PLoS ONE: induktion af apoptose Koblet til endoplasmatisk reticulum Stress i Human prostata cancer celler med n-butylidenephthalide

Abstrakt

Baggrund

N

-butylidenephthalide (BP) udstiller antitumorvirkning i en lang række cancercellelinier. Formålet med denne undersøgelse var at opnå yderligere indsigt i de involverede i BP-induceret celledød i humane prostata kræftceller mekanismer.

Metoder /vigtigste resultater

To humane prostatakræft-cellelinier, PC- 3 og LNCaP, blev behandlet med BP, og efterfølgende evalueret for deres levedygtighed og cellecyklus-profiler. BP forårsagede cellecyklusstop og celledød i begge cellelinier. Den G0 /G1 fasen anholdelse var korreleret med øge niveauet af CDK-inhibitorer (p16, p21 og P27) og fald i checkpoint proteiner. Til bestemmelse af mekanismerne i BP-induceret vækststandsning og celledød i prostatakræft-cellelinier, har vi udført en microarray undersøgelse for at identificere ændringer i genekspression induceret af BP i LNCaP-celler. Adskillige BP-inducerede gener, herunder GADD153 /CHOP, en endoplasmatisk reticulum stress (ER stress) -regulated gen, blev identificeret. BP-induceret ER stress fremgik af øget ekspression af de nedstrøms molekyler GRP78 /BIP, IRE1-a og GADD153 /CHOP i begge cellelinier. Blokering af IRE1-α eller GADD153 /CHOP ekspression ved siRNA væsentligt reduceret BP-induceret celledød i LNCaP-celler. Desuden blokering af JNK1 /2 signalering ved JNK siRNA resulterede i nedsat ekspression af IRE1-α og GADD153 /CHOP gener, implicerer, at BP-induceret ER stress kan fremkaldes via JNK1 /2 signalering i prostata kræftceller. BP undertrykte også LNCaP xenograft tumorvækst i NOD-SCID-mus. Det forårsagede 68% reduktion i tumorvolumen efter 18 dages behandling.

Konklusioner Salg

Vores resultater tyder på, at BP kan forårsage G0 /G1 fasen i prostatacancerceller og dens cytotoksicitet medieret af ER stress induktion. Således kan BP tjene som et anticancermiddel ved at inducere ER stress i prostatacancer

Henvisning:. Chiu S-C, Chen S-P, Huang S-Y, Wang M-J, Lin S-Z, Harn H-J, et al. (2012) induktion af apoptose Koblet til endoplasmatisk reticulum Stress i Human prostata cancer celler af

n

-butylidenephthalide. PLoS ONE 7 (3): e33742. doi: 10,1371 /journal.pone.0033742

Redaktør: Ashraf B. Abdel-Naim, Det Farmaceutiske Fakultet, Ain Shams University, Egypten

Modtaget: November 22, 2011; Accepteret: 16 Februar 2012; Udgivet: Marts 28, 2012 |

Copyright: © 2012 Chiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Council, Taiwan (NSC-93-2320-B-303-004, NSC-94-2320-B-303-005, NSC-96-2113-M-303 til 001), og buddhistiske Tzu-Chi General Hospital, Hualien, Taiwan (TCSP-01-02, TCRD-I9801-03). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige malignitet i amerikanske mænd og den anden hyppigste årsag til dødsfald af kræft [1]. De behandlingsmuligheder for patienter omfatter kirurgi, strålebehandling, hormonel terapi, kemoterapi og kombinationer af nogle af disse behandlinger. En af de mest almindelige kemoterapi middel anvendt til behandling af prostatacancer, er taxaner, såsom den første generation lægemiddel paclitaxel (Taxol, et varemærke fra Bristol-Myers Squibb) [2], [3]. Forhøjede koncentrationer af cytotoksiske lægemidler og højere doser af bestråling ikke forbedrer respons på behandlingen, og det fører til apoptose resistens i prostatacancerceller. Derfor nyudviklede anticancermidler, der er ikke-toksisk og yderst effektivt inducerer apoptose fortrinsvis i tumorceller er værdifulde.

For nylig er ikke-traditionelle behandlinger ved hjælp urter og kosttilskud blevet betragtet som alternative lægemidler til cancerbehandling.

Angelica sinensis

(også kaldet danggui i kinesisk) er en af ​​de mest almindeligt anvendte traditionelle urter i Kina. Det anbefales som en tonic, Hæmopoetisk, spasmolytisk og analgetisk lægemiddel i klinisk praksis [4]. I vores tidligere undersøgelse,

n

-butylidenephthalide (BP), en forbindelse isoleret fra

Angelica sinensis

chloroform ekstrakt, udviser vækstinhiberende aktivitet på forskellige humane cancercellelinier, herunder hjerne, lunge og lever cancerceller. BP forårsagede vækst anholdelse og apoptose i disse tumorceller

in vitro

in vivo

[5] – [7]. Disse fund indikerer, at BP er en lovende ny anticancer forbindelse med et potentiale for klinisk anvendelse. Imidlertid har den virkning, BP på prostatacancerceller ikke blevet behandlet.

Protein foldning i det endoplasmatiske reticulum (ER) forringes under forskellige fysiske og patologiske tilstande, betegnet ER stress. En specifik signaleringsvej, udfoldet protein reaktion (UPR), er blevet demonstreret i celle at overvinde ER stress [8]. Induktion af glucose-reguleret protein GRP78 /BiP er blevet bredt anerkendt som en markør for ER stress og påbegyndelsen af ​​UPR. UPR signaler via tre forskellige stress-sensorer placeret på ER-membranen: proteinkinase RNA-lignende ER kinase (Perk), inositol-kræver protein-1 α (IRE1-α) og aktivering transkriptionsfaktor-6 (ATF6) [9]. Blandt dem, IRE1-medieret aktivering JUN N-terminal kinase (JNK) bidrager til celledød ved phosphorylering og inaktiverer anti-apoptotiske regulator BCL-2 [10]. Transskriptionsfaktoren CCAAT /forstærker-bindende protein (C /EBP) -homologous protein (CHOP, også kendt som DDIT3 /GADD153) opererer på konvergensen mellem PERK, IRE1-α og ATF6 veje [11], [12]. Overekspression af CHOP spiller en vigtig rolle i apoptose [13] gennem dephosphorylerer den proapoptotiske BH3-only protein Bad og nedregulerer Bcl-2-ekspression [14]

Denne foreliggende undersøgelse søges:. 1) til bestemmelse af anti -proliferative effekt af BP

in vitro

in vivo

, 2) at analysere virkningerne af BP på cellecyklusprogression og apoptose, 3) at undersøge ER stress som en potentiel molekylære mål for BP, og 4) at fastslå, om MAPK /eR stress signalering er involveret i BP-medieret apoptose i prostatacancer. Virkningerne af BP i prostatakræft blev evalueret

in vitro

i LNCaP og PC-3-cellelinjer. LNCaP-NOD-SCID-mus xenograft eksperiment blev anvendt til at vurdere anticancer effekt af BP

in vivo

.

Resultater

BP hæmmede spredning og inducerede morfologi ændringer i menneskelig prostatakræft celler

BP har en stærk anti-proliferativ virkning på GBM-celler og forårsagede G0 /G1-fasen og apoptose på en tids- og koncentrationsafhængig måde. For at bestemme cytotoksicitet virkning BP på prostatacancerceller blev tre human prostatacancer-cellelinier behandlet med stigende koncentration af BP i 24 og 48 timer, og blev vurderet ved MTT-assayet. Som vist i fig. 1A og B, BP faldt betydeligt levedygtighed DU-145, PC-3 og LNCaP-celler på en dosis og tidsafhængig måde. Behandling af LNCaP og PC-3-celler med 75 pg /ml BP i 48 timer resulterede i 24,48% og 45,88% celleoverlevelse, (fig. 1B). Baseret på disse data, vi brugte 70 ug /ml BP til efterfølgende undersøgelser. For yderligere at undersøge cytotoksicitet effekt af BP på prostatacancerceller blev LNCaP (androgen-afhængige) og pc-3 (androgen-uafhængige) celler udvalgt til yderligere undersøgelse. BP-behandlede LNCaP og PC-3 celler viste indlysende celle svind og oprunding, funktioner typisk for celler undergår apoptose (fig. 1D og F).

DU-145 (sort), PC-3 (grå) blev LNCaP (hvide) celler behandlet med stigende koncentration af BP (25 til 100 ug /ml) i 24 (A) og 48 timer (B) og analyseret med MTT-assayet. LNCaP og PC-3-celler blev behandlet med 0,2% DMSO (C og E, henholdsvis) eller 70 ug /ml BP (D og F, henholdsvis) i 24 timer, blev vist.

BP induceret cellecyklusstop ved G0 /G1 fasen og ændrede ekspressionsniveauerne af G0 /G1 regulatoriske proteiner

for at belyse dens virkningsmekanisme, vi undersøgt virkningerne af BP på cellecyklusprogression. Flowcytometri-analyse viste, at BP behandling resulterede i akkumulering af celler i G0 /G1-fasen i en tidsafhængig måde (fig. 2A og B). Kvantificering af prolifererende ubehandlede celler viste, at 67,95% af cellerne var i G0 /G1-fasen, 24,96% af cellerne var i S-fasen, og 7,73% af cellerne var i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus 12 timer efter udpladning i LNCaP celler; 62.71% af cellerne var i G0 /G1-fasen, 17,78% af cellerne var i S-fasen, og 19,50% af cellerne var i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus 12 timer efter udpladning i PC-3-celler. Behandling af celler med 70 pg /ml BP i 12 timer øgede procentdelen af ​​celler i G0 /G1-fasen til 81,94%, og reducerede procentdelen af ​​celler i S og G2 /M-faser til 10,6 og 8% i henholdsvis LNCaP-celler. I PC-3-celler behandlet med 70 ug /ml BP i 12 timer, procentdelen af ​​celler i G0 /G1-fasen steg til 69,94%, og cellerne i S og G2 /M-faser faldt til 18,11 og 11,97%, henholdsvis .

BP-induceret cellecyklus G0 /G1 anholdelse i (A) LNCaP- og (B) PC-3 celler. Celler blev podet ved 8 × 10

5 (LNCaP) og 6 x 10

5 (PC-3) pr 6-cm plade i tre eksemplarer og behandlet med 70 ug /ml BP i 12-24 timer. Data er præsenteret som middelværdi ± S.D. fra tre forskellige eksperimenter. *,

P

0,05; **,

P

0,01. Western blot analyse af cyclin D1, CDK2, p16, p21, p27 og phospho-Rb (Ser807 /811) blev udført i LNCaP-celler (C) og PC-3-celler (D). β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Western blot analyse af phospho-Akt (Ser473), blev Akt, phospho-GSK-3β (Ser9) og GSK-3β udført i LNCaP-celler (E) og PC-3-celler (F). β-actin blev anvendt som en intern kontrol.

For at bestemme de molekylære mekanismer bag den G0 /G1 cellecyklusstop i prostata cancer celler induceret af BP, undersøgte vi ekspressionen af ​​visse G0 /G1 regulatoriske proteiner i LNCaP og PC-3-celler behandlet med 70 ug /ml BP. Vi undersøgte først niveauet for cyklin D1, den vigtigste cyklin styrer G0 /G1 checkpoint. BP behandling førte til hurtig reduktion af cyclin D1 proteinniveau (fig. 2C og D). Opregulering af G0 /G1 cellecyklusregulerende proteiner, såsom p16, p21, p27, og nedregulering af CDK2 blev også observeret i en tidsafhængig måde (fig. 2C og D) .Vi observeret også en hurtig reduktion af Rb-phosphorylering niveau (fig . 2C og D), som angiver den kompromitterede aktivering af CDK4 /6.

det er blevet fastslået, at cyclin D1 phosphorylering medieres af Akt-GSK-3β-vejen. Aktiveret Akt phosphorylerer og inhiberer GSK-3β-funktion, der fører til de-phosphorylering og stabilisering af cyclin D1. Derfor undersøgte vi, om Akt-GSK-3β-cyclin D1 vej var involveret i BP-induceret nedbrydning af cyklin D1 i prostata kræftceller. Western blot analyse viste, at BP hurtigt og markant undertrykt Akt phosphorylering, så tidligt som 10 min (fig. 2E og F). I overensstemmelse med inhibering af Akt aktivitet, reduceret phosphorylering af Ser9 i GSK-3β, et mål af Akt kinase, blev også bemærket (Fig. 2E og F), hvilket tyder på, at BP fremmer cyclin D1 phosphorylering via suppression af Akt og aktivering af GSK- 3β. Disse data tyder på, at BP undertrykker Akt-GSK-3β-vejen i prostatacancerceller og forårsager G0 /G1 vækststandsning ved at påvirke ekspression af G0 /G1 regulatoriske proteiner. Salg

BP induceret apoptose i LNCaP og PC-3-celler

for at vurdere betydningen af ​​apoptose i BP-induceret celledød, blev western blotting og TUNEL farvning udført. Aktivering af caspaser er afgørende mekanismer til induktion af apoptose. Caspase -8 og -3 blev nøglen protease forbundet med døden receptor medieret-apoptose og deres involvering i BP-induceret apoptose blev undersøgt i både LNCaP og PC-3 celler. BP-induceret caspase -8 og -3 spaltninger steg dosisafhængigt i både LNCaP og PC-3-celler (fig. 3A og B). De pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer, Bax, øgede også efter BP behandling, som har vigtige forbindelse mellem IRE1 og ER-stress-induceret apoptose. TUNEL-farvning ved 48 timer efter 70 ug /ml BP behandling afslørede også forøget antal apoptotiske celler i både LNCaP og PC-3-celler (fig. 3D og F, henholdsvis).

Western blot-analyse af aktiv caspase 8 , aktiv caspase 3 og Bax blev udført i LNCaP-celler (A) og PC-3-celler (B). β-actin blev anvendt som en intern kontrol. LNCaP-celler og PC-3-celler blev inkuberet i fravær (C og E, henholdsvis) eller nærvær (D og F, henholdsvis) på 70 pg /ml BP i 48 timer og derefter underkastet TUNEL assay.

genekspressionsanalyse af cDNA microarray i BP-behandlede LNCaP celler

for at opnå indsigt i mekanismen for BP-induceret væksthæmning og celledød, vi brugte oligodeoxynukleotid-baserede microarray at identificere BP-medieret genekspression . LNCaP-celler blev behandlet med 70 ug /ml BP i 3 og 24 timer, og RNA blev ekstraheret og anvendt i microarray analyse. Gener herunder GADD153 /CHOP blev identificeret til at blive opreguleret i en tidsafhængig måde (tabel 1). Vi valideret opregulering af GADD153 /CHOP-gener ved Western blot. BP fremkaldte en forøget ekspression af GADD153 /CHOP-protein i både LNCaP og PC-3-celler (fig. 4A og B). Opregulering af GADD153 /CHOP er blevet defineret som ER stress-respons, hvilket igen udløser signaler til at fremkalde apoptose. Vi undersøgte således rollen af ​​ER stress i BP-induceret celledød i prostatacancerceller.

Western blot-analyse af BiP, calnexin, PDI, ATF6, phospho-eIF2α (Ser51), IRE1-α, GADD153 /CHOP, fosfor-ASK1 (Thr845), ASK1 og Fas blev udført i LNCaP-celler (A) og PC-3-celler (B). β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Western blot analyse af BiP, IRE1-α, GADD153 /CHOP og Ero1-Lα blev udført i LNCaP-celler (C) og PC-3-celler (D). β-actin blev anvendt som en intern kontrol.

BP induceret ER stress i LNCaP og PC-3 celler

For at afgrænse induktion af ER stress ved BP i prostata cancerceller, undersøgte vi induktionen af ​​UPR beslægtede gener efter BP behandling i LNCaP og PC-3-celler (fig. 4A og B, henholdsvis). Ekspression af BiP steg efter BP behandling, men blev ikke fundet forskelle i calnexin og PDI udtryk (fig. 4A og B). blev observeret opregulering af ER stress transducer IRE1-α men ikke ATF6 og p-elF-2α. BP induceret IRE1-α udtryk var tydeligt fra 3 h (1,16 folder) og øget indtil 48 h (2,47 folder) i LNCaP celler. Niveauerne af Fas steg efter BP behandling i både LNCaP og PC-3-celler og var i overensstemmelse med microarray konstatering i LNCaP-celler. Desuden udtryk for BiP, IRE1-α og GADD153 steg dosisafhængigt i både LNCaP og PC-3-celler (fig. 4C og D). Den GADD153 transkriptionel mål, ER oxidase en lignende α (ERO1-Lα) også steget i en dosisafhængig måde efter BP behandling (fig. 4C og D).

BP-induceret nukleare translokation af GADD153 /CHOP i LNCaP og PC-3 celler

for at undersøge inddragelsen af ​​GADD153 /CHOP i BP behandling, vi først undersøgt, om BP fremmet translokation af GADD153 /CHOP protein til kernen. GADD153 /CHOP nuklear translokation repræsenterer bære stress signal til kernen og derfor en funktionel aktivering. Ved 12 timer efter 70 ug /ml BP behandling, GADD153 /CHOP var tilsyneladende mere rigelig i kernen af ​​BP-behandlede LNCaP og PC-3-celler end for kontroller (fig. 5A og B).

(A) LNCaP-celler og (B) PC-3-celler blev behandlet med 0,2% DMSO (kontrol) eller 70 ug /ml BP i 12 timer, fikseret og farvet med anti-GADD153 /CHOP. FITC-mærket sekundært antistof blev anvendt (grøn fluorescens) Kerner blev farvet med DAPI (blå fluorescens). Billeder blev taget til fange af en konfokal laser mikroskop.

rolle ER stress i BP-medieret anti-spredning

Vi brugte yderligere et siRNA tilgang til fastlægge den rolle, GADD153 i anticancer potentiale BP i prostatacancer. LNCaP-celler blev transficeret med siRNA’er for GADD153 og IRE1-α, henholdsvis med eller uden efterbehandling på 70 ug /ml BP i 48 timer. Western blot analyse viste, at transfektion af si-GADD153 /CHOP resulterede i en undertrykkelse af GADD153 /CHOP ekspression induceret af BP i LNCaP-celler, i sammenligning med celler transficeret med kontrol scrambled siRNA (Fig. 6A). Celledød induceret af BP-behandling blev reddet af 21,18% i celler transficeret med GADD153 /CHOP siRNA sammenlignet med scrambled siRNA-transficerede celler (Fig. 6B). Da GADD153 /CHOP genpromotor indeholder bindingssteder for alle de store induktorer af UPR, og kun IRE1-α blev induceret efter BP behandling (fig. 4), vi yderligere kendetegnet rolle IRE1-α i BP-induceret cellevækst arrestere og celledød. Vi tavshed IRE1-α udtryk ved si-IRE1-α transfektion før 70 ug /m BP behandling. Som vist i fig. 6C, IRE1-a siRNA blokeret betydeligt IRE1-α proteinekspression induceret af BP behandling på en dosisafhængig måde. Desuden blev GADD153 /CHOP også undertrykt af IRE1-α siRNA transfektion. MTT-assay viste, at 11.67 og 20,8% af celledød blev inhiberet med henholdsvis 20 og 50 nM IRE1-a siRNA transfektion efter eksponering af celler for 70 ug /ml bp (fig. 6D). Taget sammen viste disse resultater, at BP-induceret celledød kan være involveret i det mindste delvist, ved induktion af ER stress og opregulering af IRE1-α og GADD153 /CHOP proteiner ekspression.

( A) LNCaP-celler blev transficeret med scramble siRNA (

#), 20, eller 40 nM GADD153 siRNA henholdsvis i 48 timer under anvendelse af RNAiFect transfektionsreagens. Efter 24 timer behandling med 70 ug /ml BP, blev western blot-analyse udført for GADD153. (B) BP-induceret anti-proliferativ aktivitet blev målt med MTT-assay i LNCaP-celler transficeret med scramble siRNA (

#) eller 20 nM GADD153 siRNA i 48 timer og derefter behandlet med 70 ug /ml BP i 24 timer. Data er udtrykt som middelværdier ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. ***,

P

0,001. (C) LNCaP-celler blev transficeret med scramble siRNA (

#), 20, eller 50 nM IRE1-a siRNA, henholdsvis i 48 timer under anvendelse af RNAiFect transfektionsreagens. Efter 24 timers behandling med 70 ug /ml BP, blev western blot-analyse udført for IRE1-α og GADD153 hhv. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (D) BP-induceret anti-proliferativ aktivitet blev målt med MTT-assay i LNCaP-celler transficeret med scramble siRNA (

#), 20, eller 50 nM IRE1-a siRNA, henholdsvis i 48 timer og derefter behandlet med 70 ug /ml BP i 24 timer. Data er udtrykt som middelværdier ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. ***,

P

. 0,001 versus køretøj

rolle MAPK på BP-induceret ER stress og celledød

Aktivering af MAPK’er har været impliceret i reguleringen af ​​ER-stress induceret celledød. Vi undersøgte virkningen af ​​BP på MAPK-aktivering. Eksponering af LNCaP og PC-3-celler til 70 ug /ml BP resulterede i phosphorylering af JNK 1/2 og ERK 1/2, men ikke p38 MAPK (fig. 7A og B). ERK 1/2 phosphorylering efter BP behandling fandt sted ved 10 min og nedregulering optrådte ved 30 minutter. Tværtimod phosphoryleringen af ​​JNK 1/2 opretholdt ved 10 til 180 minutter. For yderligere at karakterisere rollen af ​​JNK 1/2 i BP behandling, vi tavshed JNK 1/2 ekspression ved specifik siRNA transfektion. Som vist i fig. 7C, JNK 1/2 ekspression og phosphorylering efter BP behandling reduceres ved si-JNK transfektion. Derudover BP-induceret ekspression af IRE1-α og GADD153 også reduceres ved si-JNK transfektion. BP-induceret celledød blev reddet af si-JNK transfektion, sammenlignet med scrambled siRNA transfektion (siRNA1: 26,14%, siRNA2:. 20,95%, figur 7D). Disse resultater antyder, at JNK-aktivering er involveret i BP-induceret celledød og deltager i IRE1-α og GADD153 aktivering.

(A) LNCaP-celler og (B) PC-3-celler blev behandlet med 70 ug /ml BP i de angivne tidsrum. Phospho-ERK1 /2, total ERK1 /2, phospho-JNK1 /2, total JNK1 /2, phospho-p38, og total p38 blev påvist ved western blotting hhv. (C) LNCaP-celler blev transficeret med scramble (

#) eller 20 nM JNK1 /2 siRNA i 48 timer under anvendelse af RNAiFect transfektionsreagens. Efter behandling med 70 ug /ml BP i 24 timer blev western blot-analyse udført for phospho-JNK1 /2, total JNK1 /2, IRE1-α og GADD153. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (D) BP-induceret anti-proliferativ aktivitet blev målt med MTT-assay i LNCaP-celler transficeret med scramble (

#) eller JNK1 /2 siRNA i 48 timer og derefter behandlet med 70 ug /ml BP i 24 timer. Dataene blev udtrykt som middelværdi ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. ***,

P

. 0,001 versus køretøj

BP hæmmer væksten af ​​kræftceller i LNCaP-NOD-SCID xenograft

For at vurdere antitumoraktiviteten BP

in vivo

, menneskelig prostatakræft xenograft blev oprettet ved subkutan injektion af 5 x 10

5 LNCaP celler i dorsale subkutane væv af NOD-SCID mus. Som vist i fig. 8A, den relative tumorvolumen i mus behandlet med 500 mg /kg BP var signifikant 68% lavere end de vehikelbehandlede kontrolmus på dag 18. Tumorvægt var signifikant reduceret 56% i BP-behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen på dag 18 (fig. 8B). Tumorerne i kontroldyr blev gradueret som Gleason 5B da ingen kirtelvævet blev fundet (Fig. 8C). I BP-behandlede dyr blev uregelmæssige smeltet kirtler observeret og blev iscenesat Gleason 4A (fig. 8D). Således grader af tumor differentiering af BP-behandlede gruppe var bedre end kontrolgruppen. Desuden, opregulering af GADD153 /CHOP i BP-behandlingen tumor blev observeret ved immunhistokemi-farvning (fig. 8E og F) og western blot-analyse (fig. 8G), hhv. Caspase-3-aktivering blev også observeret i BP-behandling tumor (fig. 8G). Der var ingen signifikante forskelle i kropsvægt i både kontrol og BP-behandlede grupper. Disse resultater indikerede, at BP-induceret prostatacancer celledød var korreleret med ER stress

in vivo

.

(A) NOD-SCID-mus blev injiceret med ca. 5 x 10

5 LNCaP celler i den dorsale subkutane væv. Når tumoren nåede 100-250 mm

3, LNCaP tumorbærende mus blev indgivet s.c. med vehikelkontrol (▪) eller 500 mg /kg BP (•) på dag 0-4 i 5 dage. De relative tumorvolumener kontrol- og BP-behandlede grupper blev vist som middelværdier ± S.D. af tumorvolumen på hvert tidspunkt. (B) Tumorer af kontrol og terapeutiske grupper blev fjernet og vejet på dag 18. Gennemsnitlig tumorvægt fra BP-behandlede gruppe var 56% mindre end kontrolgruppen. Dataene blev udtrykt som middelværdi ± S.D. tumor vægt af kontrollen og de BP-behandlede grupper. **,

P

0,01. (C, D) Tumor vævssnit med HE-farvning af kontrol (C) og terapeutiske grupper (D) .GADD153 udtryk blev immunhistokemisk identificeret i kontrollen (E) og BP-behandlede gruppe (F). De GADD153-positive celler blev farvet brune. Ekspression af GADD153 og aktiv form caspase-3 i LNCaP xenograft tumorvæv blev opreguleret efter BP administration sammenlignet med kontrolgruppen ved Western blotting-analyse (G).

Discussion

Currently nogle lovende naturligt forekommende kosten terapeutiske forbindelser omfatter resveratrol, curcumin, genistein, diallyl sulfid og andre stoffer, som har til fælles evne til at inducere apoptose af cancerceller er blevet udnyttet [15]. I vores tidligere undersøgelser, viste vi, at BP handle kraftigt mod glioblastom multiforme (GBM) hjernesvulster og hepatocellulært carcinom (HCC) tumorer

in vitro

og

in vivo

[5], [6] , [16]. Imidlertid er virkningerne af BP på menneskers prostatacancerceller ikke blevet bestemt. Resultaterne fra denne undersøgelse viste, at BP er cytotoksisk for de tre forskellige prostatacancercellelinjer. Fordi begge androgen-afhængige og -uafhængige prostatacancerceller viste lignende følsomhed over for BP behandling blev inddragelse af androgen vej ignoreret i denne undersøgelse.

Tabet af cellecyklus regulering er kendetegnende for kræft. At undersøge de mekanismer, tegnede sig for virkningen af ​​BP på prostatacancerceller blev cellecyklus overvåget. BP-induceret cellecyklusstandsning blev påvist ved opregulering af p16, p21 og p27, og nedregulering af CDK2 og cyclin D1. P16, p21 og P27 proteiner er cdk-inhibitorer, der negativt regulerer cdk eller cyclin /cdk-komplekset [17]. P16-proteinet, medlem af INK4 familien, binder til cdk4 /6 for at blokere kinaseaktiviteten ved halv-G1-fasen [18]. P21 (CIP1) og p27 (kip1) proteiner binder til cyclin /cdk-kompleks, hvilket resulterer i inhibering af G1 til S faseovergangen via ophævelsen af ​​Rb-phosphorylering af cyclin /cdk-komplekset [19]. Således bør faldet af phosphoryleret Rb skyldes en BP-udløst ekspression af cdk-inhibitorer, som igen sænker aktiviteten af ​​cyclin /cdk-kompleks. Hyppig aktivering af Akt signalvej er blevet rapporteret i mange menneskelige kræftformer [20], [21], og GSK-3β er blevet identificeret som en af ​​Akt s molekylære mål. Akt inaktiverer GSK-3β-aktivitet gennem stedsspecifik fosforylering på Ser9 [22]. Suppression af Akt hvilket fører til at de-phosphorylering og aktivering af GSK-3β årsag phosphorylering af cyclin D1 ved Thr286 og den efterfølgende proteasomalaktivitet nedbrydning [23]. Cyclin D1 er blevet vist at være overudtrykt i mange cancertyper, herunder bryst-, hoved og hals, spiserør og prostata [24],. I denne undersøgelse fandt vi, at BP kan hæmme Akt aktivering ved at reducere Ser473 phosphorylering, og gendanner GSK-3β-kinaseaktivitet ved at reducere Ser9 phosphorylering i prostatacancerceller. Disse data tyder på, at BP undertrykker proliferation prostatacancerceller via standsning af cellecyklus ved at regulere cyclin /CDK /CKI cellecyklus regulatorisk protein og målretning af Akt-GSK-3β-cyclin D1 signalering akse.

For at undersøge de underliggende molekylære mekanismer i BP-induceret prostatacancerceller død, undersøgte vi de BP-inducerede ændringer i genekspression i humane prostatacancerceller under anvendelse af en oligodeoxynukleotid-baserede microarray screeningsassay. Adskillige gener, der viser større end to gange stigning i ekspression efter 24 timer af BP behandling blev identificeret (tabel 1). GADD153 /CHOP viste dramatisk 11,89 folder stigning i ekspression efter BP behandling. GADD153 /CHOP er et gen af ​​interesse, da det er involveret i ER stress-medieret apoptosecyklus. Aktivering af UPR spiller en beskyttende rolle til celler under ER stress [26]. langvarig aktivering af UPR ved overdreven ER stress, kan dog konvertere sin rolle til cytotoksiske ved aktivering af multiple apoptotiske veje i pattedyrceller [27]. De ER stress transducer proteiner ATF6, IRE1-a- og Perk udgør kernen stress regulator af UPR, og transducerer signaler fra ER til cytoplasmaet og kernen efter ER stress [28] – [30]. I vores undersøgelse BP inducerede kun IRE1-α aktivering, men ikke ATF6 eller p-eIF2α i prostatacancerceller. Forøgelse og fastholde udtryk for IRE1-α og dens nedstrøms target GADD153 /CHOP efter BP behandling blev observeret i tids- og dosisafhængig måde. En af de mekanismer, der er impliceret i GADD153 /CHOP-medieret apoptose er oxidativ stress [31]. Oxidation af ER lumen er foranlediget af GADD153 /CHOP nedstrøms target ERO1-Lα. ERO1-Lα er blevet spekuleret at hyperoxidize de ER lumen, og forårsager cytotoksiske reaktive ilt arter (ROS) produktion, der fører til celledød. En anden mekanisme var forbundet med rollen som Bax i GADD153 /CHOP induceret apoptose. I ER-stress-induceret cardiomyocyte aopotosis, Bax stige med ER stress i en GADD153 /CHOP-afhængig måde [32]. Bax og Bak også modulere UPR ved en direkte interaktion med IRE1-α, og er vigtigt bindeled mellem IRE1-α medieret ER-stress-induceret apoptose. Vores resultater viste, at transfektion af siRNA’er for IRE1-α eller GADD153 /CHOP undertrykte BP-induceret celledød. Tilsammen tyder disse resultater på, at BP kan modulere ER stress-medieret apoptose af humane prostata kræftceller gennem aktivering af IRE1-α-GADD153 /CHOP signalvejen.

Behandling med BP udløste øget udtryk af Fas, som førte til aktivering af caspase-8 og -3 i malign hjernetumor i vores tidligere undersøgelse [5]. Fas-overekspression steg også ved 3 timer efter BP behandling. Således BP-induceret apoptose af humane prostatacancerceller kan være medieret, i det mindste delvist, gennem døden receptor apoptose pathway.

Endvidere aktivering af MAPK’er har været impliceret i reguleringen af ​​genekspression i ER stress signalering kaskade og er involveret i mange aspekter af kontrollen af ​​celleproliferation og apoptose. JNK har også vist sig at være en positiv regulator af ER stress induceret apoptose [33]. I vores undersøgelse blev phosphorylering af JNK observeret efter BP behandling. Inhibering af JNK-ekspression ved siRNA førte til nedregulering af IRE1-α og GADD153 /CHOP, og delvist reddet BP-induceret celledød. ER stress-aktiverede IRE1-α binder adapteren proteinet tumornekrosefaktorreceptor-associeret faktor2 (TRAF2), en E3 ubiquitin ligase, som igen aktiverer apoptose signal-regulerende kinase 1 (ASK1; også kendt som MAP3K5), derefter forårsager JNK aktivering. Disse resultater implicerer forestillingen om, at BP-induceret ER stress-mægle celledød via samarbejde med JNK.

tumornekrosefaktor apoptoseinducerende ligand (TRAIL) er en død receptor ligand, der fortrinsvis kan initiere apoptose i forskellige tumorceller. For nylig, TRAIL-baserede terapeutiske, herunder TRAIL genterapi, rekombinant TRAIL, og TRAIL-receptor-agonistiske antistoffer er at indtaste kliniske forsøg [34] – [37]. Men i lighed med mange andre kræftformer, prostatacancer udvikle resistens over for TRAIL [38], [39]. Derfor søger TRAIL sensibilisatorer stand til at overvinde TRAIL modstand i kræftceller er værdifulde. LNCaP vides at være resistente over for TRAIL-induceret apoptose i forbindelse med fraværet af PTEN at fremme konstitutiv aktivering af AKT /PI3K pathway. Da BP effektivt formindsket Akt aktivitet ved at reducere niveauet af phospho-Akt Ser473, hvilket gør BP kandidat TRAIL sensibilisator.

Som konklusion vores undersøgelse viste, at BP 1) forårsager prostatacancer cellecyklusstop ved G0 /G1 fasen ved at målrette Akt-GSK-3β-cyclin D1 signalering akse; 2) inducerer celledød via ER-stress-og JNK-medieret UPR; 3) udløser apoptose af humane prostata kræftceller gennem flere apoptotiske veje

in vitro

in vivo

(fig. 9).

BP inducerer apoptose i human prostatacancerceller gennem flere apoptotiske veje, herunder G0 /G1 fasen cellecyklusstop, død receptor sti og ER stress-afhængige vej.

Materialer og metoder

Cellekulturer og reagenser

Det humane prostatacellelinjer LNCaP og PC-3 blev erhvervet fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 medium med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin, 1% natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin (alle disse reagenser er fra Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO2.