PLoS ONE: EGFR tyrosinkinasehæmmere Aktiver Autophagy som cytobeskyttende respons i Human Lung Cancer Cells

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor tyrosin kinase hæmmere gefitinib og erlotinib er ofte blevet brugt i patienter med ikke-småcellet lungekræft. Desværre er effekten af ​​EGFR-TKI’er begrænset på grund af naturlig og erhvervet resistens. Som en hidtil ukendt cytobeskyttende mekanisme for tumorcelle at overleve under ugunstige betingelser har autofagi blevet foreslået at spille en rolle i lægemiddelresistens af tumorceller. Hvorvidt autophagy kan aktiveres ved gefitinib eller erlotinib og derved forringe følsomhed målrettet terapi til lungecancerceller fortsat ukendt. Her, vi først rapportere, at gefitinib eller erlotinib kan inducere et højt autofagi, som blev ledsaget af inhibering af PI3K /Akt /mTOR-signalvejen. Desuden cytotoksicitet induceret af gefitinib eller erlotinib blev stærkt forbedret efter autophagy hæmning af den farmakologiske inhibitor chloroquin (CQ) og siRNA’er rettet mod ATG5 og ATG7, de vigtigste komponenter til dannelsen af ​​autophagosome. Interessant, kan EGFR-TKI’er stadig fremkalde celle autofagi selv efter EGFR blev reduceret med EGFR specifikke siRNA’er. Afslutningsvis fandt vi, at autofagi kan aktiveres ved EGFR-TKI’er i lungecancerceller og hæmning af autofagi augmented den vækstinhiberende virkning af EGFR-TKI’er. Autophagy hæmning repræsenterer således en lovende tilgang til at forbedre effektiviteten af ​​EGFR-TKI’er i behandlingen af ​​patienter med fremskreden ikke-småcellet lungekræft

Henvisning:. Han W, Pan H, Chen Y, Sun J, Wang Y, Li J, et al. (2011) EGFR tyrosinkinasehæmmere Aktiver Autophagy som cytobeskyttende respons i Human Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (6): e18691. doi: 10,1371 /journal.pone.0018691

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: 11. november 2010; Accepteret: 15. marts 2011; Udgivet: Juni 2, 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud nummer 30.901.740, www.nsfc.gov.cn), China National Undervisningsministeriet Grant (tilskud nummer 20090101120124, www.moe.edu.cn), Zhejiang Naturvidenskab Foundation Grant ( tildele nummer Y2090166, www.zjnsf.net:81), og forskningsprojekter i Zhejiang Education Department (tilskud nummer Y200805751, www.zjedu.gov.cn) til W. Han, og grundforskning Midler til de centraleuropæiske universiteter til H. Jin. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden [1]. Kemoterapi er stadig ikke effektive nok til patienter med fremskreden ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) og svarprocenten er kun 20% til 35% med en median overlevelse på 10 til 12 måneder [2], [3]. Ved at målrette molekyler kritiske for udvikling af kræft, målrettet terapi alene eller i kombination med andre behandlinger for nylig blev anerkendt som en lovende strategi for at erobre kræftformer, herunder NSCLC [4].

Som en af ​​receptortyrosinkinaser (RTK) vigtigt for cancercellevækst, proliferation, invasion og metastase, epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) blev hyppigt dereguleret i NSCLCs [5]. EGFR over-ekspression blev observeret i ca. 62% af planocellulære og adenocarcinom undertyper [6]. EGF kan fremkalde aktivering af tre signalveje vigtige for initiering og progression af kræft, Ras /MAPK, PI3K /Akt, og JAK /Stats [7]. Som et resultat, EGFR blev en af ​​de molekyler til udvikling af målrettede terapi til NSCLC. Ved at inhibere tyrosinkinaseaktivitet af EGFR, to tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) navngivet gefitinib (Iressa, AstraZeneca) og erlotinib (Tarceva, Genentech) er blevet udviklet til behandling af NSCLC. Gefitinib og erlotinib kan inhibere tumorvækst både in vitro og in vivo. Klinisk både EGFR-TKI’er viste god tolerabilitet og antitumoraktivitet i NSCLC patienter med sygdom forløber efter første linje platinbaseret kemoterapi [5], [8], [9]. Imidlertid er effekten af ​​EGFR-TKI’er faldt betydeligt ved naturlig og erhvervet resistens. Mekanismen er stadig stort set ukendt, selv er blevet foreslået EGFR-mutationer at være en af ​​mekanismer til at påvirke følsomheden af ​​EGFR til disse inhibitorer [10], [11].

Macroautophagy (herefter kaldet autophagy) er en selv-proteolyse proces i eukaryote celler, der resulterer i nedbrydning af intracellulære materiale inden macroautophagosome eller lysosomer [12], [13]. Under cellulære stress betingelser såsom næringsstof-mangel miljø, er autophagy hurtigt aktiveres for at give en alternativ kilde til energi og dermed gøre det muligt for cellerne at overleve [14]. Autophagy blev opreguleret under den senere fase af tumorvækst fordi induktion af autofagi tillader tumorceller at overleve i mikromiljøer mangel på næringsstoffer og oxygen [15]. Gennem fremme overlevelsen af ​​tumorceller under ugunstige forhold, blev autofagi foreslået som en alternativ mekanisme for resistens. For eksempel, autofagi bidrager til modstanden af ​​brystkræftceller til bortezomib behandling [16]. Hæmning af autophagy kunne sensibilisere tumorceller til mange cytotoksiske lægemidler eller vende modstanden til kemoterapeutiske lægemidler, der repræsenterer en lovende strategi for at forbedre effektiviteten af ​​kræftbehandlingen [17].

signalveje nedstrøms for EGFR og andre RTK såsom PI3K /Akt pathway er involveret i reguleringen af ​​autophagy, hvilket indikerer en potentiel sammenhæng mellem RTK hæmning og autofagi. En anden TKI navngivet som imatinib faktisk kan aktivere autofagi i respektive celletyper [18], [19]. Desuden blokade af macroautophagosome formationen forøger effektiviteten af ​​anti-HER2 monoklonalt antistof trastuzumab (TZB) [20]. Men om autofagi er forbundet med gefitinib og erlotinib behandling i lungecancerceller fortsat ukendt. I den aktuelle undersøgelse, vi først vise, at gefitinib eller erlotinib aktiveret autofagi i lungekræft celler og blokering af autofagi forbedret effekten af ​​gefitinib eller erlotinib.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

De anvendte kemikalier var gefitinib (J K kemiske Ltd., G304000), erlotinib (J K kemiske Ltd., E625000) og chloroquin (CQ) (J K kemiske Ltd., 147.236). De primære antistoffer var antistoffer mod mikrotubuli-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3) (Cell Signaling Technology, # 2775), ATG5 (Cell Signaling Technology, # 2630), ATG7 (Cell Signaling Technology, # 2631), phospho-mTOR ( S2448) (Cell Signaling Technology, # 2971), samlet mTOR (Cell Signaling Technology, # 2983), phospho-p70S6k (T389) (Cell Signaling Technology, # 9234), phospho-AKT (S473) (Cell Signaling Technology, # 4051 ), samlede AKT (Cell Signaling Technology, # 9272), GAPDH (Cell Signaling Technology, # 3683). De sekundære antistoffer var HRP-konjugeret anti-kanin (Santa Cruz Biotechnology, sc-2357) og anti-muse-IgG (Santa Cruz Biotechnology, sc-2371).

Cellekulturer Salg

lungecancer cellelinjer (A549, NCI-H1299, NCI-H292, NCI-H1650 og SK-MES-1) blev købt fra celle bank (Chinese Academy of Sciences). Monolagskultur af cancerceller blev opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10% (vol /vol) FBS og antibiotika. Stamopløsning af gefitinib eller erlotinib blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, D4540), og fortyndet med medium før anvendelse. Endelig koncentration af DMSO var. 0,1%

cytotoksicitet assay

cytotoksicitet af kemikalier mod lungekræft-cellelinjer blev bestemt ved MTT-analysen. Celler blev podet i plader med 96 brønde (dyrket natten for adhærente celler) og behandlet med kemikalier med forskellige koncentrationer. Efter 48 timers inkubation blev 20 pi MTT (5 mg /ml) tilsat til hver brønd i 4-timers inkubation. Derefter blev supernatanten fjernet, og 150 pi DMSO blev tilsat til hver brønd for at opløse de blå-violette krystaller af formazan. Absorbansen blev derefter målt ved hjælp af en model ELX800 Micro Plate Reader (Bio-Tek Instruments, Inc.) ved 570 nm.

Immunfluorescerende konfokal laser mikroskopi For LC3 og lysosom samhusning

lysosomer var først mærket ved inkubering med Lyso Tracker (Invitrogen, L7528), et lysosom reporterfarvestof, i 90 minutter ved 37 ° C. Celler blev opsamlet, fikseret og permeabiliseret med 1% CHAPS puffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1,0% CHAPS) ved stuetemperatur i 10 minutter, inkuberet med anti-LC3 i 2 timer ved stuetemperatur og vasket med PBS, inkuberet for andre 45 min med FITC-konjugeret gede anti-kanin IgG (Beyotime, A0562). Derefter blev cellekerner farvet med DAPI (Sigma, D9564). Prøverne blev undersøgt under et Zeiss LSM 710 konfokalmikroskop systemet (Carl Zeiss, Tyskland). Billede blev behandlet med ZEN LE software.

Elektronmikroskopi

Behandlede celler blev vasket og fikseret i 30 minutter i 2,5% glutaraldehyd. Prøverne blev behandlet med 1,5% osmiumtetroxid, dehydreret med acetone og indlejret i Durcupan harpiks. Tynde snit blev poststained med blycitrat og undersøgt i Tecnai 10 elektronmikroskop (Philips, Holland) ved 60 kV.

Western blot-analyse

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [21] . Proteinet blev påført på en korrekte koncentration af SDS-polyacrylamidgel, overført til en PVDF-membran, og derefter påvises ved de korrekte primære og sekundære antistoffer før visualisering med et kemiluminescenskittet. Visualisering blev udført med Image Quant LAS-4000 (Fujifilm, Tokyo, Japan) ved hjælp af billede Multi-Gauge Software (Fujifilm, Tokyo, Japan).

RNA-interferens

Celler blev transficeret med enten uspecifik siRNA (Qiagen, 1.027.280), ATG5 siRNA (Qiagen, SI02655310), ATG7 siRNA (Qiagen, SI02655373) eller EGFR siRNA (Cell Signaling Technology, # 6481) (siRNA slutkoncentration, 100 nmol /l) via LipofectAMINE RNAi max (Invitrogen, 13778150) ifølge producentens anvisninger. Celler blev derefter inkuberet i 48 timer før Western blot eller MTT-assayet.

Real-time PCR

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol fremgangsmåde og cDNA blev syntetiseret fra mRNA med PrimeScipt MMLV RT reagens Kit (Takara, # 6110). Real-time kvantitativ PCR-reaktion blev udført under anvendelse SYBR green som fluorescerende reporter (Bio-Rad, 170-8882). QPCR forsøg blev udført på en ABI-7500 og GAPDH blev serveret som en endogen kontrol. Hver prøve blev normaliseret på grundlag af sin GAPDH indhold. I alt 40 cykler (5-s denaturering ved 95 ° C, 34-s annealingt /forlængelse ved 55 ° C) blev kørt for hver primer. Primer sekvenser var som følger: for ATG5, TTC AAT CAG GTT TGG TGG AGG C (forstand) og ATG GCA GTG GAG GAA AGC AGA G (antisense); for ATG7, ATG FTT GGG CAT CCA GTG AAC TTC (forstand) og CAT CAT TGC AGA AGT AGC AGC CA (antisense); for GAPDH, GGA GTC AAC GGA TTT GGT (forstand) og GTG ATG GGA TTT CCA TTG AT (antisense).

statistiske analyser

Med mindre andet er angivet, data blev udtrykt som middel ± SD og analyseres ved Students t-test.

Resultater

EGFR-TKI’er inducerer autophagy i lunge kræftceller

for at evaluere aktiveringen af ​​autophagy af EGFR-TKI’er, konvertering af LC3-i i LC3-II før og efter TKI’er behandling blev bestemt ved western blotting-analyse. I A549 og NCI-H1299-celler, kan både gefitinib og erlotinib inducere skift af LC3-I til LC3-II i dosis og tid afhængig måde, hvilket indikerer, at autophagy kan blive aktiveret af både TKI’er (figur 1A og B). For yderligere at bekræfte det, blev opdeling af LC3 i celler før og efter TKI’er behandling overvåget ved indirekte immunfluorescensfarvning. Faktisk TKI’er inducerede co-lokalisering af LC3-II med lysosomer, hvilket viser dannelsen af ​​autolysosome (figur 1C og figur S1). Ultrastrukturelle analyse ved elektronmikroskopi bekræftede yderligere, at mange store autophagic vakuoler med typisk to lag membran indeholdende organel rester præsenteret i gefitinib-behandlede A549-celler snarere end ubehandlede celler (figur 2A, B og C). Lignende resultater blev opnået med erlotinib (figur 2D og E).

A og B, lungekræft celler blev inkuberet med varierende koncentrationer af gefitinib eller erlotinib i 24 timer eller inkuberet med 25 pM gefitinib eller erlotinib for passende intervaller. Kontakten af ​​LC3-I til LC3-II blev påvist ved immunoblotting. C, A549 eller NCI-H1299-celler blev behandlet med DMSO eller 25 uM gefitinib i 24 timer. Celler blev mærket med fluorescens og afbildet ved konfokal mikroskop. Rød, lyso tracker-mærkede lysosomer; Green, FITC-mærket LC3; Blå, DAPI-mærket kerne. Den overlay blev vist i højre kolonne. De orange-farvede celler indikerede LC3 co-placeret med lysosomer

A549 celler blev behandlet med 25 pM gefitinib i 24 timer (A, DMSO b., Gefitinb, lavt strømforbrug, C, Gefitinb, høj magt). D (lav opløsning) og E (høj opløsning) blev AGS celler behandlet med 25 pM erlotinib i 24 timer (D, erlotinib, lavt strømforbrug, E, erlotinib, høj effekt). Talrige autophagical vakuoler med typisk to lag membran indeholder organel rester blev fremhævet med pile. Bar = 1 um.

Vi næste undersøgt virkningerne af EGFR-TKI’er på ekspressionen af ​​ATG5 og ATG7, to kritiske komponenter i at regulere dannelsen af ​​autophagosomes [22]. Både EGFR-TKI’er øget ATG5 og ATG7 på mRNA eller proteinniveauer (figur 3), hvilket bekræfter induktionen af ​​autophagy ved EGFR-TKI’er.

A blev A549-celler behandlet med 25 pM gefitinib i 6 timer og mRNA niveau af ATG5 /7 blev målt ved Real time RT-PCR som beskrevet i M M. RQ, relative mængde. sort, gefitinib-behandlede celler; grå, kontrolceller. B, Immunoblotting for Atg5 eller Atg7 hjælp lysater fra A549 behandlet med forskellige koncentrationer af gefitinib eller erlotinib i 24 timer. Data blev udtrykt som middelværdi ± SD, og ​​analyseret ved Students t-test. ** P. 0,01

Hæmning af Akt /mTOR /p70S6K signalvejen ved EGFR-TKI’er

Tidligere undersøgelser har vist, at PI3K /Akt /mTOR /p70S6K akse spiller en vigtig rolle ved inhibering af autofagi [23], [24], vi derfor undersøge effekten af ​​gefitinib og erlotinib på denne autofagi-undertrykkende signalvej. Faktisk phosphorylering af AKT, mTOR og p70S6K i både A549 og H1299-celler blev signifikant reduceret med gefitinib og erlotinib i en tidsafhængig måde (Figur 4A og B). Imidlertid blev opdaget nogen ændringer af PTEN udtryk efter TKI’er behandling (figur 4C og D).

fosforylering af mTOR, Akt og p70S6k i A549 (A) eller NCI-H1299 (B) celler behandlet med gefitinib eller erlotinib blev bestemt ved western blotting. Ekspressionen af ​​PTEN i A549 (C) eller NCI-H1299 (D) celler behandlet med forskellige koncentrationer af gefitinib eller erlotinib blev påvist ved western blotting.

Blokering af autofagi forbedre EGFR-TKI’er induceret celledød

Mange undersøgelser har vist, at autophagy kan tjene som en beskyttende respons forhindrer tumorceller fra terapi-induceret celledød [17], [20], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. I lungekræft cellelinje NCI-H292 og NCI-H1650, der er relativt følsomme over for gefitinib og erlotinib, blev der ikke autofagi opdaget efter gefitinib eller erlotinib behandling (figur 5A). Imidlertid autophagy blev påvist i EGFR-TKI’er behandlede cancerceller, der er relativt resistent over for EGFR-TKI’er, såsom A549, NCI-H1299 og SK-MES-1-celler (figur 1 og 5a). Disse data viste, at autophagy kan forringe følsomheden af ​​kræftceller til EGFR-TKI’er. For at teste dette forbrug, sammenlignede vi vækstinhiberende virkning af gefitinib eller erlotinib på cancerceller før og efter farmakologisk og genetisk inhibering af autofagi. Som vist i figur 5B, CQ, som kan forringe funktionen af ​​lysosomer og hæmmer autophagy på sent tidspunkt væsentligt forøget væksthæmning induceret af gefitinib eller erlotinib i A549, NCI-H1299 og SK-MES-1, der er relativt resistent over for EGFR-TKI’er. Den kunne imidlertid ikke inhibere lungekræft cellevækst ved sin egen. (Figur 5B). Tilsvarende blev væksthæmning induceret af gefitinib eller erlotinib i A549 celler forbedret efter autofagi blev hæmmet af knockdown af ATG5 eller ATG7 (figur 5C og D), to essentielle komponenter til dannelsen af ​​autophagosome, bekræfter, at autofagi beskyttet tumorceller fra EGFR- TKI’er celledød.

A, Autophagy blev fremkaldt af EGFR-TKI’er i resistente, men ikke sensitive lunge kræftceller. LC3 ekspression i lungecancerceller inkuberet med 25 pM gefitinib eller erlotinib i 24 timer blev analyseret ved immunblotting. B, blev Levedygtigheden af ​​cancerceller behandlet med 12,5 uM gefitinib eller erlotinib i 48 timer med eller uden 5 pM CQ målt ved MTT-assayet. C, Ekspressionen af ​​ATG5 og ATG7 i A549-celler transient transficeret med negativ kontrol siRNA, Atg7 eller Atg5 siRNA blev bestemt ved immunblotting. D, Celler forbigående transficerede med negativ kontrol siRNA, Atg7 eller Atg5 siRNA blev behandlet med 12,5 uM gefitinib eller 25 uM erlotinib i 48 timer. Virkningen af ​​EGFR-TKI’er på cancerceller med eller uden ATG5 eller ATG7 knockdown blev analyseret ved MTT-assayet. NC, kontrol siRNA. Data blev udtrykt som middelværdi ± SD, og ​​analyseret ved Students t-test. * P 0,05, ** P. 0,01

EGFR-TKI’er fremkalde autofagi i cancerceller med EGFR-knockdown

Dernæst vil vi gerne vide, hvilken rolle af EGFR i den gefitinib eller erlotinib induceret autofagi. To specifikke siRNA’er blev anvendt til at Knockdown EGFR. SiRNA 1 kunne reducere EGFR spænder mens siRNA 2, som havde moderat effekt på EGFR (figur 6A og B). Interessant autophagy aktiveres af enten gefitinib eller erlotinib blev ikke inhiberet men augmented efter EGFR blev dramatisk reduceret med siRNA 1 (figur 6C og D). I modsætning hertil siRNA 2 havde næppe nogen indflydelse på autofagi induceret af både EGFR-TKI’er (figur 6C og D).

EGFR i A549 (A) eller H1299 (B) celler transficeret med kontrol siRNA, EGFR siRNA1 eller siRNA2 blev bestemt ved western blotting. LC3 udtryk i EGFR-TKI’er behandlede A549 (C) eller H1299 (D) celler med eller uden EGFR knockdown blev bestemt ved western blotting.

Diskussion

Autophagy blev udpeget som programmeret celle død type II, hvorimod apoptose er kendt som programmeret celledød type I. Men for nylig autophagy fandtes at fremme cellulær overlevelse under ugunstige forhold såsom berøvelse af aminosyrer eller ATP, afslører en ny rolle autofagi i udvikling af cancer.

Autophagy er morfologisk karakteriseret ved fremkomsten af ​​”dobbelt-membran” vakuoler (autophagosomes) i cytoplasmaet. Desuden pattedyr homolog af gærprotein Apg8p, (også kaldet LC3), viser sig at være en specifik biokemisk markør for autofagi. Nysyntetiserede LC3 betegnet LC3-1 er jævnt fordelt i hele cytoplasmaet. Efter induktion af autophagy, er nogle LC3-I omdannes til LC3-II, som er tæt bundet til de autophagosomal membraner danner ringformede strukturer i cytosolen. Vi bekræftede biokemisk og morfologisk at autofagi kan aktiveres ved gefitinib eller erlotinib, to godt brugt EGFR-TKI’er, i to uafhængige lungekræft cellelinier. Interessant, en meget nyligt papir rapporteret, at autofagi kan induceres af anti-EGFR-antistoffer [31]. Både EGFR-antistoffer og EGFR-TKI’er er almindeligt anvendt til behandling af cancer patient ved inhibering af EGFR, afslører en ny forbindelse mellem EGFR inhibering og autophagy aktivering.

Autophagy kan aktiveres som det cellulære respons på cancerterapi. En række behandlinger mod cancer, herunder DNA-beskadigende kemoterapeutiske midler, endokrine terapier (fx tamoxifen) og strålebehandling har vist sig at inducere autofagi in vitro og in vivo [32], [33], [34]. For nylig blev det konstateret, at autofagi kan aktiveres og beskyttet tumorceller fra målrettede behandlinger, såsom imatinibmesylat i Philadelphiakromosom-positive celler [18], trastuzumab i brystcancer [20], Src familie kinaseinhibitorer i prostatacancer [35 ], Proteasominhibitorerne i prostatacancer [16]. Konsekvent, fandt vi, at autofagi kan aktiveres ved gefitinib og erlotinib i lungekræft og fremme cellulær overlevelse i målet behandling med EGFR-TKI’er. Blokering af autophagy af farmakologiske eller genetiske metoder langt mere væksthæmmende effekt af gefitinib eller erlotinib. Inhibering af autofagi har potentiale til at forbedre den kliniske effektivitet af EGFR-TKI’er til kræftbehandling.

Som en sensor af aminosyrer og ATP, mTOR regulerer autofagi negativt. Faktisk fandt vi, at både TKI’er kan inhibere aktiveringen af ​​mTOR samt dens opstrøms regulator, PI3K /Akt. En anden signalvej vigtigt at autofagi er Raf /MAPK-vejen [23]. Vi undlod imidlertid at finde en klar sammenhæng mellem Raf /MAPK-vejen og autofagi i cellelinier vi brugte. Dette skyldes sandsynligvis onkogene mutationer overvejende sket i Ras /MAPK veje. For eksempel blev k-ras-genet vides at være muteret i A549-celler. Klinisk, patienter med K-RAS mutationer ikke respons på TKI’er behandling. Det ville være interessant at vide, om patienter med K-RAS mutationer kunne drage fordel af en kombination af TKI’er og hæmmere af autophagy.

Interessant, vores resultater viste, at gefitinib eller erlotinib induceret autophagy kan være EGFR uafhængige. Som vist i figur 6, kan både EGFR-TKI’er inducerer autophagy selv EGFR blev stærkt reduceret. Selvom gefitinib og erlotinib blev udviklet som de specifikke inhibitorer er målrettet mod kinasedomænet af EGFR, men de seneste resultater tiltalt at disse to inhibitorer kan have andre mål, såsom ikke-receptortyrosinkinaser, der også virker opstrøms for PI3K /Akt /mTOR pathway [36]. Konsekvent, i stor skala kliniske forsøg bekræftede, at måling af EGFR ved immunhistokemi ikke var nyttigt for optagning patienter skal nydt godt gefitinibs terapi. Bestemt, vi stadig kunne ikke helt udelukke relevansen af ​​EGFR i gefitinib eller erlotinib induceret autophagy da vis mængde af EGFR stadig blev opdaget efter knockdown af EGFR siRNAs. Faktisk EGFR-TKI’er aktiveret autofagi var langt mere forstærket af siRNA 1, som viste bedre knockdown effektivitet end siRNA 2 (figur 6B). Derfor har vi brug for yderligere undersøgelser for at afklare, hvilken rolle af EGFR i gefitinib eller erlotinib-induceret autofagi. Alligevel EGFR-TKI’er og EGFR siRNA havde en synergistisk virkning på induktionen af ​​autophagy, som kunne inhiberes specifikt at øge den kliniske effekt af målrettet terapi.

Sammenfattende styrket vores arbejde forestillingen om, at cancerceller kan overleve i et stressende miljø, efter hæmning af kritiske onkogene veje, ved at inducere autofagi. Disse tumorceller er klargøres til at genoptage spredning, når lægemiddelkoncentrationen falder efter tilbagetrækning lægemiddel på grund af toksicitet eller mutationer udvikler til at give resistens. Således i kombination af terapeutiske strategier, der har til formål at hæmme autofagi hos patienter behandlet med konventionel kemoterapi eller roman målrettet behandling med EGFR-TKI’er repræsenterer en lovende tilgang med højere effektivitet for kræftpatienter.

Støtte Information

Figur S1 .

Kvantificering af autophagy i lungekræft celler behandlet med gefitinib. Procentdelen af ​​celler med appelsin signaler blev beregnet ved at tælle celler i 3-4 felter under mikroskop. Dataene blev repræsenteret som middelværdi ± SD

doi:. 10,1371 /journal.pone.0018691.s001

(TIF)