PLoS ONE: FUS /TLS er en co-aktivator af Androgen receptor i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Androgen receptor (AR) er et medlem af den nukleare receptor familie af transkriptionsfaktorer. Ved binding til androgener, AR bliver transkriptionelt aktivt at regulere ekspressionen af ​​target gener, der huser androgen respons elementer (Ares) i deres initiativtagere og /eller forstærkere. AR er afgørende for vækst og overlevelse af prostatacancerceller og er derfor et mål for indeværende og næste generations terapeutiske modaliteter mod prostatacancer. Patofysiologisk relevante protein-protein interaktion netværk med deltagelse AR er dog dårligt forstået. I denne undersøgelse identificerede vi proteinet fusioneret /omplantet i liposarkom (FUS /TLS) som en AR-interagerende protein ved co-immunoudfældning af endogene proteiner i LNCaP humane prostatacancerceller. Den hormonelle respons fra FUS ekspression i LNCaP-celler viste sig at ligne andre AR co-aktivatorer. FUS viste en stærk iboende transaktivering kapacitet i prostatacancerceller når bundet til basale promotorer ved hjælp GAL4-system. Kromatin immunopræcipitationsforsøg viste, at FUS blev ansat til, er III i enhancer region af

PSA

gen. Data fra ektopisk overekspression og “knock-down” tilgange viste, at AR transkriptionsaktivitet blev forstærket af FUS. Udtømning af FUS reduceret androgen-afhængig proliferation af LNCaP-celler. , FUS er således en ny co-aktivator af AR i prostata kræftceller

Henvisning:. Haile S, Lal A, Myung JK, Sadar MD (2011) FUS /TLS er en co-aktivator af Androgen receptor i prostatacancerceller. PLoS ONE 6 (9): e24197. doi: 10,1371 /journal.pone.0024197

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: 11. juli, 2011; Accepteret: August 2, 2011; Udgivet 1. september, 2011

Copyright: © 2011 Haile et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af canadiske Institutes of Health Research giver MOP-79.308. www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Androgen receptor (AR) er påkrævet for overlevelse og vækst af prostatacancerceller. Følgelig kan fremskreden prostatacancer behandles med androgen ablation terapier. Desværre er disse behandlinger i sidste ende mislykkes og sygdommen bliver dødbringende, kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Den mest udbredte understøttet mekanisme bag CRPC involverer AR. Aminoterminalen domæne (NTD) af AR er påkrævet for både ligand-afhængig og ligand-uafhængig aktivitet af receptoren (for en gennemgang se [1]). Således at de nuværende bestræbelser udvikle mere effektive lægemidler mod CRPC er fokuseret på en mere effektiv blokering af androgen syntese, antiandrogener, der kompetitivt binder AR ligand-bindende domæne (LBD) med meget højere affinitet [2], og inhibitorer af AR NTD [3 ]. Fortsatte bestræbelser på at udvikle lægemidler ville drage fordel af en bedre forståelse af de protein-protein interaktion net, der omfatter AR. Til dette formål har vi ansat en proteomisk tilgang og identificerede nye endogene AR interaktion partnere i prostatacancerceller, der omfatter medlemmer af en gruppe af proteiner kaldet FET /TET. Denne familie af proteiner omfatter: Smeltet i sarkom (FUS) /omplantes i liposarkom (TLS), Ewig sarkom protein (EWS), og TATA bindende protein-associerede Factor, TAF15

FET proteiner vise forskellige funktioner, herunder. transkriptionel modulation, splejsning, cellespredning, og DNA-reparation. FET proteiner har lignende transkriptionelle aktiveringsdomæner (TADS) ved deres NTD og RNA genkendelsesmotiv (RRM) og gentagelser af tripeptidet RGG på deres carboxylterminalen [4], [5]. TAD af FET proteiner indeholder XYXXQ-rige motiv, hvor X er en lille aminosyre (Gly, Ala, Ser eller Pro) [6]. Dette motiv deles også med proto-oncoproteinet SYT, den humane nuklear receptor co-aktivator SYT-interagerende protein /Co-aktivator Activator (SIP /CoAA), og SWI /SNF /BAF250 [6]. FET NTDS, herunder de potente TADS, fusioneres til DNA-bindende domæner (DBDS) af forskellige transkriptionsfaktorer i en underklasse af sarcomer og andre kræftformer [5], hvilket fører til hyperaktivering af tilsvarende transkriptionsaktivitet. Ny dokumentation antyder, at native, fuldlængde FET proteiner binde til og aktivere funktionerne af specifikke transkriptionsfaktorer delvis ved at rekruttere co-faktorer, såsom CBP /p300 [4] -. [5]

Resultater

AR og FUS findes i samme proteinkompleks

LNCaP human prostatacancer-cellelinie [7] rekapitulerer vigtige elementer i prostatacancer herunder ekspression af både prostata-specifikt antigen (PSA) og AR samt følsomhed over for androgen. For vores indledende skærm, vi brugte nukleare lysater fra LNCaP-celler, som blev behandlet med det syntetiske androgen R1881 (10 nM) i 3 timer. Lysaterne blev immunpræcipiteret med anti-AR-antistof og prøver blev underkastet flerdimensional protein identifikation teknologi (MudPIT) [8]. Massespektrometrisk analyse identificeret FUS, der hører til FET-familien af ​​proteiner, der interagerer med AR (Figur 1 A, figur S1, figur S2 og tabel 1). Co-immunopræcipitationsforsøg (fælles IP) eksperimenter efterfulgt af Western blot-analyse valideret samspil mellem AR og FUS (figur 1B). AR co-immunpræcipiteret (co-IP) med FUS, hvorimod immunopræcipitation med isotype IgG kontrol ikke pull-down AR eller FUS. Reverse co-IP med anti-AR efterfulgt af Western blot-analyse med anti-FUS-antistof viste også, at AR interagerede med FUS (figur 1C). I overensstemmelse med tidligere rapporter, behandling med R1881 forbedrede niveauer af AR protein.

In vivo

sammenslutning af FUS med AR blev bekræftet ved hjælp af ekstrakter af LNCaP xenografter, der blev dyrket i mus før eller efter kastration (Figur 1D). Sammen disse data understøtter, at AR og FUS associeret inden for samme kompleks i prostata kræftceller.

(A) Identifikation af FUS som AR-interagerende protein ved co-immunopreciptation (Co-IP) efterfulgt af massespektrometri ( FRK). MS /MS spektre af m /z 1660,77 (fra 831,39, 2+) i FUS og to andre, der er vist i supplerende materiale blev entydigt tildelt den identificerede sekvens LKGEATVSFDDPPSAK, APKPDGPGGGPGGSHMGGNYGDDR, og TGQPMINLYTDR hhv. (B) Validering af AR-FUS interaktion under anvendelse Co-IP efterfulgt af western blot analyse. LNCaP-celler i kultur blev induceret med 10 nM R1881 i 6 timer og hele lysater blev anvendt til IP med anti-FUS-antistof efterfulgt af anti-AR western blot (WB) analyse. (C) Reverse IP med anti-AR efterfulgt af WB med anti-FUS-antistof. (D) IP af endogene komplekser af AR og FUS fra subkutane LNCaP-xenotransplantater. Tumorer blev høstet fra intakte mus (I), 10 dage efter kastration (C10) eller 30 dage efter kastration (C30). Lysater fra disse tumorer blev individuelt bruges til IP med anti-AR-antistof efterfulgt af WB med angivne antistoffer.

Subcellulær lokalisering af FUS i prostata cancer celler

FET proteiner kan være lokaliseret divergerende i kernen og /eller cytoplasma [5], [9]. Immunfluorescensmikroskopi anvendelse af antistoffer rettet mod endogene proteiner blev udført i LNCaP-celler. FUS udelukkende blev lokaliseret til kernen (figur 2A). FUS syntes at være lokaliseret i adskilte prikker i kernen (figur 2A, B). Heterogenitet sub-nukleare fordeling af FUS blandt cellepopulationen blev observeret (figur 2A, B). Dual-farvning viste co-lokalisering af AR med FUS (figur 2B) i LNCaP-celler, som blev behandlet med 10 nM R1881 i 3 timer. Pearsons koefficient nærmede 0,8 i nogle celler inden for specifikke områder af kerner.

(A) Nuklear lokalisering af FUS i LNCaP celler. Celler blev behandlet med R1881 (10 nM) i 3 timer. Konfokal immunofluorescens blev udført ved anvendelse af anti-FUS-antistof (grøn) og cellerne blev modfarvet med DAPI (blå). (B) co-lokalisering af AR og FUS. Dual farvning viser co-lokalisering af AR (rød) med FUS (grøn) i LNCaP-celler behandlet med 10 nM R1881 i 3 timer. Den indsatte i højre panel repræsenterer cellen, der er udpeget med (*) efter tærskel gating at fjerne den lyse centrale grønne plet.

FUS har iboende transaktiveringsaktivitet i prostatacancerceller

TADS af FET proteiner kan give robust transkriptionel transaktivering i nogle tumorer [4] – [5], men dette er ikke blevet udforsket i prostata kræftceller. Her har vi ansat den GAL4 transaktiveringsfunktion assay for at udforske, hvis transaktiveringsaktivitet kunne tilskrives FUS i prostata kræftceller. Kimære konstruktioner, der huser fuld længde FUS (eller fragmenter deri) fusioneret til GAL4-DBD blev anvendt til dette assay (figur 3A). PC3 prostatacancerceller, blottet for funktionel AR, blev co-transficeret med hver af Gal4 fusionskonstruktioner, og et reportergen indeholdende de minimale Gal4-bindingssteder (p5 × Gal4UAS-TATA-luciferase). GAL4-DBD alene blev anvendt som en negativ kontrol og det havde minimal aktivitet (figur 3B). I modsætning hertil Gal4-FUS inducerede luciferaseaktivitet signifikant (figur 3B), som var i overensstemmelse med det med grænseviskositetstal transaktiveringsaktivitet. Til at begynde at afgrænse hvilke domæne (r) redegør for denne iboende transaktiveringsfunktion kapacitet, vi ansat to konstruktioner. Den første konstruktion havde NTD transaktiveringsdomænet (FUS-N) og den anden indeholdt den carboxylterminale RRM og RGGs (FUS-C) (figur 3A). Begge fragmenter viste aktiviteter, der var sammenlignelige med fuld længde FUS (figur 3B). For at vurdere promotor sammenhæng afhængighed af disse aktiviteter, vi ansat en anden journalist, der indeholder de minimale GAL4 bindingssteder og en TATA element, der blev sidestillet i E1a promotor. Tilsvarende, omend generelt højere, iagttoges transaktivering kapacitet i forbindelse med denne promotor som i den minimale promotor (figur 3C). Stærk transaktivering kapacitet af GAL4-FUS-fusioner blev også vist i LNCaP-celler (figur 3D).

(A) Kimære konstruktioner af fuld-længde FUS, N- eller C-fragmenter af FUS fusioneret til Gal4 DBD . TAD = transaktiveringsdomæne; RRM = RNA genkendelsesmotiv; RGG = gentagelser af et tripeptid indeholdende arginin og to glyciner. (B) transaktiveringsaktivitet af FUS i PC3-prostatacancerceller. PC-3-celler i 6-brønds plader blev co-transficeret med 50-100 ng Gal4 kimæren, og 1 ug af reportergenet PFR-LUC, som indeholder GAL4-bindingssteder og en TATA element. GAL4 DBD alene tjente som en negativ kontrol. 2 ug pGL2 tom plasmid blev tilsat til alle DNA blandinger. (C) Som i (B), men reporterplasmidet indeholdt Gal4-bindingssteder og TATA element sidestillede i E1a-promotor. (D) Som i (B), men med LNCaP stedet for PC-3-celler. Kolonner = middelværdi ± standardafvigelse. * P 0,05, n = 3.

FUS fremmer AR transkriptionel aktivitet i prostatacancerceller

Efter at have demonstreret en transaktiveringsfunktion kapacitet på FUS, der var uafhængig af promotoren i prostatacancerceller som beskrevet ovenfor, vi næste evalueret inddragelse af FUS specifikt i AR transkriptionsaktivitet på målgener. To forskellige siRNA’er rettet mod uafhængige regioner af det beslægtede mRNA blev anvendt til at depletere niveauerne af FUS. AR-aktivitet blev målt i co-transficerede LNCaP-celler under anvendelse af PSA (6,1 kb) -luciferase reportergenkonstruktion. Denne reporter indeholder PSA promoter- og enhancer-regioner, der huser flere ARE’er der bibringer induktion af androgener [10] – [11] i en AR-afhængig måde [12] – [13]. I forhold til kontrollen blev R1881 induktion af luciferaseaktivitet reduceres betydeligt ved udtømning af FUS uden at reducere niveauer af AR (figur 4A). For at underbygge disse resultater med en overekspression tilgang, vi co-transficeret AR ekspressionsvektor, den ARR3-tk-LUC reporter plasmid, og forskellige mængder af et plasmid tillader His-mærket FUS udtryk i HEK293 celler. Den ARR3-tk-LUC reporter indeholder seks ARE’er og er yderst inducerbar med androgener. Overekspression af FUS steg AR transcriptional aktivitet målt som luciferaseaktivitet fra ARR3-tk-Luc på en dosis-afhængig måde (figur 4B, øvre og midterste paneler). His-FUS ændrede ikke signifikant den transskriptionelle aktivitet ved pRL-tk-Luc, som udelukkende indeholder thymidinkinase (tk) basal promotor (figur 4B, nedre panel).

(A) Udtømning af FUS korrelater med nedsat AR aktivitet. Niveauer af FUS blev reduceret i LNCaP-celler ved anvendelse af siRNA’er rettet mod to forskellige regioner i de respektive mRNA’er og efterfølgende transficeret med 1 ug plasmid til PSA (6.1) -luciferase. 2 ug p-LUC tom plasmid blev tilsat til alle siRNA /DNA blandinger. Mængder er pr brønd i en 6-brønds plade. Celler blev behandlet med 10 nM R1881 i 24 timer. Western blot analyse af de tilsvarende prøver viser niveauer af FUS, AR, og actin. (B) Ektopisk ekspression af FUS forøger AR-aktivitet. 293FT celler i en plade med 48 blev transficeret med 15 ng AR ekspressionsplasmid, 620 ng ARR3-tk-luciferase reporter plasmid, 62 ng Renilla luciferase plasmid og angivet mængder af His-FUS ekspressionsplasmid. Luciferaseaktiviteter blev normaliseret med dem fra Renilla luciferase der indeholder den minimale TK-promotor. Værdier over hver sorte bjælke repræsenterer fold-induktion ved R1881 efter normalisering (øverste panel). Western blot analyse af de tilsvarende prøver viser niveauer af FUS, AR, og actin (midterste panel). UT: utransficerede celler. Renilla luciferase-aktivitet fra de samme prøver normaliseret til totalt protein tjente som en specificitet kontrol (nederste panel). Kolonner = middelværdi ± standardafvigelse. * P 0,05, n = 3.

For at bestemme om FUS øger ekspressionen af ​​endogene gener, niveauer af protein og mRNA af kendte androgen-regulerede gener blev næste målt.

PSA

mRNA og mRNA fra fem andre androgen-inducerbare gener blev reduceret signifikant ved nedbrydning af FUS (figur 5A).

TMPRSS2

mRNA blev reduceret med kun én af de siRNA’er, og androgen-undertrykt gen,

CAMK2N1

blev ikke påvirket af nogen af ​​de siRNA’er (data ikke vist). I overensstemmelse med reducerede niveauer af mRNA, niveauer af PSA-protein blev signifikant reduceret i LNCaP-celler ved udtømning af FUS (figur 5B). At afgøre, om FUS blev rekrutteret til DNA med AR som reaktion på androgen blev kromatin immunofældning (chip) assay udføres. Immunopræcipitation af tværbundne protein-DNA-komplekser under anvendelse af et antistof mod FUS efterfulgt af amplifikation af ARE III i

PSA

genet afslørede, at FUS blev rekrutteret til dette ER (figur 5C). Kollektivt antyder disse data, at FUS forøger AR-aktivitet, i det mindste på nogle målgener, konsistent med den stærke indre transaktiveringsfunktion tilskrives FUS (fig. 3).

(A) mRNA-niveauer af androgen regulerede gener. siRNA medieret udtømning af FUS falder beslægtet mRNA for PSA og flere andre AR målgener. QRT-PCR blev anvendt til at måle mRNA niveauer. Værdier repræsenterer forhold mellem GAPDH-normaliseret signaler til sådanne afledt af mocktransfekterede LNCaP-celler. Celler blev behandlet i 24 timer efter siRNA transfektion. (B) PSA-proteinniveauer. LNCaP-celler blev behandlet i 8 timer med 10 nM R1881 eller køretøj følgende siRNA transfektion og Western blotting blev udført for at måle PSA niveauer. (C) FUS rekrutteres til forstærker ER III i

PSA

gen. LNCaP-celler blev behandlet med 10 nM R1881 i 6 timer. Chip blev efterfølgende anvendt og mål-DNA blev forstærket af qPCR. Værdierne repræsenterer forholdet mellem signaler fra anti-FUS chip til at den for IgG isotypekontrol. Kolonner = middelværdi ± standardafvigelse. * P 0,05, n = 3.

Udtømning af FUS reducerer spredning af LNCaP celler

AR er afgørende for væksten af ​​LNCaP celler [14]. At vurdere, om nedsat AR aktivitet efter udtømning af FUS ville resultere i nedsat proliferation, udførte vi celle-cyklus-analyse under anvendelse af flowcytometri. Som forventet R1881 (0,1 nM) øgede populationen af ​​celler i S-fase (data ikke vist), som blev reduceret med -30% ved udtømning af FUS (figur 6A). Bemærkelsesværdige blev data indhentet fra forbigående transfektion af siRNA resulterer i relativt ineffektiv udtømning af FUS (figur 6B). Disse data implicerer en vækstfremmende funktion af FUS på androgen-afhængig proliferation, hvilket er i overensstemmelse med forøget AR transkriptionsaktivitet.

(A) Flowcytometrisk kvantificering af S-fase celler. siRNA-transficerede LNCaP-celler blev behandlet med 0,1 nM R1881 i 48 timer. Celler blev mærket med BrdU, farvet med FITC-konjugeret anti-BrdU antistof og DAPI, og udsat for flowcytometri. Grafen til højre viser kvantificering S-fase celler som en procentdel af de respektive kontroller. * P 0,05, n = 3. (B) Niveauer af FUS-protein i celler behandlet med FUS siRNA. Western blot analyse af niveauer af FUS og lastning kontrol actin svarer til prøverne, hvis celle-cyklus profil er plottet i (A).

Hormon-reaktionsevne FUS udtryk

Angivelse af nogle AR co-aktivatorer, såsom steroid receptor co-aktivatorer (SRC) moduleres af androgener og /eller AR [15] – [17] som led i hvad der synes at være et netværk af feed-forward og feed-back mekanismer. FUS udtryk, på mRNA (figur 7A, øverste panel) og protein niveauer (Figur 7A, midterste panel), blev undertrykt

in vitro

i LNCaP celler efter 48 timers behandling med 10 nM R1881. Behandling af LNCaP-celler med 0,1 nM R1881 for tilsvarende tidsrum (48 timer), havde imidlertid ubetydelige virkninger på ekspression af FUS-ekspression (figur 7A, nedre panel). Immunhistokemi blev ansat til at vurdere FUS genekspression i LNCaP xenografter. Tumorprøver blev fremstillet fra intakte (ikke-kastrerede) og kastrerede mus (10 dage efter kastrering). I overensstemmelse med

in vitro

data med 10 nM R1881, kastration resulteret i øget ekspression af FUS (Figur 7B).

(A) FUS mRNA-niveauer i respons på androgen behandling. Øvre panel: FUS-ekspression blev målt ved QRT-PCR i LNCaP-celler behandlet med 10 nM R1881 for de angivne tidspunkter. Midterste panel: Western blot analyse af niveauer af FUS, PSA og Actin proteiner ved de angivne tidspunkter. Nedre panel: Western blot analyse af niveauer af FUS-protein i LNCaP-celler, som blev behandlet med 10 nM versus 0,1 nM i 48 timer. Fejl barer = middelværdi ± standardafvigelse. * P 0,05, n = 3. (B) FUS niveauer i respons på hormonel status

in vivo

. LNCaP xenografter høstet fra intakte (ikke-kastrerede) og kastrerede mus (10 dage efter kastration) blev farvet for FUS og AR proteiner. (C) FUS-niveauer i klinisk prostatacancer versus tilsvarende godartet væv. Niveauer af FUS mRNA i kliniske prøver af prostata karcinom versus normale prostatavæv blev re-analyseret fra tidligere opnåede datasæt ved hjælp Oncomine. Sorte bjælker indikerer undersøgelser, hvor FUS var signifikant overudtrykt i kræft versus godartet væv. * P. 0,05

FUS udtryk har tendens til at være højere i prostata karcinom versus godartet væv

For at bestemme, hvis forekomsten af ​​FUS ændres i kræft i forhold til benign prostata væv, Oncomine database analyse blev udført ved anvendelse af syv forskellige kliniske kohorter. Ekspression af FUS blev forhøjet i prostata karcinom i forhold til godartede væv ved hjælp af data fra tre studier (Figur 7C). Men i fire yderligere undersøgelser af sammenlignelig størrelse, var der ingen signifikant forskel mellem niveauerne af FUS mRNA i prostata karcinom i forhold til niveauet i benign prostata væv.

Diskussion

AR er afgørende for alle faser af prostatakræft progression herunder den terminale CRPC fase. Til grund for denne rolle AR er et dynamisk samspil med en række co-aktivatorer og co-repressorer. Omfanget af patofysiologisk relevante protein-protein-interaktion involverer AR i prostatacancerceller er imidlertid ikke helt kendt. Her viser vi for første gang, at FUS interageret med AR endogent i prostatacancerceller og videre afslørede følgende: (1) FUS havde iboende transaktiveringsfunktion kapacitet i prostata kræftceller; (2) FUS forbedret AR-medieret transkription; (3) udtømning af FUS reducerede niveauer af ekspression af androgen-inducerede gener; (4) FUS blev rekrutteret til Ares reaktion på androgen; (5) reduktion af niveauer af FUS begrænset androgen proliferation; (6) niveauer af FUS blev ændret ved androgen status

in vitro

in vivo

; og (7) niveauer af FUS var forhøjet i kliniske prøver af prostatakræft.

De DNA-bindende domæner (DBD) steroid receptorer udviser høj sekvenshomologi (f.eks AR DBD har 77% og 57% sekvens lighed med dem, glucocorticoidreceptor og østrogenreceptor, henholdsvis), og kan interagere med mange af de samme coaktivatorer. Ved anvendelse af rekombinante proteiner, er FUS blevet vist at interagere med DBDS af retinoid X, østrogen, skjoldbruskkirtel, og glucocorticoidreceptorer, men AR blev ikke undersøgt [18]. Binding af FUS til DBDS af andre hormonreceptorer ikke interfererer med DNA-bindende aktiviteter, selv om den rolle, FUS i deres transkriptionelle aktiviteter ikke blev vurderet [18].

Her viser vi, at FUS huser stærke transaktiveringsassays domæner der var funktionelle i prostatacancerceller. Den C-terminale region indeholdende RRM og RGG motiver af EWS kan undertrykke transaktivering kapacitet NTD i kaninnyre-afledte RK-13-celler [19]. I modsætning hertil blev der her ingen undertrykkende funktion af C-terminale område observeret ved sammenligning fuld længde FUS til FUS 1-273 fragmentet, som mangler den C-terminale RRM og RGG motiver. Desuden FUS 274-526, der indeholder de RRM og RGG motiver, men ikke TAD, viste en stærk transaktiveringsfunktion kapacitet. Lignende struktur og funktion forholdet data, der omfatter FUS blev tidligere rapporteret ved brug af humane embryonale nyre 293 celler [20]. Der er således funktionelle transaktiveringsassays domæner i FUS andre end dem, der findes i dens NTD mindst i prostatakræft og 293-celler. Uoverensstemmelser i litteraturen mellem FUS og EWS transaktiveringsassays domæner kan være celle-specifikke eller reflektere domænenavn divergens (45% identitet; 64% lighed) [5] mellem EWS (et 699 aa lang protein) og FUS (et 526 aa lang protein).

Angivelse af forskellige co-regulatorer af AR er lydhøre over for androgener måske som en del af foder-back mekanismer [15] – [17]. Ekspression af FUS er lydhøre over for hormon status i prostata kræftceller. Ved fysiologiske niveauer af androgen, blev FUS udtryk rapporteret at blive reduceret betydeligt i LNCaP celler behandlet for 48-96 timer med 10 nM mibolerone [21], som også er vist her med 10 nM R1881 (fig. 7A). Men en lavere koncentration af androgen, 0,1 nM R1881, ændrede ikke signifikant niveauer af FUS

in vitro

, og

in vivo

kastreringsområdet niveauer af androgen var forbundet med øgede niveauer af FUS. Dette udtryk profil ligner tidligere karakteriserede AR co-aktivatorer, der er moderat undertrykt af androgener [15] – [16]. Interessant, undertrykkelse af disse co-aktivatorer af androgener er med en langsommere kinetik ligner den for androgen-responsiv ekspression af FUS. Analyse af indholdet af FUS mRNA i forskellige prostata- og ikke- prostata cancer-cellelinier afslørede ikke systematiske forskelle (Fig S3). I overensstemmelse med dette, gjorde Oncomine data mining af microarrays fra kliniske prøver af forskellige faste tumortyper ikke signifikant op eller nedregulering FUS niveauer i prostata tumorer i forhold til andre tumortyper (Fig S4). I modsætning hertil sammenligning af mRNA data fra godartet versus adenocarcinom prostatavæv afsløret opregulering af FUS i tre uafhængige undersøgelser og ingen signifikant forskel i fire andre. Ingen undersøgelse viste signifikant fald i ekspressionen af ​​FUS i prostata adenocarcinom versus godartet væv.

AR transkriptionsaktivitet kræves til vedligeholdelse og vækst af prostata, som danner grundlaget for androgen ablation behandlinger for prostatakræft. I overensstemmelse med FUS er en coaktivator af AR og dens udtømning reducerende AR transkriptionel aktivitet og androgen-afhængige vækst som vist her, blandt de fremtrædende fænotyper i FUS – /- mus er hanlig sterilitet, og mindre mandlige kønsorganer med tilsyneladende involution af nogle af disse strukturer [22]. Disse fænotyper er minder om AR – /- mus eller mere raffineret domæne- og celletype-specifik

AR

gen afbrydelser [23] – [24]. Således er det muligt, at udtømning af FUS nedsætter AR transkriptionel aktivitet i disse klassiske androgenafhængige væv i overensstemmelse med de data, der præsenteres her. Disse data er i modsætning til en tidligere rapport, at FUS overekspression i LNCaP-celler, under anvendelse af et tetracyclin-inducerbare system og efterfølgende behandling med 10 nM mibolerone i fire dage, fører til fremkomsten af ​​sub-G1 /apoptotiske celler [21]. Interessant nok blev påvist nogen sub-G1 /apoptotiske celler i fraværet af androgen, med eller uden FUS overekspression [21]. Således FUS overekspression i disse undersøgelser førte til en androgen-inducerbar pro-apoptotisk virkning og ændringer i ekspression af cellecyklusproteiner [21].

Generelt mens yderligere undersøgelser er nødvendige for at løse rolle FUS i prostata cancer sygdomsprogression, denne undersøgelse viste, at: 1) FUS interagerer med Ar; og 2) FUS øger transkriptionel aktivitet af AR.

Materialer og metoder

Plasmider, cellekultur og transfektioner

FUS ekspressionsplasmider [20], p5 × Gal4UAS-TATA -luciferase [12], og AR ekspressionsvektor, ARO, [25] er tidligere blevet beskrevet. PFR-LUC blev opnået fra Invitrogen, Carlsbad, CA, USA. AR reporterplasmid, PSA (6,1 kb) -luciferase indeholder promotor /enhancer regioner af PSA-genet og blev leveret af Dr. J.-T. Hsieh (University of Southwestern Medical Center, Dallas, TX). ARR3-tk-Luc indeholder tre kopier af androgen respons region af rotte

probasin

genet fusioneret til det basale thymidinkinase (TK) promotor [26].

LNCaP-celler, opnået fra Dr. Leland WK Chung (Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, CA, USA), blev dyrket i RMPI indeholdende 5% føtalt bovint serum (FBS) og blev anvendt ved passage 39-50. HEK293-celler blev opretholdt i DMEM indeholdende 10% FBS. Medmindre andet er angivet, blev cellerne inkuberet i serumfrit, phenol-rød frie medier i 24-48 timer før behandling med angivne koncentrationer af R1881. Transfektion af LNCaP-celler blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) for forsøg med siRNA’er eller lipofectamin (Invitrogen) for alle andre som pr fabrikantens anvisninger ved 0,2-0,4% og 0,5% (vol /vol) hhv. FUS (HSC.RNAI.N001170634.11.7; HSC.RNAI.N001170634.11.8) og kontrol-siRNA’er (Invitrogen) blev anvendt i 10-50 nM koncentrationer. HEK293-celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 kl 0,4% v /v. Nøjagtige mængder af plasmider pr transfektion er angivet i Figurtekster.

Kvantitativ RT-PCR

Samlet RNA blev fremstillet ved anvendelse af RNeasy mini kit (Invitrogen). Totalt RNA (0,5 ug) blev revers-transskriberet via oligo-dT-priming ved anvendelse af SuperScript III kit (Invitrogen). PCR blev udført under anvendelse af genspecifikke primere i nærvær af SYBR Green Supermix (Invitrogen) under anvendelse af ABI 7900 real-time PCR-maskine (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Termocyklingen protokol var som følger: ved 95 ° C i 2 min, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 55 ° C i 30 sek. Ct (tærskel cyklus nummer) værdier blev konverteret til at betyde udtryk værdier i forhold til

GAPDH

niveauer i henhold til Pfaffl metoden. FUS primere [5] og alle andre primere er tidligere blevet beskrevet [27] – [28]

Immunofluorescens

Celler blev vasket med PBS og fikseret i 1% paraformaldehyd i PBS i 30 min. . Celler blev permeabiliseret i 0,1% Trition X-100 i PBS to gange i 5 min. Efter blokering i 30 minutter i 2% BSA i PBS indeholdende 0,1% Trition X-100 blev prøver inkuberet med de angivne antistoffer (1:50) i blokerende buffer i 1 time. Celler blev vasket med blokerende buffer 4 gange og inkuberet med passende sekundær FITC eller rhodamin-konjugeret IgG (1:100) i blokerende buffer i 45 minutter. Efter 4 vaske med PBS indeholdende 0,1% Trition X-100, blev DAPI-holdige monterings opløsning tilsat. Slides blev visualiseret ved hjælp af hjælp FluoView konfokal mikroskop (Olympus, Markham, ON, Canada).

Co-Immunpræcipitation og chromatin immunopræcipitationsassay

LNCaP celler (2-3 x 10

6) blev udpladet i 15 cm skåle med RPMI indeholdende 5% FBS. Efter 24 timer blev mediet ændret til serum- og phenolrødt-frit RPMI, og cellerne blev inkuberet i yderligere 24 timer. Celler blev efterfølgende behandlet med R1881 (10 nM) eller dets vehikel (ethanol) i 6 timer. Celler blev skyllet med PBS før høst og derefter lyseret med 1 ml lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,8, 140 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,5% Nonidet P-40) i nærvær af en cocktail af proteaseinhibitorer (Roche, Mississauga, ON, Canada). Lysater blev passeret gennem 27-G nåle fem gange og blev derefter præ-clearet med protein A /G agarose-kugler (5% v /v) og en blanding af mus og kanin IgG (2 ug /ml hver) i 1 time. Den resulterende supernatant blev inkuberet med de angivne specifikke antistoffer, herunder AR 441, AR C19, og FUS (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) ved en koncentration på 1-2 ug /ml i 16-24 timer. Protein A /G agaroseperler (5% v /v) blev efterfølgende tilsat, og inkuberet i yderligere 3 timer blandingen. Perlerne blev vasket med 1 ml af lysisbuffer fem gange og derefter resuspenderet i 40-80 pi standard SDS-prøvebuffer.

chromatin immunoprecipitation assay blev udført som beskrevet [27]. Kort beskrevet blev celler behandlet med R1881 (10 nM) eller vehikel i 6 timer og blev efterfølgende fikseret med formaldehyd at tværbinde kromatin. Efter lydbehandling til at forskyde chromatin /DNA, blev lysater fremstillet og immunudfældet med de angivne antistoffer. Mål-DNA blev målt ved real time PCR under anvendelse af ABI 7900 real-time PCR-maskine (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Værdier blev normaliseret mod signal fra den respektive IgG kontrol.

Western blot-analyser

Prøver blev fyldt i 10% Tris /glycin-baserede SDS-polyacrylamidgeler. Proteiner blev overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) i overensstemmelse med standard protokoller under anvendelse Tris /glycin-baserede overførselsbuffer i Bio-Rad ubåd systemet (Mississauga, ON, Canada). Blots blev probet med følgende antistoffer: AR PG21 (1:1000) (Upstate Biotechnology, Waltham, MA, USA); AR 441 (1:500), eller FUS 4H1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology Inc.).

spredning assay

LNCaP celler (5 x 10

5) i 10