuldstændigt blokere in vivo metastase af 4T1-celler.

Sch B Dæmper 4T1 Metastase til Bone

4T1 musemodel er almindeligt anvendt som en model for brystcancer metastase til knogle [32], [39]. Inhibering mamma tumormetastase til lungen kan aflede tumorceller til at metastasere til alternative organer, såsom knogle [32]. For at udelukke denne mulighed, vi undersøgte, om Sch B ville aflede 4T1 til knoglemetastaser. Vores data viste, at Sch B væsentligt reduceret 4T1 metastaser til knogler (figur 4), som afspejles af sværhedsgraden af ​​osteolyse.

Sch B Hæmmer Lokal Invasion af 4T1 celler

Selv om de ovennævnte resultater er angivet at Sch B kunne hæmme 4T1 lunge og knoglemetastaser, det ikke var kendt, hvordan Sch B forstyrret 4T1 metastaser. Da kræft metastase er en kompleks proces, der involverer lokal invasion, intravasation, overlevelse i blodbanen, ekstravasation og kolonisering på et andet sted, vil det være vigtigt at identificere på hvilket trin Sch B forstyrrer 4T1 metastaser. Vi troede, at modellen via halevenen injektion af kræftceller kan bidrage til at fortælle, hvis Sch B forstyrrer metastaser i trin af den lokale invasion eller ej. Hvis Sch B ikke inhiberer lunge metastase af 4T1-celler injiceret via halevene, bør det forstyrre 4T1 metastase ved trinnet til lokal invasion. Resultaterne viste, at Sch B havde ingen signifikante inhibitoriske virkninger på lunge metastase af 4T1-celler via halevenen injektion (fig. 5A).

For yderligere at bekræfte, hvis Sch B påvirke 4T1 metastase ved trinnet tidligt stadium vi udførte et eksperiment af forsinket behandling med Sch B i mus med allerede eksisterende tumorer. Resultaterne viste, at forsinket behandling med Sch B havde ingen signifikant effekt på 4T1 metastase (fig. 5B).

Baseret på ovenstående resultater, udførte vi den histopatologiske undersøgelse. Som vist i Fig.6A havde tumorceller invaderet dybt ind i musklerne i de fleste af de primære tumorer i kontrolgruppen (13 ud af 20), mens der i Sch B-gruppen, viste de fleste tumorer en klar grænse mellem regionen af ​​tumorceller og muskler (14 af 20). Desuden celler i tumoren marginen i kontrolgruppen var spindel-formet, mere ligesom mesenkymale celler, mens der i Sch B-gruppen, tumorceller holdes “brosten” morfologi, mere ligesom epitelceller. Disse observationer antydede, at Sch B kan hæmme epitelial mesynchymal overgang (EMT).

Udover morfologiske ændringer, er EMT også ledsaget med udtryksmæssige ændringer af nogle biomarkører, såsom E-cadherin, vimentin osv [6], [ ,,,0],40], [41]. Når celler er under denne overgang, vil E-cadherin blive nedreguleret og vimentin opreguleret. Vi undersøgte udtryk for E-cadherin og vimentin i tumorer. Fig.6B viste tumorceller i Sch B-gruppen havde en højere E-cadherinekspression (en epitelial biomarkør), men lavere vimentin udtryk (en mesenchymal biomarkør) end dem i kontrol, hvilket tyder på, at Sch B hæmmede 4T1 metastaser sandsynligvis via målrettet EMT.

Bortset fra 4T1 model, undersøgte vi også effekten af ​​Sch B på in vivo-metastase af human cellelinie brystcancer MDA-MB-231 (fig. S2). 30 dage efter inokulering blev mus aflivet. Vi fandt, at der var hverken makroskopiske metastatiske knuder i lunge eller knogle metastaser i kontrol og Sch B behandlede mus. Rapporterne om metastatisk evne denne cellelinje fra forskellige laboratorier synes blandet: mens flere grupper rapporterede en dårlig metastatisk evne denne celle [42], [43], [44], andre [45], via kraftig udvælgelse, erhvervet flere subkloner (knogle-søger MDA-231BO og hjerne-søger MDA-231BR) med høj metastatisk evne. Trods ingen indlysende metastase, bemærkede vi, at, ligner 4T1 celler, MDA-MB-231 celler invaderet dybere ind i musklerne i de fleste af de primære tumorer i kontrol end i Sch B behandlede gruppe.

Sch B hæmmet TGF-β induceret EMT af 4T1 og primære humane Breast Cancer Cells

in vitro

TGF-β er en stærk EMT inducer, der kan forværre tumorcellemigration invasion

in vitro

[46]. I EMT inhiberingsassay, 5 ug /ml Sch B, en fusion, langt under dens IC

50 mod 4T1 celler (Fig. S3), blev anvendt.

4T1 celler blev spindel-formet eller mesenchymal- ud efter TGF-β behandling, ledsaget af en nedsat E-cadherin-ekspression og øgede udtryk for vimentin /Slug /Snail /ZEB1. Denne virkning blev signifikant svækket ved forbehandling af celler med Sch B (fig. 7A, 7B, 7C).

Konsekvent, i sårheling assay TGF-β øget vandringshastigheden af ​​4T1-celler med omkring to folder mere end for kontrollen, som blev så godt inhiberet ved forbehandling af celler med Sch B (fig. 7D, fig. S4A). Tilsvarende blev invasionen evne 4T1-celler forstærkes af TGF-β signifikant svækket ved Sch B (fig. 7E, fig. S4b), som alene påvirkede hverken cellemigrering eller invasion.

Sch B inhiberede også virkningen af TGF-β på de primære humane brystcancerceller (fig. 7F).

Discussion

som cancerrelateret mortalitet i vid udstrækning skyldes cancermetastase, at reducere metastase er en vigtig strategi til bekæmpelse kræft. Det foreslås af en gruppe kendte forskere, at “eftersom primære tumorer ofte kan styres med konventionelle behandlinger, kan midler, som virker specifikt på processen med metastase være mere tilbøjelige til at øge langsigtet patientoverlevelse» [47] . I denne undersøgelse viser vi (1) Sch B signifikant dæmper 4T1 metastase derved forlænge overlevelsestiden for mus; (2) Sch B dæmper 4T1 metastase ved trinnet til lokal invasion; og (3) Sch B hæmmer EMT af 4T1 celler samt primære humane brystkræftceller. Vi konkluderer, at Sch B kan dæmpe 4T1 celle metastase via hæmme EMT.

En anden mulig mekanisme for Sch B til at hæmme metastaser kunne være sin cytotoksisk virkning på 4T1 celler. Dette virker usandsynligt. Dyreforsøg har vist, at Sch B ikke afgørende påvirket væksten af ​​primære 4T1 tumorer (fig. 1, 2, 3), hvilket antyder ingen cytotoksisk virkning. Dette er generelt behagelig med de tidligere rapporter om, at dette stof har lav cytotoksicitet mod kræftceller i forhold til kliniske anticancer narkotika [17], [48], [49]. For yderligere at understøtte, at cytotoksicitet ikke spillede en stor rolle i formildende 4T1 celle metastase, vi medtaget doxorubicin (Dox), en meget cytotoksisk anticancer narkotika, i vores eksperimentelle design. Selvom cytotoksiciteten af ​​Dox mod 4T1 er tre størrelsesordener stærkere end Sch B (data ikke vist), 4T1 lungemetastaser var signifikant mindre i Sch B-gruppen end i Dox eller kontrolgruppen, men uden signifikant forskel mellem de to sidstnævnte grupper (fig. S5A). Kollektivt, Sch B hæmme 4T1 metastaser er usandsynligt via sine cytotoksiske virkninger.

Mens forlænge levetiden af ​​kræftpatienter er første prioritet i kemoterapi, livet kvaliteten af ​​kræftpatienter er også meget vigtigt. Mange kliniske anticancerlægemidler har alvorlige bivirkninger, såsom neurotoksicitet, gastrointestinal reaktion, knoglemarv hæmning, hårtab, etc., som væsentligt reducerer livskvaliteten af ​​kræftpatienter. Derfor er smertelindring stigende grad anerkendt i kræft kemoterapi. På denne henseende vil udvikle lægemidler, der har meget lav systematisk toksicitet for menneskelige krop være mere ideel. Sikkerheden af ​​Sch B er veldokumenteret. De tidligere rapporter fra andre laboratorier viste, at i deres protokoller under anvendelse Sch B at beskytte carbontetrachlorid-induceret hepatotoksicitet i mus, dosis af Sch B er 3 mmol /kg (1,2 g /kg), implicerer den velkendte tolerance af denne forbindelse [ ,,,0],50]. De toksikologiske data som gennemgået af Hanke

et al.

Afslørede den høje sikkerhed for denne forbindelse [51]. Desuden er der en tilstrækkelig mængde bevis for, at denne forbindelse er sikker for mennesker. Sch B er den mest rigelige dibenzocyclooctadiene derivat i

S. chinensis

(Turcz.) Baill, en kinesisk traditionel lægeurt. Denne urt er blevet brugt som en medicin i de sidste mange tusinde år, og er stadig aktivt praktiseres i Kina, Sydkorea og Japan, med ingen alvorlige bivirkninger nogensinde rapporteret.

Bortset fra dens hæmning på kræftcellen metastase, Sch B kombineres med andre lægemidler mod cancer kan bringe andre potentielle fordele. Det er blevet rapporteret, at nogle anticancermidler kan forbedre metastase via aktivering kræftceller ‘invasionsevne og metastase. For eksempler, inhibering af angiogenese reducerede primær tumorvækst og mikrokardensitet tæthed, men accelererede tumorinvasion og metastase [52], [53]; cyclophosphamid og Hsp90 inhibitor 17-AAG inhiberede primære tumorer, men fremmes tumorinvasion og metastase [54], [55]; doxorubicin fremmet knoglemetastaser af 4T1-brystcancerceller [32]. Vi forestiller, at kombinationen af ​​Sch B med disse midler kunne bringe fordele til at styre både primær tumor og metastase.

Støtte Information

Figur S1. Salg Virkninger af Sch B på lunge metastase af 4T1-celler. Lunge metastase af 4T1 i mus demonstreret i figur 2 blev vurderet ved anvendelse H & E-farvning som beskrevet i Materialer og Metoder. Musene (n = 20 for hver gruppe) blev aflivet på dag 30 og metastase blev kvantificeret med H & E-farvning ved at tælle det totale vævsområde pr lunge sektion og metastase til stede i samme område. (A) De repræsentative billeder af synlige overflade lunge knuder. (B) H & E-farvning af lungemetastaser. Under mikroskop, var vi ikke i stand til at tage et fuldstændigt billede med et enkelt foto, så vi tog flere billeder, som derefter blev kombineret

doi:. 10,1371 /journal.pone.0040480.s001

(TIF)

Figur S2. Salg Virkninger af Sch B på MDA-MB-231 dyremodel. 5 × 10

6 levedygtige MDA-MB-231-celler blev inokuleret s.c. ind i den anden højre brystfedtpuden område. Mus blev tvangsfodret med Sch B (100 mg /kg legemsvægt) hver dag i i alt 7 doser. Mus blev aflivet på dag 30 efter inokulering. Primære tumorer, knogler og omgivende væv blev patologisk undersøgt ved hjælp af H & E. (A) De repræsentative billeder af invasive foran, hvor tumorceller invaderet i den omgivende muskel i kontrolgruppen, mens invasionen blev svækket i Sch B behandlede gruppe. (B) Vækstkurver for primær tumor. (C) Kropsvægt kurver. (D) Tumor vægt på dagen for offer. (E) Repræsentative billeder af lunger, der har ingen synlige metastatiske knuder. (F) ben knogler (femora og skinneben) blev fikseret i 10% neutral pufret formalin, afkalkes i 1% HCI i 24 timer og indlejres i paraffin. Sektioner blev farvet med H & E, som viser ingen observerbar metastaser

doi: 10,1371 /journal.pone.0040480.s002

(TIF)

Figur S3..

cytotoksicitet Sch B mod 4T1 celler. 2 × 10

3-celler blev podet per brønd i 96-brønds plader. Sch B (5, 10, 20, 40, 80, 160 ug /ml) blev tilsat, og cellerne blev dyrket i 60 timer. Cellelevedygtighed estimeret ved trypan blå eksklusion assay.