PLoS ONE: Prognostisk Betydningen af ​​B-celler og pSTAT3 i patienter med æggestokkene Cancer

Abstrakt

Baggrund

Flere tidligere undersøgelser har identificeret en stærk forbindelse mellem T-celle infiltration og klinisk resultat i livmoderhalskræft. Rollen af ​​B-celler forbliver imidlertid kontroversiel.

Metoder

Niogfyrre paraffinindlejrede oment prøvemateriale fra patienter med høj kvalitet epitelial ovariecancer blev vurderet. Immunohistokemiske analyser blev udført for at karakterisere ekspressionen af ​​CD19

+ B-celler og pSTAT3 så højt ( 50% positivt farvning celler [kvikskranker]) eller lav ( 50% kvikskranker). Kaplan-Meier-metoden med log-rank testen blev anvendt til at bestemme sammenhængen mellem clinicopathologic parametre og samlet overlevelse (OS). En multi-variate Cox proportionel risiko regressions analyse, herunder natur debulking (primær

vs

sekundær), histologi, tumor kvalitet, modtagelse af kemoterapi, blev B-celle infiltration og pSTAT3 udtryk udført.

Resultater

Median OS var 160,6 måneder hos patienter med lavt B-celle-ekspression

vs

47,3 måneder hos dem med høj B-celle-ekspression (P = 0,0015). Tilsvarende blev median OS forbedret hos patienter med lav pSTAT3 udtryk (160,6

vs

47,9 måneder, p = 0,02). I en multivariat model til at forudsige overlevelse, blev bibeholdt kun graden af ​​B-celle-infiltration og kliniske stadium. pSTAT3 udtryk ikke ind den endelige model, muligvis skyldes en høj positiv korrelation med B-celle infiltration (r = 0,82, P 0,0001).

Konklusioner

Øget B-celle infiltration og pSTAT3 udtryk i oment væv er forbundet med dårligere overlevelse

Henvisning:. Yang C, Lee H, Jove V, Deng J, Zhang W, Liu X, et al. (2013) Prognostisk Betydningen af ​​B-celler og pSTAT3 i patienter med kræft i æggestokkene. PLoS ONE 8 (1): e54029. doi: 10,1371 /journal.pone.0054029

Redaktør: Goli Samimi, Kinghorn Cancer Center, Garvan Institute of Medical Research, Australien

Modtaget: Oktober 1, 2012; Accepteret: December 7, 2012; Udgivet: 10. januar, 2013 |

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dr. Pal indsats understøttes af National Institutes of Health K12 2K12CA001727-16A1. Dr. Yu indsats understøttes af NIH U54 CA163117, NIH R01 CA122976-01, NIH P50 CA107399 og Markel fonden. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En amassing litteratur understøtter rollen af ​​immunceller i kræft i æggestokkene spredning. I 2003 Zhang

et al

rapporterede en skelsættende undersøgelse, hvor væv fra 186 patienter blev vurderet for graden af ​​CD3

+ tumor-infiltrerende T-celler. [1] Tilstedeværelsen af ​​disse celler viste sig at uafhængigt forudsige forsinket gentagelse og forlænget overlevelse, med en stor størrelse af virkning. Flere andre undersøgelser har givet den samme konklusion, sammenfattet for nylig i en meta-analyse af Hwang

et al.

[2] Med en kumulativ oplevelse af 1.815 patienter på tværs 10 studier blev det påvist, at en manglende tumor- infiltrerende lymfocytter (tils) var associeret med dårligere overlevelse (hazard ratio [HR] 2,24; 95% CI 1,71-2,91). I disse studier blev TIL’er karakteriseret ved ekspression af CD3 og /eller CD8. [1], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] De observerede korrelationer mellem T-celle infiltration og kliniske resultater er en biologisk plausible -. specifikt CD8

+ T-celler kan forårsage en direkte cytolytisk antitumorvirkningen

med en større forståelse for T-celle biologi, er det blevet klart, at visse delmængder af T- celler kan faktisk have en procancer effekt. Konkret Barnett

et al

har vurderet omfanget af regulatoriske T-celle (Treg) infiltration i en serie af 232 primære serøse kræft i æggestokkene prøver. [12] I denne serie, omfanget af Treg infiltration var forbundet med højere cancer kvalitet og avancerede kliniske stadium. Der bekræfter disse data, vurderinger perifert blod fra patienter med kræft i æggestokkene foreslå og stigende antal cirkulerende tregs ledsager sygdomsprogression. [13]

rolle B-celler i kræft i æggestokkene er mere udfordrende at få øje på. [14] I tidlige studier med murine modeller af B-celle-mangel, blev det foreslået, at B-celler faktisk kan hæmme antitumorvirkningen af ​​tumorinfiltrerende T-celler. [15], [16] Som en potentiel mekanisme, B-celler har vist sig at inhibere priming virkning af CD4

+ T-celler på CD8

+ T-celler. [17] På trods af disse observationer, kliniske beviser peger på en sammenhæng mellem CD20

+ tumor infiltrerende B-celler og et positivt resultat i fastsættelsen af ​​kræft i æggestokkene. Konkret Milne

et al

undersøgte væv microarray (TMA) data fra 199 patienter med høj kvalitet serøs epitelial ovariekræft (EOC). [18] I denne rapport, tilstedeværelsen af ​​intraepithelial CD20 + celler var forbundet med en forbedring af sygdomsspecifikke overlevelse (DSS). Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at denne rapport var ledsaget af andre paradoksale observationer – eksempelvis tilstedeværelsen af ​​foxp3

+ regulatoriske T-celler (tregs) blev også forbundet med en positiv DSS. Dette fund modsiger overvægt af beviser for, at tregs kan have en pro-cancer effekt.

Det er klart, at forholdet mellem B-celler og kliniske outcome berettiger yderligere vurdering. I den nuværende manuskript, vi vurdere omfanget af B-celle infiltration i oment væv stammer fra patienter med kræft i æggestokkene, og forsøge at korrelere omfanget af infiltration med samlet overlevelse (OS). Vi har tidligere vist, at phosphoryleret signal transducer og aktivator for transkription-3 (pSTAT3) spiller en kritisk rolle i cancer-relaterede inflammation og tumor progression gennem rekruttering af myeloide celler og tregs. [19], [20] For nylig har vi demonstreret en kritisk rolle af STAT3 til at fremme B-celle-medieret tumor angiogenese i musemodeller (upublicerede data). Til dette formål har vi nærmere sammenslutningen af ​​mellem pSTAT3 og B-celle infiltration.

Metoder

Etik Statement

Kliniske og patologiske data vurderes i denne undersøgelse blev anonymiserede, og forskning i kliniske prøver blev godkendt af City of Hope IRB (COH IRB 10072).

Undersøgelse Befolkning

The City of Hope Biospecimen Repository (COHBR) huser væv stammer fra alle kirurgiske procedurer udføres på institutionen. Gennem en IRB-godkendt protokol, vi opnåede paraffinindlejrede sektioner af oment væv fra patienter, som besad en diagnose af høj kvalitet EOC (dvs. grad 2 eller 3) og havde primær eller sekundær debulking udføres på institutionen. Prøver blev afledt fra debulking procedurer udføres mellem januar 2000 og december 2009, og tilstrækkelig prøve skulle være til rådighed til at generere i alt 12 ufarvede slides (4 um tykkelse). For patienter, der fik primær debulking, bruge eller nonuse af tidligere (dvs. neoadjuverende) kemoterapi blev karakteriseret. For patienter, der fik sekundær debulking, brug af kemoterapi inkluderet adjuverende kemoterapi gengives efter primær debulking. Overlevelse var præget fra diagnosetidspunktet med kræft i æggestokkene (vigtigere, ikke fra tidspunktet for primær eller sekundær debulking kirurgi).

væv Analyser

Paraffin væv slides blev de-paraffinized i xylen, re-hydreret gennem graduerede alkoholer og efterfølgende autoklaveret i Antigen afmaskering Solution (Vector Laboratories). For IF farvning blev vævssnit inkuberet med primært antistof i en fortynding på 1:50. Objektglassene blev derefter inkuberet i fluorofor-konjugeret sekundært antistof. Billeder blev taget ved konfokal mikroskopi hjælp CLSM 510 Meta konfokal mikroskop (Zeiss). For IHC farvning blev vævssnit behandlet med 1% H

2O

2 i methanol i 10 minutter ved stuetemperatur, og derefter inkuberet i en time i PBS indeholdende 10% gedeserum (Sigma). Snit blev inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistof. Efter inkubering med biotinylerede sekundære antistoffer blev ABC /DAB påvisningsfremgangsmåde udført ifølge producentens instruktioner (Vector Laboratories). Vævssnit blev efterfølgende modfarvet med hæmatoxylin i 30 sekunder. Ekspressionsniveauet af primært antistof i tumorvæv blev visualiseret ved et Nikon ECLIPSE TE2000-U mikroskop (4 × objektiv forstørrelse) og afbildet under anvendelse af SPOT software. De primære anvendte antistoffer er anti-pY705-STAT3 (Cell Signaling) og anti-CD19, en markør for humane B-celler (ABD Serotec). I alle tilfælde blev ti mikroskopiske felter med mindst 1.000 celler talt pr hvert objektglas til scoring. Scoring resultat fra IHC-farvede vævssnit blev yderligere bekræftet af IF farvning i en fortløbende sektion.

Statistisk analyse

En semi-kvantitativ skala blev anvendt til at vurdere omfanget af CD19 og pSTAT3 farvning. Konkret blev disse prøver med 50% af celler med positiv farvning (eller højere) betragtes som “høj”, og disse prøver med mindre blev betragtet som “lav”. Disse scorer blev tildelt af uafhængigt af to forskere (C.Y. og H.L.), og afvigende scoringer blev derefter voldgiftsbeslutning til opnåelse af en ensartet opgave. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at sammenligne overlevelse i kohorter defineret ved (1) primær eller sekundær debulking, (2) B-celle-farvning (høj

vs

lav), (3) pSTAT3 farvning (høj

vs

lav), og en kombination af disse parametre. En multi-variate Cox proportionel risiko regressions analyse blev udført for at undersøge, om B-celler eller pSTAT3 farvning giver ekstra forudsigelseskraft i overlevelse ud over natur debulking (primær

vs

sekundær), histologi (serøs, mucinous eller endometrioide

vs

klar-celle eller udifferentierede), tumor bedømmelse (2

vs

3), eller tidligere kemoterapi (ja

vs

nej). Alle statistiske analyser udført ved hjælp af R-software (findes på https://www.r-project.org/).

Resultater

Patient Karakteristik

Fra COHBR, blev identificeret i alt 110 patologiske prøver fremkommet fra debulking operationer fra kræft i æggestokkene. Af disse, repræsenterede i alt 29 prøver histologier ikke er relevante for den aktuelle undersøgelse (dvs. lave maligne potentielle tumorer, carcinosarcomas eller kimcelletumorer). Af de resterende 81 sager, 17 prøver repræsenterede klasse 1 tumorer, og 15 prøver havde ikke tilstrækkelig oment væv til de foreslåede analyser, gav i alt 49 enheder, for den aktuelle undersøgelse. Den mediane alder af patienterne, der er repræsenteret med den aktuelle kohorte var 61 år (range, 41-87), og størstedelen af ​​patienterne blev karakteriseret som havende serøs, endometroid eller mucinøs histologi (47 49, eller 96%). Atten patienter (37%) havde grad 2 sygdom, mens 31 patienter (63%) havde grad 3 sygdom. De fleste prøver blev afledt fra primære debulking operationer (30 af 49, eller 61%), og resten fra sekundære debulking. De fleste patienter, som havde gennemgået primær debulking havde modtaget nogen forudgående systemisk behandling (3%), mens hovedparten af ​​patienter, som havde undergået sekundær debulking havde modtaget kemoterapi (89%). Tabel 1 viser de kliniske og patologiske egenskaber underopdeles omfanget af B-celle-ekspression. Ingen signifikante forskelle blev set blandt grupper med undtagelse af omfanget af pSTAT3 farvning – specifikt overvægten af ​​patienter med for højt B-celle-farvning viste også høj pSTAT3 farvning, mens dem med lav B-celle-farvning viste en lav pSTAT3 farvning (P 0,0001). Eksempler på lav og høj B-celle infiltration og pSTAT3 ekspression er vist i figur 1A. Desuden blev B-celler og pSTAT3-positive celler fundet i det samme område af patientens oment væv (figur 1B).

(A) immunfluorescensfarvning efterfulgt af konfokal mikroskopi viser eksempler på repræsentative prøver fra en patient med lav B-celle-infiltration og lav pSTAT3 ekspression (øverst til venstre og højre), og en separat patient med høj B-celleinfiltration og høj pSTAT3 ekspression (nederst til venstre og højre); målestokke 20 uM. (B) IHC billeder, der viser B-celler og pSTAT3-positive celler i det samme område af oment væv; skala barer, 200 um

B-celle /pSTAT3 Expression og Klinisk Resultat:. univariate Analyse

I betragtning af den blandet population af patienter undersøgt i den aktuelle undersøgelse (dvs. patienter, der gennemgår primær og sekundær debulking procedurer), var OS den primære endpoint undersøgt. Median OS var 160,6 måneder i disse patienter med lavt B-celle udtryk i forhold til 47,3 måneder hos dem med høj B-celle-ekspression (P = 0,0015; Figur 2A). Tilsvarende blev median OS forbedret hos patienter med lav pSTAT3 udtryk i forhold til høj pSTAT3 udtryk (160,6

vs

47,9 måneder, p = 0,02; Figur 2B). Selv om der var en forbedret median OS hos patienter med stadium I /II-sygdom

vs

stadie III /IV sygdom (P = 0,001), art debulking kirurgi (primær

vs

sekundære; P = 0,56) og tumor bedømmelse (dvs. 2

vs

3;. P = 0,16) ikke syntes at have en indvirkning på klinisk resultat (tabel 2)

Kaplan-Meier-kurve, der illustrerer varighed af overlevelse hos patienter med ovariecancer baseret på (A) grad af B-celle-infiltration (P = 0,0015), (B) grad af pSTAT3 ekspression (P = 0,02), (C) histologisk stadie systemet og (D) debulking status .

multivariate Analysis

Ved hjælp af en multivariat Cox proportionel risiko regressions analyse inkorporerer indledende klinisk fase (I-II

vs

III-IV), natur af debulking (primær

vs

sekundær), histologi (serøs, mucinous eller endometrioide

vs

klar-celle eller udifferentierede), tumor bedømmelse (2

vs

3), kemoterapi (ja

vs

nej), B-celle-ekspression (høj

vs

lav) og pSTAT3 ekspression (høj

vs

lav), kun graden af ​​B- celleinfiltration (hazard ratio, HR, 2,03, 95% CI 0,75-5,50) og fase (HR, 5,16, 95% CI 1,36-19,60), blev tilbageholdt i multivariate model. Lyset af denne konstatering, vi udforskede sammenhængen mellem scenen og B-celle infiltration og fandt en beskeden korrelation (r = 0,38, P 0,001). pSTAT3 gik ikke ind den endelige model, som muligvis kan være på grund af sin høje positiv korrelation med B-celle-ekspression (r = 0,82, P 0,0001). (tabel 2)

Diskussion

flere unikke observationer komme ud af den aktuelle undersøgelse. En større grad af B-celle-infiltration i oment væv synes at korrelere med dårligere overlevelse. B-celle-infiltration er forbundet stærkt med pSTAT3 ekspression i oment væv, og faktisk steg pSTAT3 ekspression i oment væv er også forbundet med dårligere overlevelse. På multivariat analyse, B-celle infiltration ind i sidste multivariate model sammen med den kliniske fase, og en stærk association blev bemærket mellem pSTAT3 udtryk og B-celle infiltration.

Som allerede bemærket, virkningen af ​​T-celle infiltration er relativt veldokumenteret i fastsættelsen af ​​kræft i æggestokkene, nu sammenfattet i en meta-analytisk datasæt. [2] Disse korrelative studier har spurned bestræbelser på at anvende adoptiv overførsel af T-celler, både alene og i kombination med cytotoksisk behandling. [21], [22], [23] Virkningerne af relevante T-celle-undergrupper, såsom procancer virkninger af tregs, er også blevet skelnes. Rollen af ​​B-celler forbliver mere kontroversiel – selvom det traditionelt menes at have en antagonistisk virkning på cytotoksisk T-celle responser, førnævnte datasæt fra Milne

et al

antyder, at tumorinfiltrerende B-celler kan være en positiv prognostisk markør. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at vores undersøgelse udnyttede en særskilt B-cellemarkør (CD19), og også vurderet en mere heterogen gruppe af patienter (patienter, som fik sekundær debulking og tidligere systemisk behandling). Med hensyn til sidstnævnte, fandt vi ingen signifikant forskel i resultatet baseret på disse kliniske træk, og overraskende, har fordelingen af ​​biomarkører ikke variere i disse undergrupper. Vores undersøgelse vurderede også enkelte afsnit stammer fra paraffinindlejrede prøver; i modsætning til andre studier, der evaluerer TMAs, denne tilgang tilladt for vurdering af flere felter (10 per prøve) for at give et mere præcist biomarkør vurdering.

Den tætte sammenhæng mellem B-celler og pSTAT3 i denne undersøgelse understøtter prækliniske data vi har tidligere rapporteret afgrænse rolle pSTAT3 i immun celle rekruttering. [24] Vores prækliniske data tyder også, at ophævelsen af ​​STAT3 aktivitet kan have en antitumor effekt, i overensstemmelse med vores kliniske observation, at højere pSTAT3 kan være forbundet med dårligere kliniske resultat. [25], [26] I kombination, hvis disse kliniske iagttagelser bekræftes i større serier, kan dette tjene som begrundelse for at forfølge terapeutiske forsøg med STAT3-antagonister til at målrette B-celler i kræft i æggestokkene. Som et eksempel har vi udviklet et CpG-konjugeret siRNA rettet mod STAT3 i myeloide celler og B-celler. [26] Mens levering af siRNA-terapier har været en enorm udfordring, ovariecancer kan være et ideelt sygdom enhed at nærme med disse midler. Intraperitoneal kemoterapi har en veletableret overlevelse fordel i fase III-studier, og intraperitoneal levering af RNA-baserede lægemidler kan omgå visse stabilitets- og opløselighed spørgsmål. [27] Ud over direkte antagonisering STAT3, en tilgang målretning opstrøms dele såsom JAK2 kunne overvejes. Adskillige JAK2 inhibitorer er blevet udviklet til behandling af myeloproliferative sygdomme forsynet afvigelser i dette protein; det er blevet påvist, at en af ​​disse små molekyler, AZD1480, har en antitumorvirkning i MDAH2774 ovariecancer cellelinie. [28], [29].

Flere begrænsninger bør anerkendes. For det første vores prøve størrelse var relativt lille i modsætning til andre offentliggjorte rapporter. [1], [30] For det andet, vi ikke vurdere T-celle populationer (dvs. CD8

+ T-celler og Foxp3

+ regulatoriske T-celler) for at bekræfte tidligere rapporteret fund. [30] For det tredje, er det fortsat uklart, hvilken effekt bestemte behandling variable (dvs. forudgående kemoterapi) kan have haft på den observerede B-celle eller pSTAT3 distribution – det garanterer yderligere undersøgelse i en større serie. Endelig vores undersøgelse udelukkende fokuserer på vævsbaseret markører. Selvom konventionelle serum markører, såsom CA-125 er faldet i unåde efter nylige potentielle vurderinger, er der et væld af nye serum assays i horisonten. [31] For eksempel autoantistof profilering undersøgelser har identificeret underskrifter, der afviger mellem æggestokkene kræftpatienter og raske kontrolpersoner. [32] Det vil være spændt på, om en kombination af de biomarkører, vi heri har foreslået med andre kan give overlegen personlige prognostiske værktøjer. På trods af disse begrænsninger, vores data tilføjer en meget begrænset mængde litteratur relateret til virkningen af ​​B-celle infiltration på det kliniske resultat i fremskreden kræft i æggestokkene, og giver en plausibel mekanisme for at dette kan ske (nemlig B-celle rekruttering via STAT3-afhængige veje). Det er klart, vil være behov for større indsats for at validere bemærkningerne heri. Med en skygge støbt i traditionelle biomarkører såsom CA-125, immune markører holder enorme løfte i kræft i æggestokkene. [33] Givet en spirende pipeline af JAK /STAT pathway hæmmere, vores data forbinder pSTAT3 udtryk og B-celle infiltration til kliniske resultat kan i sidste ende støtte en ny terapeutisk avenue for denne sygdom.