PLoS ONE: repertoire af microRNA i Epithelial kræft i æggestokkene, som bestemt ved Next Generation Sequencing af små RNA cDNA biblioteker

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er små regulatoriske RNA, der er impliceret i kræft patogenese og har for nylig vist lovende som blod-baserede biomarkører for påvisning af kræft. Epitelovariecancer er en dødelig sygdom, for hvilken forbedrede resultater kunne opnås ved en vellykket tidlig opsporing og øget forståelse af molekylær patogenese, der fører til bedre behandlinger. Et afgørende skridt i retning af disse mål er at etablere et overblik over miRNA udtrykt i epitelial kræft i æggestokkene væv samt i normale ovarie overflade epitelceller.

Metode

Vi brugte massivt parallelle pyrosekventering (dvs. , “454 sekventering”) for at opdage og karakterisere nye og kendte miRNA udtrykt i primære kulturer af normal human ovarie overflade epitel (slange) og i væv fra tre af de mest almindelige histotypes af ovariecancer. Deep sekventering af små RNA-cDNA-biblioteker afledt af normal slange og ovariecancer prøver gav i alt 738.710 af høj kvalitet sekvens læser, genererer omfattende digitale profiler af miRNA udtryk. Expression profiler for 498 tidligere kommenterede miRNA blev afgrænset og vi opdagede seks nye miRNA og 39 kandidat miRNA. Et sæt af 124 miRNA blev udtrykkes forskelligt i normale versus kræft prøver og 38 miRNA blev differentielt udtrykt tværs histologiske undertyper af kræft i æggestokkene. Taqman QRT-PCR udført på en delmængde af miRNA bekræftede resultater af sekventering-baserede undersøgelse.

Konklusioner

Denne rapport udvider kroppen af ​​miRNA er kendt for at blive udtrykt i epitelial kræft i æggestokkene og giver en nyttig ressource for fremtidige studier af den rolle, miRNA i patogenesen og tidlig påvisning af kræft i æggestokkene

Henvisning:. Wyman SK, Parkin RK, Mitchell PS, Fritz BR, O’Briant K, Godwin AK, et al . (2009) Repertoire af microRNA i Epithelial kræft i æggestokkene, som bestemt ved Next Generation Sequencing af små RNA-cDNA biblioteker. PLoS ONE 4 (4): e5311. doi: 10,1371 /journal.pone.0005311

Redaktør: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Children Research Foundation, USA

Modtaget: November 23, 2008; Accepteret: 7 feb 2009; Udgivet 23. april, 2009

Copyright: © 2009 Wyman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Omkostningerne af sekventering blev delvist afholdt af Roche. Undersøgelsen blev støttet delvist af kræft i æggestokkene SPORE på Fox Chase Cancer Center (P50 CA083638), Pacific æggestokkene Cancer Research Consortium æggestokkene SPORE (P50 CA83636 til NU og MT), Kromosom Metabolisme Training Grant 5 T32 CA09657-16 (til SKW ), et fællesskab fra Merck Research Laboratories (SKW), og af Fred Hutchinson Cancer Research center og Canary Foundation finansiering (Ny udvikling midler til MT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. M. Tewari er en betalt medlem af Scientific Advisory Board of Combimatrix, Inc.

Introduktion

epitelovariecancer er den hyppigste årsag til gynækologisk cancer-relaterede dødsfald i USA [1], med sene diagnoser har en 30% fem år overlevelsesraten [2]. Overlevelsesrater kunne forbedres ved en bedre forståelse af molekylær patogenese, hvilket kan føre til udvikling af overlegen målrettede behandlinger, såvel som ved tidligere påvisning af sygdom ved en kirurgisk hærdelig fase. Når opdages på et stadium, hvor sygdommen er begrænset til æggestokkene, for eksempel de femårige overlevelse stiger til 80%. Klinisk effektive biomarkører for tidlig påvisning af kræft i æggestokkene kan væsentligt forbedre overlevelseschancerne og æggestokkræft biomarkør opdagelse er et vigtigt område for igangværende forskning [3].

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små (-22 nt) ikke-kodende RNA-molekyler, der virker efter transkriptionelt at regulere genekspression [4]. MikroRNA’er stammer fra hårnål RNA forstadier, der behandles for at generere både det funktionelle modne miRNA og en miRNA “stjerne form” af tilsvarende længde afledt af den modsatte streng af hårnålen. har vist sig MicroRNA-medieret modulering af biologiske systemer, der skal forstyrres på flere sygdomme [5], herunder cancer [6] – [8]. Expression mønstre af miRNA korrelerer med væv af oprindelse [8], [9], prognose [10], [11] og med kliniske kræft adfærd [12], hvilket gør miRNA værdifulde vævsbaseret biomarkører. Desuden har vi og andre nyligt vist, at tumorafledte miRNA ind i blodbanen på målelige niveauer, hvilket indikerer, at miRNA udgivet af tumorvæv repræsenterer en kraftfuld ny klasse af blod-baserede, minimalt invasive biomarkører til detektering cancer [13] – [16] . Som sådan er der er et stærkt incitament for en omfattende analyse af miRNA repertoire udtrykt i epitelial kræft i æggestokkene.

Flere nylige rapporter er begyndt at karakterisere miRNA udtryk i kræft i æggestokkene ved hjælp af microarrays plettede med sonder til et varierende antal kendte miRNA [17] – [20]. Selv om disse er banebrydende studier, de har også begrænsninger. Den forreste af disse er, at alle arrays rapporteret til dato har ufuldstændig dækning af kendte miRNA. Af de 959 miRNA og stjerne former i miRBase (frigive 12,0) [21], [22], de fleste microarray platforme anvendt til dato assay kun et par hundrede miRNA, med den mest omfattende af de arrays analysering 470 miRNA og stjerne former. Desuden microarray tilgange eneste foranstaltning tidligere identificerede miRNA og er ikke udstyret til at opdage og profilere nye miRNA. Dette er en vigtig forskel at gøre, da flere rapporter tyder på, at et betydeligt antal miRNA, især dem, der kan være celletypespecifik i udtryk, mangler at blive opdaget [23], [24]. Endelig på grund af den lille størrelse af miRNA og udfordringerne ved at opnå ensartede hybridiseringsbetingelser tværs af en hel miRNA microarray, er der potentiale for krydshybridisering af miRNA, der er stærkt relateret i rækkefølge, hvilket gør det til tider umuligt at endeligt skelne mellem miRNA afviger med en eller to nukleotider.

for at overvinde de begrænsninger, der er forbundet med microarray studier, vi brugte “næste generation” sekventering teknologi (specielt massivt parallel pyrosekventering ved hjælp af 454 Life Sciences platform) af små RNA-cDNA-biblioteker til mere omfattende karakterisere miRNA ekspression i epitelial ovariecancer, såvel som i primære kulturer af normale ovariale overflade epitelceller. Denne tilgang, som er baseret på fem og 3’universel linker ligation /RT-PCR og optælling af sekvens læser opnået for forskellige miRNA, kan i teorien fange alle miRNA til stede i de RNA-prøver (herunder dem af nye sekvens) og tillader præcis identifikation af miRNA, selv når en afvigelse på kun et enkelt nukleotid. Vi genererede i alt 738.710 sekvens læser fra fire små RNA-cDNA-biblioteker, der repræsenterer normal primære humane ovarie overflade epitel (HOSE) kulturer og tre almindelige epitelial ovariecancer undertyper (serøs, klar celle- og endometrioide). Her beskriver vi resultaterne af denne indsats, herunder identifikation og profilering af både tidligere kommenteret og nye miRNA udtrykt i kræft i æggestokkene.

Metoder

Yderligere oplysninger om cellekultur, RNA isolering, små RNA cDNA-bibliotek konstruktion, massivt parallelle sekventering beregningsmæssige rørledning beskrivelse og miRNA TaqMan kvantitativ revers-transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) er tilvejebragt i detaljer i supplerende metoder S1 og i [23].

Cellekultur og klinisk materialer

normale primære humane ovarie overflade epiteliale (slange) celler blev opnået fra de normale ovarier af postmenopausale kvinder ved anvendelse af en modifikation af teknikken beskrevet tidligere i [25]. I alle tilfælde blev prøver taget fra normalt udseende æggestokkene overfladeepitelet, som blev bekræftet efter histopatologisk gennemgang. HOSE prøver blev opnået under en protokol, der blev godkendt af bestyrelsen Research Review Committee og intern bedømmelse på Fox Chase Cancer Center fra patienter, der gennemgår klinisk indiceret kirurgi (enten profylaktisk risikoreduktion salpingo-ooforektomi eller total abdominal hysterektomi med bilateral salpingo-oopherectomy) og der forudsat skriftligt informeret samtykke til væv ikke er nødvendige til diagnosticering, der skal bruges til forskning. Primære HOSE celler blev dyrket under anvendelse af medierne beskrevet i [26] ved 37 ° C i 5% CO

2.

Ovariecancer snap-frosne prøver svarende til trin III /IV epitelial ovariecancer (19 serøs, fire klare celle og 10 endometrioide) indeholdt 70% ondartet epitelial cellularitet som vurderet ved patolog gennemgang af en tilstødende farvede vævssnit. Kræft i æggestokkene prøver blev opnået fra Stillehavet æggestokkene Cancer Research Consortium Repository. Prøver blev indsamlet under en protokol godkendt af Fred Hutchinson Board Cancer Research Center Institutional Review og blev opnået fra patienter, som havde givet skriftligt informeret samtykke til væv ikke påkrævet for kliniske formål forvaltningsforanstaltninger, der skal bruges til forskning.

RNA-ekstraktion og miRNA bibliotek forberedelse

Normale primære HOSE kulturer (passage 4-7) blev lyseret i 600 pi Mirvana Lysis /Binding buffer (Ambion, Inc., Austin, TX). Tumor prøver (-100 mg hver) blev homogeniseret i en Qiagen Tissuelyser med 600 pi Mirvana Lysis /Binding buffer. Totalt RNA blev ekstraheret fra begge prøvetyper vha Mirvana ™ miRNA isolation kit (Ambion) ifølge producentens protokol. RNA fra snap-frosne tumorer (19 serøse, fire klare celle og 10 endometrioide tumorer, henholdsvis) blev samlet i henhold til histologisk undertype. MicroRNA kloning blev udført som tidligere beskrevet [27], (https://web.wi.mit.edu/bartel/pub/protocols/miRNACloningUpdate0705.pdf) med modifikationer på amplifikationsmetoderne skridt til at forberede prøverne for massivt parallelle sekventering af 454 Life Sciences.

Brugerdefineret bioinformatisk dataanalyse rørledning

Behandling og annotation af sekvenser baseret på identitet til kendte transskriberede RNA eller nye miRNA blev udført ved hjælp af en brugerdefineret bioinformatik rørledning beskrevet i detaljer i supplerende metoder S1 .

Måling af miRNA niveauer i RNA fra kliniske prøver ved hjælp TaqMan® QRT-PCR-analyser

Total RNA blev revers transkriberet og forberedt til QRT-PCR ved hjælp af TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit og miRNA -specifikke hårnåle-primere (Applied Biosystems, Inc.), som tidligere beskrevet [23]. Dataene blev analyseret med SDS Relativ Kvantificering Software version 2.2.2 (Applied Biosystems, Inc.), med den automatiske Ct indstilling for at tildele baseline og tærsklen for Ct beslutsomhed.

Resultater

Oversigt over små RNA-cDNA biblioteker og 454 sekventering

Små RNA cDNA biblioteker blev konstrueret ud fra RNA prøve puljer isoleret fra primære kulturer af histologisk normal primær SLANGE (

n

= 4) og epitelial ovariecancer eksemplarer af serøs ( OSC,

n

= 19), klar celle (OCC,

n

= 4) og endometrioide (OEC,

n

= 10) histologier. Tumorprøver blev udvalgt til at indeholde mindst 70% maligne epitelceller. Totalt RNA blev størrelsesfraktioneret ved hjælp af polyakrylamid-gelelektroforese og små RNA’er svarende molekylvægt til det modne miRNA befolkning (18-24 nt fraktion) blev gel udvindes og forarbejdes til revers transkription og PCR-amplifikation til at skabe cDNA-biblioteker (figur 1A). Massively parallel pyrosekventering ved hjælp af de 454 Life Sciences ‘platform genererede 80.501 normal SLANGE læser, 273.739 OSC læser, 292.942 OCC læser, og 91.528 OEC læser (figur 1B). Disse svarede til 10.544 HOSE, 26.849 OSC, 37.792 OCC og 13.134 OEC ikke-redundante sekvenser. Det større antal læser svarende til serøse og klare celleprøver skyldtes større dybde af sekventering (dvs. en større del af sekventering plade anvendte) snarere end til nogen særlige variationer i løbet biblioteket forberedelse.

A

. Små RNA’er blev isoleret fra normale primære HOSE kulturer og fra serøs (OSC), clear cell (OCC) og endometrioide (OEC) kræft i æggestokkene væv. Efter 5 ‘og 3’ linker ligering, blev RT-PCR udført for at fremskaffe fire uafhængige cDNA-biblioteker af små RNA’er, blev derefter anvendt som skabeloner til massivt parallelle pyrosekventering (454 sekventering).

B

. Beskrivelse af trinene i dataanalyse pipeline. Det indledende trin af dataanalysen var fjernelse af sekvenser svarende til 18 nt og 24 nt RNA markører, der var blevet tilsat til det totale RNA før gelelektroforese. Andel af samlede læser fra SLANGE, er OSC, OCC og OEC datasæt klassificeret i de udpegede kategorier og filtreret ud på hvert trin anført i tabellen til højre. Nederst i tabellen, antallet af “unikke sekvenser” repræsenterer ikke-redundante sekvenser afledt efter sammenklapning multiple læsninger af identisk sekvens. Nogle kanoniske sekvenser kort til flere locus i genomet. Ved afslutningen af ​​analysen, 199 sekvenser i alt 215 læser og kortlægning til 568 loci opfyldt vores kriterier for kanoniske hårnål-afledte sekvenser fra de kombinerede datasæt.

Sequence data blev behandlet ved hjælp af vores brugerdefinerede beregningsmæssige pipeline (figur 1B, S1 og tabel S1). De første trin i rørledningen identificerede sekvens matcher til databaser af tidligere kommenterede RNA’er (fx kendte miRNA, andre ikke-kodende RNA, messenger RNA’er) og til yderst repetitiv sekvens elementer. Resterende sekvenser blev behandlet for at identificere nye miRNA (figur S1, oplysninger om den beregningsmæssige rørledning findes i supplerende metoder S1). I de næste afsnit, vi diskutere i detaljer sekvenserne matcher kendte miRNA og identifikation af nye miRNA

MicroRNA profilering:. Tidligere kommenterede miRNA

Kampe til kendte miRNA i miRBase (frigive 12,0. ) [21], [22] udgjorde 68-73% af den læser, afhængigt af datasættet (figur 1B og tabel S1) og svarede til i alt 498 kendte miRNA (herunder stjerne former). Kloning hyppigheden af ​​individuelle miRNA, udtrykt som en brøkdel af det samlede læser opnået fra en given prøve, kan anvendes til at sammenligne relative ekspression af miRNA mellem prøverne [28] – [30]. Den globale oversigt over vores 454 sekventering datasæt er præsenteret i figur 2, som viser den relative ekspression af miRNA mellem normal primær SLANGE og kræft væv datasæt (

A

), samt mellem de tre epitelial æggestokkene undertyper (

B

). De mest differentielt udtrykte miRNA (dvs. ≥4 fold-ændring) er vist som røde prikker. Det er bemærkelsesværdigt, men ikke uventet, at den kræft i æggestokkene histologisk subtype miRNA-profiler var mere forskellig fra den normale SLANGE (

A

) end de var fra hinanden (

B

). Tabuleret 454 sekventering data for miRNA overflod i alle datasæt, samt miRNA navne og overflod nøgletal for alle parvise sammenligninger mellem prøvetyper, findes i deres helhed i tabel S2.

Datasæt sammenlignes parvis, plotte log af den del af samlede læser for en given miRNA i et givet datasæt mod den tilsvarende værdi i det andet datasæt. For hvert plot, er det kun miRNA, der blev sekventeret i begge datasæt plottet; miRNA, der blev sekventeret i ét af de to datasæt er ikke vist. Den øverste række (

A

), sammenligner kræft i æggestokkene datasæt (OSC, OCC og OEC) til normale primære HOSE kulturer; den nederste række (

B

), sammenligner æggestokkene tumor histologiske undertyper til hinanden. Røde prikker betyde miRNA, der havde en fold ændring ≥4.

overlapning differentielt udtrykte miRNA mellem undertyper visualiseres i Venn diagrammer i figur 3, som også inddrager miRNA udelukket fra figur 2 på grund af nul læser i enten normal slange eller ovariecancer prøver. Fra skæringspunktet mellem de tre grupper i Venn-diagram er det tydeligt, at i mange tilfælde miRNA differentielt udtrykt i ovariecancer i forhold til normal SLANGE det samme mønster af differentiel ekspression uanset histologisk subtype. Tabel S3 giver en komplet liste over navne på de enkelte miRNA og udtryk forholdet og

P

-værdier for sammenligningerne opsummeret i figur 3.

Venn diagrammer skildrer antal miRNA udtrykkes forskelligt i kræft i æggestokkene histologisk undertyper i forhold til normale primære humane ovarie overfladeepitelet (slange) kulturer. Kriterier for en miRNA som differentielt udtrykte blev defineret ved en fold-ændring ≥4 med en Fishers eksakte test

P

-værdi 5,0 × 10

-6 for miRNA, der havde påviselig udtryk i både slangen og æggestokkene cancer prøver, eller af en Fishers eksakte test

P

-værdi 5,0 × 10

-6 alene i tilfælde, hvor en fold-ændring var ubestemmelig grundet nul læser for en given miRNA i enten slangen eller kræft i æggestokkene sammenligning prøve. blev identificeret i alt 74 over-udtrykte miRNA (

Panel A

) og 49 under-udtrykte miRNA (

Panel B

) i kræft i æggestokkene med hensyn til normal slange. MikroRNA’er, der blev fundet at være konsekvent over-udtrykt eller konsekvent under-udtryk i alle tre æggestokkene kræft histologiske undertyper er angivet ved navn.

Vi sammenlignes direkte miRNA udtryk mellem æggestokkene kræft histologiske undertyper ved at udlede udtryk nøgletal for hver miRNA baseret på brøkdele overflod værdier. Signifikans blev vurderet ved anvendelse af Fishers eksakte test. Top ti miRNA differentielt udtrykt i hver af de parvise sammenligninger af ovariecancer histologiske undertyper er anført i tabel S4 (resultater for alle miRNA er tilvejebragt i deres helhed i tabel S2). Blandt de mest histologiske subtype-specifikke miRNA er miR-449a (serøs-specifik), miR-499-5p /miR-375 /miR196a /miR-196b /miR-182 (endometrioide-specifik) og miR-486-5p /miR -144 /miR-30a /miR-199a-5p (klar celle-specifik).

Validering af 454 sekventering miRNA ekspression resultater ved QRT-PCR.

Vi brugte kommercielt tilgængelige miRNA TaqMan QRT -PCR analyser som en uafhængig bekræftelse af miRNA differential udtryk identificeret ved 454 sekventering. MicroRNA TaqMan QRT-PCR-analyser blev udført for en prøve af 38 kendte miRNA, der blev udvalgt på grundlag af over- eller under-udtryk med hensyn til primær normal SLANGE, eller baseret på forskellen udtryk mellem forskellige undertyper af kræft i æggestokkene (beregnet baseret på 454 sekventering data). Taqman assays blev udført på delprøver af de samme RNA-pools anvendes til sekventering. Tredive-seks af de 38 differentielt udtrykte miRNA undersøgt af TaqMan QRT-PCR viste konsistente resultater med dem, der opnås ved 454 sekventering (figur 4 og 5, A, B, C). Af de otte miRNA identificeret ved 454 sekventering der skal overudtrykt i ovariecancer i forhold til den normale SLANGE gruppe (figur 4A), alle otte demonstreret over-ekspression i serøse og klare celle cancer undertyper når den måles ved anvendelse af TaqMan QRT-PCR, mens seks af de otte viste ensartede resultater i endometrioide kræft undertype (Mirs-126 *, – 142-3p, 195, 200a, 200b, 200c, 338-3p, 378 *). Ni miRNA var under-udtrykt i æggestokkræft forhold til normal slange (figur 4B), med alle undertyper udviser ensartede resultater målt ved TaqMan QRT-PCR. Der var seks miRNA, der var målbart (nul læser) i normale HOSE kulturer (figur 4C), men havde påviselig udtryk i OEC, OSC og /eller OCC i de 454 sekventering data, og de ligeledes viste forøget ekspression i æggestokkene histologiske subtype prøver versus normal primær SLANGE når undersøgt af TaqMan QRT-PCR (figur 4C).

graferne viser miRNA Taqman QRT-PCR resultater for et udsnit af miRNA identificeret ved 454 sekventering til at være over-udtrykt (

Panel a

) eller under-udtrykt (

Panel B

) i kræft i æggestokkene i forhold til normal slange. Relative ekspression værdier afledt 454 sekventering er vist på den venstre del af hver graf til sammenligning. Relative udtryk værdier af miRNA i endometrioide (OEC, sorte søjler), serøs (OSC, hvide søjler) og klar celle (OCC, grå søjler) kræftformer er afbildet. MikroRNA’er der ikke blev registreret i normale SLANGE med 454 sekventering, men blev opdaget i kræft i æggestokkene er præsenteret i

Panel C

, hvor miRNA bestilles ved faldende udtryk (som svarer til stigende cyklus tærskel, Ct) i normal slange. 454 sekventering tal er givet i form af en procentdel af den samlede læser inden for hver prøve. UD, ikke kan påvises ved miRNA TaqMan QRT-PCR.

Graferne viser Taqman QRT-PCR resultater for miRNA differentielt udtrykte mellem kræft i æggestokkene undertyper, med 454 sekventering afledte data præsenteret til sammenligning i venstre segment af hver graf. Relative udtryk værdier af miRNA specifikt overudtrykt i endometrioide (

Panel A

, OEC, sorte søjler), serøs (

Panel B

, OSC, hvide søjler) og klar celle (

Panel C

, OCC, er grå søjler) kræftformer afbildet. UD, ikke kan påvises ved miRNA TaqMan QRT-PCR.

Femten miRNA identificeret ved 454 sekventering skal udtrykkes differentielt tværs ovariecancer undertyper (figur 5A, B, C) viste lignende ekspressionsmønstre når kvantificeret ved qRT- PCR. Otte miRNA var specifikt overudtrykt i endometrioide ovariecancer (figur 5A), fire i serøs cancer (figur 5B), og tre i klar celle cancer (figur 5C) i forhold til de andre undertyper.

Analyse af sekventering data til at identificere nye hårnål-afledte små RNA.

Efter at have valideret 454 sekventeringsresultaterne svarende til differential udtryk for tidligere kommenterede miRNA, vi næste vendt til identifikation af nye miRNA-sekvenser. Efter filtrering ud matcher til tidligere kommenterede funktioner, herunder messenger RNA’er, tRNA’er og andre kendte ikke-kodende RNA, blev de resterende sekvenser justeret til referencen humane genom sekvens (NCBI Build 36,1) [31]. Sekvenser blev krævet for at matche den humane genomsekvens perfekt skal gennemføres yderligere for yderligere beregningsanalyse, med den eneste undtagelse fra denne bliver sekvenser, der demonstrerede tilsætning af 1-3 ikke-templatede nukleotider ved 3′-terminalen. I disse tilfælde vi trimmet ikke-template baser fra den oprindelige sekvens, og det blev derefter udført yderligere til analyse [32], [33].

Dataene behandlingstrin hidtil beskrevne gav 841 normal slange, 2.840 OSC , 11.224 OCC, og 1.764 OEC unikke sekvenser svarende til nye små RNA. Disse unikke sekvenser svarede til 1766 normal SLANGE, 5795 OSC, 19.464 OCC og 3301 OEC genomisk loci, der potentielt kan generere disse små RNA (figur 1B, tabel S1). Dataanalysen rørledning næste screenet disse genomiske loci (ud over 100 nukleotider af op- og ned-stream flankerende sekvens) for tilstedeværelsen af ​​en forudsagt sekundær hårnålestruktur ved at beregne fri energi, form sandsynlighed (som bestemt ved RNAshapes programmet [34 ]) og Randfold-beregnede [35]

P

-værdi af forudsagte sekundære strukturer. En detaljeret beskrivelse af hårnål folde kriterier findes i supplerende metoder S1 og i [23]. Dette resulterede i 224 normal SLANGE, 511 OSC, 500 OCC, og 247 OEC roman små RNA fundet at være potentielt stammer fra en forløber hårnål struktur.

Sekvenser passerer de ovennævnte filtreringskriterier fra de fire datasæt blev derefter kombineret og sorteret med hensyn til kromosomal koordinater i grupper, der deler 5 ‘ender. Fra hver af disse grupper, vi valgte en “canonical” sekvens repræsenterer denne genomisk locus. De kanoniske sekvenser blev valgt ud fra en fælles 5’-terminal, overflod, og sekvens længde som tidligere beskrevet [23] (yderligere oplysninger findes i supplerende metoder S1). Denne proces videreudviklet data til en kombineret liste af 199 unikke sekvenser (potentielt afledt fra 568 genomisk loci), at vi betegnes “hidtil ukendte hårnåle-afledte små RNA’er” hvorfra vi identificerede hidtil ukendte og kandidat miRNA.

Identifikation nye og kandidatlande miRNA.

for at afgøre, hvilke sekvenser at betegne som nye miRNA, vi screenede sæt af nye hårnål-afledte små RNA ved hjælp af de samme kriterier som dem, der anvendes i andre nylige miRNA opdagelse undersøgelser [23], [33], [36]:

jeg

. parring karakteristika hårnålen,

ii

. tilstedeværelsen af ​​multiple læser deler samme 5′-terminale ende,

iii

. manglende anmærkning om manglende miRNA biogenese,

iv

. delt frø region med en kendt dyr miRNA og

v

. tilstedeværelse af tilsvarende miRNA stjerneform læse (s). Vi overvejede herunder fylogenetiske bevarelse sekvens som et kriterium; Men, dette ikke væsentligt til vores analyse som ingen af ​​de nye hårnål-afledte miRNA blev bevaret over primater. Dette er ikke uventet, da de fleste evolutionært bevarede microRNA’er sandsynligvis allerede er blevet opdaget ved hjælp beregningsmæssige metoder fulgt op af rettet validering eksperimenter.

Brug ovennævnte kriterier, vi identificeret seks nye miRNA. Alle de seks opfyldte

i Y –

iii

og tre af de seks opfyldt kriterium

iv

og tre mødtes kriterium

v

(figur 6; yderligere detaljer er tilvejebragt i tabel S5). Desuden kortlægning af hidtil ukendte miRNA sekvenser til referencen humane genomsekvens afslørede, at tre af de seks hidtil ukendte miRNA er til stede i introner af andre gener (og kodet på den samme streng som de respektive værtsgener) (figur 6), ligesom mange tidligere kommenterede miRNA [37], [38]. To af vores nye miRNA er placeret i annoteret gentagelser, men har stærk nok dokumentation, at de blev betegnet som roman. Baggrunden for den forudsagte forløber struktur og rækkefølgen af ​​miRNA stjerne formularer svarende til nye miRNA er givet i figur 6.

Formodet sekundære strukturer for de seks nye miRNA opdaget i denne undersøgelse, er vist. Novel miRNA sekvenser er vist i rød og stjerne former for nye miRNA er vist i blå (hvis identificeret i vores sekventering data). Sekvenser er hidtil ukendte i forhold til miRBase frigive 12,0 [21], [22]. Identifikatorer i parentes henviser til de miRNA stjerne formularer, hvis dette blev identificeret i de 454 sekventering data. Tilsvarende oplysninger om de nye miRNA er givet i nedenstående tabel hårnålestrukturerne.

De resterende sekvenser omfattede 181 hårnål-afledte små RNA (svarende til 550 genomisk loci). Vi søgte at vælge fra denne liste de mest lovende sekvenser til at udpege som “kandidat miRNA”, der måtte blive bekræftet i fremtiden som

bona fide

miRNA som yderligere bevis akkumuleres. Kandidat miRNA skulle opfylde

I-III

og har nogle ekstra form for dokumentation (dvs. delt frø region med en kendt miRNA). Dette tillod os at forfine en endelig liste over 39 kandidat miRNA (potentielt stammer fra 50 genomisk loci) (tabel S5).

Diskussion

Arbejdet rapporteret her var motiveret af den hypotese, at hele repertoire af miRNA udtrykt i ovariecancer, herunder potentielt vævs- og cancer-specifikke miRNA, endnu ikke var blevet belyst. Den massivt parallelle sekventering tilgang gav os mulighed for udtømmende (dvs. identificere ikke kun kendt, men også roman miRNA), og den “digitale” arten af ​​de oplysninger tilladt en semi-kvantitativ vurdering af den relative ekspression niveauet for mange miRNA. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, opdagede vi seks hidtil ukendte og 39 kandidat miRNA, og afgrænset ekspressionsmønsteret af 498 tidligere kommenterede miRNA i normale primære HOSE kulturer og epitelial ovariecancer væv. Det er bemærkelsesværdigt, at af de fire offentliggjorte miRNA microarray studier af kræft i æggestokkene [17] – [20], selv de mest omfattende af de array-platforme var begrænset til 470 menneskelige miRNA og stjerne former [17], mens den aktuelle version af miRBase ( frigive 12,0) [21], [22] indeholder 969 menneskelige miRNA og stjerne former. Desuden 223 af de kendte miRNA vi identificeret og karakteriseret i vores sekventering datasæt var ikke repræsenteret på selv de mest omfattende microarray. Derfor resultaterne præsenteres her væsentligt udvide bredden af ​​viden om miRNA udtrykt i kræft i æggestokkene.

identifikation af nye miRNA i vores data er særlig bemærkelsesværdig. Eftersom der ikke er blevet detekteret disse hidtil ukendte miRNA i flere store miRNA sekventering studier af andre væv, vi spekulere, at de udtrykkes i en ovariecancer-specifik måde og kan være af særlig interesse som kræft biomarkører. Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at teste denne hypotese, samt at undersøge de biologiske roller disse nye miRNA i kræft i æggestokkene patogenese.

Samlet set de kendte og nye miRNA er identificeret i denne undersøgelse giver en pulje af kandidat miRNA markører for fremtidig analyse som blod-baserede markører til påvisning af kræft i æggestokkene. Differential udtryk mellem normale og maligne tilstande kan give en metode til prioritering af kandidater bevæger sig fremad. Vi forestiller os også, at miRNA, som vi fandt at være differentielt udtrykte mellem histologiske kræft undertyper kunne tjene et dobbelt formål som blod-baserede markører for både kræft påvisning og histologisk klassifikation.

En af de unikke funktioner i vores undersøgelse er anvendelsen af ​​primære kulturer af normal human ovarie overfladeepitelet som den normale sammenligningsgruppe. Selv om æggestokkene overfladeepitelet (sammen med nærliggende distale æggeleder epitel) anses oprindelsen af ​​epitelial ovariecancer [39] de fleste andre miRNA profilering undersøgelser har typisk brugt hele æggestok som den normale sammenligning. Dette er problematisk til identifikation miRNA, der udtrykkes differentielt i ovariecancer i forhold til normalt, fordi den enkelt celle tykt overflade epithelial lag omfatter langt under 1% af det cellulære indhold af hele æggestok. Udførelse sammenligninger af kræft i æggestokkene væv til en passende normal kontrol er en udfordrende problem i æggestokkene kræftforskning. Vores tilgang, selv om det undgår problemerne forbundet med at bruge hele æggestok som en normal prøve, har den begrænsning, at vi ikke ved, om og hvilke ændringer i microRNA ekspression kan tilskrives dyrkningsbetingelser anvendes til primær SLANGE cellekultur. Fremtidige undersøgelser inkorporerer parallelle analyser af primære cellekulturer afledt af kræft i æggestokkene væv kan behandle dette spørgsmål.

Selv om brugen af ​​forskellige typer af “normale” æggestokkene prøver gør sammenligning af vores data med andre undersøgelser vanskelige i de fleste tilfælde,